临床生物化学检验试剂盒的性能评价第三节一临床生物化学检验试剂盒的性能评价临床生化检验试剂盒是用化学和生物化学反应的原理二用于完成一个特定体外诊断检验,而包装在一起的一组组分三试剂盒组分可包括抗体二酶二缓冲液二稀释液二校准物二控制物或其他物品和材料,用于体外测定人体体液中的化学和生物化学组分来获取临床诊断信息三它是体外诊断试剂(i nv i t r od i a g n o s i s r e g e n g t s)中的一大类,根据我国国家食品药品监督管理局(S F D A)的‘医疗器械分类目录“,归为临床检验分析仪器类,按医疗器械管理三体外诊断试剂按风险级别进行分类分级管理,Ⅲ二Ⅱ二Ⅰ类产品分别由国家二省级二市级药品监管部门审批,临床生化检验试剂盒多属Ⅱ类产品三一二临床生物化学试剂盒的质量标准2006年制订了‘临床化学体外诊断试剂(盒)通用技术要求“,规定了临床化学体外诊断试剂(盒)质量检验的通用技术要求,包括术语和定义二分类和命名二要求二试验方法二标签和使用说明二包装二运输和贮存三适用于医学实验室进行临床化学项目定量检验所使用的体外诊断试剂(盒)三该标准是目前临床化学体外诊断试剂(盒)注册审批的标准三二二临床生物化学检验试剂盒的分类根据其物理性状,可以分为干试剂和液体(湿)试剂,干试剂根据制备工艺不同分为干粉二冻干二片剂二干试剂条等三干试剂的优点是运输方便二保存期长,其缺点是组分均一性较差,瓶间差较大,分装过程中的称量误差和复溶时加入水量的误差,都导致瓶间的不均一性,水质的优劣对试剂的稳定性和测定结果的可靠性有相当大的影响三除干试剂条应用于干式生化仪外,其他干试剂已经逐渐被淘汰三液体试剂因组分高度均一二瓶间差小二测定重复性好二不需复溶直接使用等优点,是目前使用最广泛的剂型三液体试剂主要分为单液体型和双液体型三(一)单液体型单液体型特别适用于半自动生化分析仪和小型自动生化分析仪三半自动生化分析仪和小型自动生化分析仪因缺试剂瓶位置或试剂瓶位置少,而适用单试剂三从技术角度讲,要保证足够的试剂盒稳定性,在所有剂型中,单液体型试剂盒对稳定技术的要求最高,尤其是酶法分析试剂盒,将酶二辅酶二色原等组合为单一试剂,稳定技术更高三但抗干扰能力无法与双液体试剂比拟三(二)双试剂液体型大多数中二大型生化分析仪有两根试剂针,使用双试剂不会影响分析效率三有时为了稳定性的需要,试剂盒内含有三个试剂,临用前将某两个试剂混合,再按双试剂使用三因具备优点多,是目前主流剂型三1.稳定性能好一与单一液体试剂相比,可以分拆为两个试剂,可采用不同的缓冲体系(离子强度和p H都不同),混合后为最适p H;其稳定技术容易得多,比如,可以将酶和辅酶与色原分开,也可把辅助酶与指示酶分开三2.可消除样品自身空白一可设计成第一试剂与样品不发生化学和生物化学反应,两者混合后读取第一个吸光度,在两点平衡法中可扣除该吸光度,相当于做了一个空白对照三所以,原来传统用单一试剂的方法,如双缩脲法测定总蛋白二溴甲酚绿法测定清蛋白等,都特地分拆成两个试剂,第一试剂的作用等同于蒸馏水,第二试剂经过浓缩,混合后各组分含量同传统的单一试剂,起到消除样品空白的作用三3.提高抗干扰能力一①消除内源性和外源性干扰:首先让试剂Ⅰ与样品中的干扰物质反应,一定时间后再用试剂Ⅱ启动真正的测试反应,最大程度地消除内源性和外源性干扰三如消除甘油对T G二丙酮酸对A L T/A S T二N H4+对尿素的干扰等三②消除杂酶的干扰:如G L D H对待测脱氢酶的干扰三③消除T r i n d e r s反应负干扰,在试剂Ⅰ中的氧化剂与样品中胆红素二维生素C 氧化酶与样品中的维生素C进行预反应三4.