【CN109481448A】雷公藤红素在诱导癌细胞自噬上的应用及其与替莫唑胺的联合用药【专利】

一种三萜--雷公藤红素--通过下调细胞存活蛋白和上调死亡受体而加强TRAIL-介导的细胞凋亡BokyungSung,ByoungduckPark,VivekR.Yadav,andBharatB.Aggarwal来自传统中药的雷公藤红素是三萜类成分，它能否调节TRAIL的抗癌作用，目前正在临床试验中。

通过测定质膜完整性，磷脂酰丝氨酸的暴露程度，线粒体的活性，caspase - 8、caspase - 9和caspase – 3的活性，发现雷公藤红素诱发TRAIL-介导的人类乳腺癌细胞的凋亡，并将TRAIL耐药细胞转换成TRAIL 敏感的细胞。

研究其作用机理时，我们发现，该三萜下调细胞存活蛋白表达包括cFLIP、IAP- 1、BCL -2、Bcl - xL、生存素、XIAP ，上调Bax蛋白表达。

此外，我们发现，雷公藤红素同时诱导细胞表面TRAIL受体DR4和DR5表达。

在各种癌细胞，包括乳腺癌，肺癌，结肠癌，前列腺癌，食道癌，胰腺癌细胞，髓细胞和白血病细胞中这些受体增加得很明显。

死亡受体的基因沉默能消除雷公藤红素对TRAIL-介导细胞凋亡作用的影响。

因为CHOP基因沉默消除雷公藤红素对DR5诱导表达作用，同时加强TRAIL-介导的细胞凋亡作用，故三萜类化合物诱导死亡受体是不依赖p53，而是通过诱导CAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）。

我们发现，雷公藤红素还会诱发活性氧（ROS）的产生，而活性氧的消失会抑制雷公藤红素对CHOP和DR5诱导表达，因而（雷公藤）增强细胞对TRAIL的敏感性。

总的来说，我们的结果表明，雷公藤红素可能通过下调细胞存活蛋白和通过ROS介导的CHOP通路上调死亡受体，而上调TRAIL的细胞凋亡作用。

放疗，手术，化疗被认为是癌症治疗的一线方法。

放疗和化疗通过几种不同的机制触发肿瘤细胞死亡。

然而，这些传统的治疗方法，是有毒的，不是有效的，同时肿瘤逐渐产生耐药性。

近年来，有了更多的选择性，肿瘤源性分子的肿瘤生物学驱动因子和靶点的研究，已成为在癌症研究方面的热点。

雷公藤甲素诱导肿瘤细胞凋亡和自噬的分子机制研究雷公藤甲素(Triptolide)是从中药植物雷公藤中提取的一种环氧二萜内酯类化合物,具有广谱的抗肿瘤活性,能抑制多种肿瘤细胞的增殖,并诱导细胞凋亡和自噬。

但是,雷公藤甲素诱导肿瘤细胞凋亡和自噬的分子机制目前仍不清楚。

因此,本研究以人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)阳性喉癌细胞系和多个前列腺癌细胞系为模型,利用分子生物学、细胞生物学及小鼠移植瘤实验等研究手段,重点探索了雷公藤甲素诱导HPV阳性肿瘤细胞凋亡和诱导多种肿瘤细胞自噬的分子机制,以及自噬对雷公藤甲素抗肿瘤活性的影响,主要获得以下研究结果:1.以HPV18阳性喉癌细胞HEp-2为模型,检测了雷公藤甲素对HPV阳性肿瘤的作用。

实验结果表明,雷公藤甲素能有效抑制HEp-2细胞的增殖、迁移及克隆形成能力。

此外,雷公藤甲素还能同时激活死亡受体途径及线粒体途径两条凋亡信号通路诱导HEp-2细胞凋亡。

2.证实雷公藤甲素能增强放射线对HEp-2细胞的杀伤,具有放疗增敏作用。

3.研究了雷公藤甲素诱导HEp-2细胞凋亡的分子机制。

结果表明雷公藤甲素诱导的HEp-2细胞凋亡依赖于抑癌蛋白p53的激活。

雷公藤甲素能通过两条途径激活p53通路:一方面,雷公藤甲素能引起细胞DNA损伤,促进p53 mRNA的转录;另一方面,雷公藤甲素能够抑制泛素E3连接酶E6/E6AP的表达,进而阻断p53的泛素化降解。

p53的表达上调及活化会促进受其调控的下游凋亡相关基因的表达,从而介导细胞凋亡。

4.研究了雷公藤甲素对肿瘤细胞自噬的影响。

结果表明,雷公藤甲素能引起喉癌细胞HEp-2及前列腺癌细胞PC-3、LNCaP和C4-2中LC3B II蛋白的表达上调,并抑制p62蛋白的表达。

此外,利用激光共聚焦显微镜和透射电子显微镜观察发现雷公藤甲素还能促进PC-3、LNCaP和C4-2细胞中自噬小体的形成及自噬流的发生,证明雷公藤甲素能诱导肿瘤细胞发生自噬。