预反应一试剂Ⅰ与样品预反应,有足够的时间让辅基或辅酶对酶进行复活,免疫抑制法中使抗体对某一抗原的抑制更彻底三(三)其他剂型多项同测组合试剂是指两个相似的项目在同一反应杯中进行先后测定,其最大的优点可以减少试剂仓位三如直接胆红素和总胆红素二胆固醇和T G的组合试剂等三浓缩试剂则在测定之前,自动生化分析仪先稀释,优点是在工作量繁重时可以减少添加试剂的次数三三、临床生物化学试剂盒的性能指标及评价临床生化试剂盒的性能指标包含了所有方法学的性能指标,并增加了稳定性能的指标三一般来讲,采用化学反应原理的试剂盒稳定性较好,而酶二辅酶二底物二抗体等多不稳定,增加了对试剂盒稳定性的难度三根据‘临床化学体外诊断试剂(盒)通用技术要求“,参考‘临床化学体外诊断试剂(盒)产品技术审评规范“(2011版),试剂盒的性能指标及评价方法如下:(一)试剂空白吸光度用蒸馏水做空白,用指定的空白液加入试剂作为样品测试,是判定试剂质量的一个有效指标三对以N A D H做底物的负反应试剂盒,因N A D H在中性缓冲体系不够稳定,规定其空白吸光度需>1.0,目的是保证足够量的底物N A D H,保证足够的线性范围,避免底物耗尽三以色素原底物的试剂盒,其不稳定因素主要来自于底物三因色素原底物容易自身水解,因此也需要规定其空白吸光度不能超出一定范围,以防止底物不足三对以T r i n d e r s反应原理的试剂盒,防止发色基团的氧化,规定空白吸光度需<0.05;因较高的空白吸光度会导致线性范围变窄,重复性变差三(二)试剂空白吸光度变化速率对于速率法试剂盒,用指定的空白液加入试剂作为样品测试时,测定试剂空白吸光度变化(ΔA/m i n),用来检查试剂在工作状态下的稳定性三但事实上,试剂空白吸光度变化速率无法反映试剂盒的稳定性,因为试剂盒的稳定期一般要求一年以上三若每分钟有明显的吸光度变化,按0.001/m i n计算,37?孵育一天,其总的吸光度变化达到1.44,说明试剂早已失效三试剂空白吸光度变化速率主要反映干扰程度和仪器的稳定性,如反应杯的洁净程度及分析仪的交叉污染严重程度三但若某个试剂中有杂酶,若两个试剂混合后会造成试剂空白吸光度变化速率过高,所以也是评价试剂盒质量性能的指标三(三)分析灵敏度用吸光度差值(ΔA)或吸光度变化(ΔA/m i n)来表示单位浓度的被测物反应所引起的信号变化,其含义类似摩尔吸收系数三分析灵敏度不是越高越好,以适合待测物检测范围为原则三如胆固醇二葡萄糖二尿酸二肌酐的测定方法都用T r i n d e r s反应,血液中这些物质的含量相差数倍甚至几十倍,应使用不同灵敏度的发色剂三对酶法分析试剂盒而言,酶试剂不稳定,可导致灵敏度下降;对免疫比浊法而言,抗体效价下降也会造成灵敏度下降三分析灵敏度一般用于批间比较,较能反映制造商的配方二原料的一致性三(四)线性范围取高浓度样品和低浓度样品按不同比例混合成5个浓度做线性试验三试剂(盒)的线性范围越宽,临床复测几率越小,但与样品/试剂比例成反比三国家对线性范围的要求较低,但要求线性相关系数r应?0.990,同时对线性偏差也作出规定三(五)重复性用质量控制血清3?3(3个批号,每个批号取3瓶)测试批间差,较能反映制造商的配方二原料的一致性三干粉或冻干试剂还需测定批内瓶间差,测定同一批号的试剂20瓶,用变异系数(C V)来表示三(六)准确度1.相对偏差一直接用试剂盒测定参考物质(平行3次),评价测定均值与靶值的偏离程度三如无参考物质,可用由参考方法定值的高二中二低三个浓度的人混合血清,用试剂盒平行测定3次,计算均值与定值的相对偏差三2.回收试验一测定试剂盒若有标准品,也可用回收率衡量比例系统误差三3.比对试验一既无参考物质二参考血清,也无标准品,也可用比对试验来验证准确度三参照E P9A2的方法,用不少于40个在检测浓度范围内不同浓度的人血清样品,以公认的分析系统作为比对方法,用线性回归方法计算两组结果的相关系数三(七)稳定性1.效期稳定性一取已到效期的试剂盒按以上评价方法对试剂盒性能指标进行评价三可作为审批的依据,但对该批次的试剂盒的稳定性意义不大三2.热稳定性试验一对同批次试剂盒稳定性目前没有很好的评价方法三生化试剂盒一般置2~8?保存,为了快速有效地评价试剂盒的稳定性,可以用加速试验来估计三即将试剂盒置于37?孵育箱,每天按以上评价方法对试剂盒性能指标进行评价三根据蛋白质在不同温度下稳定性换算公式估算,37?孵育一天相当于2~8?一个月三但因为试剂盒成分复杂,各种酶的耐热性有很大差别,所以只能对该批次试剂盒的稳定性做大概估计三3.开瓶稳定性一也称在仓稳定性,是指试剂盒置分析仪试剂仓在使用过程中的稳定性三试剂曝露于空气会影响缓冲体系的p H等,仪器的交叉污染也会影响使用中的稳定性三在临床实际工作中,更关注开瓶稳定性三评价方法是每天记录空白二校准和质控品的吸光度,以及绘制质控图,按质控规则判断三(八)临床试验完成以上试剂盒的性能指标评价后,还需按照‘体外诊断试剂注册管理办法“(试行)及‘体外诊断试剂临床研究技术指导原则“进行临床试验三1.临床试验文本一要有临床机构伦理委员会确认的文件;有两家省级医疗卫生单位完成临床研究的研究报告三2.临床样本比较试验一新诊断试剂(盒)应与该诊断疾病的金标准针对临床样本进行盲法同步比较; 已有同种批准上市的试剂(盒)应与已批准上市产品针对临床样本进行比对试验三3.临床样本的要求一综合不同地区人种二流行病学背景二病原微生物的特性等因素选择研究单位,症状典型和非典型的,一般临床研究的总样本数至少为200例,新诊断试剂(盒)1000例三四、临床生物化学试剂盒的发展趋势我国使用临床生化试剂盒的历史只有20多年,分析仪的普及和试剂盒的使用是临床生化实验室的一大革命,基本满足了临床生化检测数量日益增长的需求,更重要的是检验结果的质量得到了大幅度的提升三因生化试剂盒相对于免疫试剂盒技术要求低二研发周期短二研发成本低,已基本实现了国产化,国产试剂盒的质量也与先进国家相媲美三但原材料(酶二抗体)和核心技术都还依赖进口,自主研发能力较为薄弱三有必要对临床生化试剂盒的发展趋势进行简单总结三(一)适应生化分析仪的要求生化分析仪为了追求分析效率,操作步骤简单,分立式分析仪无法完成离心二煮沸步骤,反应时间短(多不超过10m i n)三因此,针对分析仪的这些特点,对常规方法进行了修改三原来采用无蛋白血滤液的测定方法,通过使用表面活性剂二减少样品/试剂比例二提高灵敏度等措施来防止蛋白质的干扰,以达到不需样品预处理的目的三但是,有些简化步骤或改变条件是以牺牲方法学性能为代价,如:①缩短反应时间三如为了缩短反应时间,双缩脲法测定总蛋白不得不修改试剂配方;葡萄糖氧化酶测定血糖的试剂盒添加了变旋酶三②统一测定温度在37?