雷公藤红素依赖ROS升高介导DNA损伤诱导肝癌细胞凋亡马静;王红磊;王梓萱;李昕宇;李美秀;吴勇;刘禹佳;卢国栋;周静【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2022(38)3【摘要】目的探究雷公藤红素(celastrol)诱导细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生在介导细胞DNA损伤中的作用及对肝癌细胞凋亡的影响。

方法人肝癌细胞经雷公藤红素处理后,镜下观察细胞形态变化;MTT法测定肝癌细胞的存活率;Hoechst 33258染色观察肝癌细胞核变化;流式细胞术检测细胞死亡;CM-H2DCFDA探针检测细胞内ROS水平;免疫荧光方法检测细胞内DNA损伤标志蛋白γ-H2AX的荧光强度;Western blot检测γ-H2AX、caspase-3、PARP等蛋白表达水平。

结果雷公藤红素可显著抑制肝癌细胞的存活,并可升高细胞内ROS水平,呈浓度依赖性关结论雷公藤红素可诱导肝癌细胞内ROS聚集,高水平的ROS引起细胞DNA损伤,最终诱导细胞凋亡。

【总页数】7页(P366-372)【作者】马静;王红磊;王梓萱;李昕宇;李美秀;吴勇;刘禹佳;卢国栋;周静【作者单位】广西医科大学基础医学院生理学教研室;广西中医药大学基础医学院生理学教研室;广西医科大学公共卫生学院毒理教研室【正文语种】中文【中图分类】R282.71;R329.25【相关文献】1.雷公藤红素通过 ROS／JNK 途径诱导 Saos－2细胞发生 caspase 依赖的凋亡2.异土木香内酯通过介导ROS产生及线粒体损伤诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡3.雷公藤红素通过ROS-JNK信号通路诱导T98G细胞发生凋亡4.雷公藤红素升高细胞浆游离Ca^(2+)浓度与其诱导HMC-1细胞凋亡有关5.雷公藤甲素通过STAT3/PD-L1通路介导子宫内膜癌KLE细胞DNA损伤诱导细胞凋亡的作用机制研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

雷公藤红素调控NF-κB信号通路抑制AKT-c-Met诱导小鼠肝细胞癌作用机制初步研究雷公藤红素是一种来自中药雷公藤的天然活性成分，已被证明具有抗肿瘤作用。

NF-κB信号通路和AKT/c-Met信号通路是关键的细胞生存与增殖调控途径，对肿瘤发生和发展起重要作用。

本研究旨在探讨雷公藤红素如何调控NF-κB信号通路抑制AKT/c-Met诱导小鼠肝细胞癌的作用机制。

首先，我们使用小鼠肝癌细胞株Hepa1-6作为实验模型，将其分为对照组、雷公藤红素处理组和雷公藤红素+NF-κB激活剂组。

实验结果显示，与对照组相比，雷公藤红素处理组中小鼠肝癌细胞的增殖明显减缓，细胞周期阻滞在G0/G1期，细胞凋亡率显著增加。

此外，雷公藤红素处理组中的NF-κBp65和p50亚单位的表达显著降低，而NF-κB激活剂可抵消这种抑制作用。

进一步研究发现，雷公藤红素处理组中的AKT和c-Met的活性也明显下降，表明雷公藤红素可抑制AKT/c-Met信号通路。

我们进一步证实了雷公藤红素通过调节AKT/c-Met信号来抑制NF-κB的活性，并导致小鼠肝癌细胞的凋亡。

更进一步的实验中，我们通过转染NF-κB表达质粒的方法来增强NF-κB信号通路，发现雷公藤红素的抑制作用被逆转。

同时，我们利用AKT/c-Met激活剂来激活AKT/c-Met信号通路，结果显示雷公藤红素对小鼠肝癌细胞的抑制作用被显著削弱。

综合以上结果，我们初步得出了雷公藤红素调控NF-κB信号通路抑制AKT/c-Met诱导小鼠肝细胞癌的作用机制。

具体来说，雷公藤红素通过抑制NF-κB信号通路的活性，降低了AKT/c-Met信号通路的活性，最终导致小鼠肝癌细胞的凋亡和增殖受阻。

这一发现为进一步研究雷公藤红素在肿瘤治疗中的应用提供了基础。

总结起来，本研究发现雷公藤红素通过调节NF-κB信号通路抑制AKT/c-Met诱导小鼠肝细胞癌的作用机制。

这一研究为进一步了解肿瘤发生和发展机制，寻找新的抗肿瘤治疗靶点提供了理论依据。

雷公藤红素对肝癌细胞株HepG2的影响及作用机制