三为此,I F C C修改了酶活性参考方法的温度三③简化步骤三高(低)密度脂蛋白胆固醇的均相法不经离心直接测定,但原理不够严密二特异性不够高;又如对改良J G法作了进一步修改,虽不需要终止反应,但导致直接胆红素的结果不够准确三④样品/试剂比例受限制三B C G法测定清蛋白,原推荐方法中,样品/试剂比=1?500,而多数分析仪最大样品/试剂比例不足1?250,导致线性范围变窄三(二)酶法分析的应用酶的高度特异性使酶法分析可以不需样品预处理而直接测定待测物三正因为酶法分析的操作简便二条件温和二安全,才使生化试剂盒产业蓬勃发展三酶法分析是试剂盒发展的方向,研发者千方百计使用酶法来取代化学法三在不断涌现商品酶的同时,生化检验试剂盒随之日新月异,试剂酶的生产与试剂盒的研发已经形成良性循环的局面三面对越来越多的商品酶,应从纯度二价格二催化效率二稳定性二耐热性等方面综合考虑,遵循实用二可靠的原则,选择使用三(三)免疫比浊法的应用近20年来,医学检验的飞速发展离不开杂交瘤抗体生产技术三吸收光度法受灵敏度的制约,很难检测微量物质三免疫比浊法很好地结合了免疫技术,使很多微量蛋白质等的生化测定成为可能三但浊度法的检测波长不是特异光吸收,受到样品自身空白和其他浊度的干扰,抗体的效价二与抗原(游离或复合物)反应性的差异二校准品的选择二校准曲线的拟合二质量控制二抗原过剩等问题都还需要标准化三(四)高灵敏度试剂盒的应用酶法和免疫比浊法是临床生化试剂盒研发的两大方向三围绕这两种原理,通过提高灵敏度,开发了一系列新的生化项目三1.胶乳凝集免疫比浊一高敏C反应蛋白二肌钙蛋白二肌红蛋白二胱抑素C二糖化血红蛋白二脂蛋白(a)等借助于胶乳凝集免疫比浊技术,提高了灵敏度,应用于自动生化分析仪三可以预见,目前只能用散射比浊或化学发光检测的特定蛋白二激素二肿瘤标志物二病原抗原等,不久也会有胶乳凝集免疫比浊法试剂盒推出和应用三2.酶循环法一像胆汁酸二氨二同型半胱氨酸等在体内含量甚微,甚至只有不足10μm o l/L,传统的生化方法无法测定三利用酶循环法的原理使不可能成为可能,酶循环法的应用将会越来越广泛三3.发色剂的合成一自然界氧化酶种类繁多,但因酚类色原灵敏度和稳定性的限制,T r i n d e r s 反应的应用目前只停留在10-1~102m m o l/L水平,像乙醇目前还无法直接测定三可以预见,随着新色原的发现,将会有更多的试剂盒使用T r i n d e r s反应的原理三4.人工合成底物一人工合成底物是医学检验与化工二生物合成等领域结合的产物,因方法简单,特别适合于水解酶类和转移酶类的测定,人工合成底物不限制在色素原底物,将会有更多的选择空间三(五)提高方法特异性的措施试剂盒的临床应用除了方便,还应有准确度和稳定性保证三试剂盒的准确度主要取决于方法学的特异性,但通过合理的配方二合理的组合可以提高方法的特异性:①液体双试剂能有效的消除干扰三②指示通路的合理选择,如T G的酶法不下5种,除考虑酶的来源和价格因素外,提高方法特异性是首先应考虑的问题;酶活性测定的正二逆反应的选择,测底物还是测产物的选择,都应首先考虑方法的特异性三③抑制剂的使用,试剂中的杂酶二样品中的干扰酶可以采用加入抑制剂(高浓度的杂酶产物),干扰物可以通过引进一个副反应来解决三(六)提高试剂盒稳定性的措施生化检验的推荐方法和参考方法,其主要成分的配方都是公开的三生化试剂盒研发的关键是稳定技术三近几年酶稳定剂的发展使酶法试剂盒的质量得到了很大的提高三试剂盒的稳定性主要取决于酶或辅酶的稳定和底物的稳定三酶的本质是蛋白质,要使酶稳定首先能稳定蛋白质,一个适合的缓冲体系至关重要三再从活性中心出发,设法保护催化基团和结合基团三稳定的措施包括使用防腐剂(抑制细菌生长)二蛋白稳定剂(防止水化二聚合)二蛋白酶抑制剂(防止蛋白酶的水解)二巯基酶保护剂(防止巯基氧化),以及隔绝空气(对氧化酶)等;稳定底物的措施有含水量的控制和缓冲体系的选择等三(沈财成)。
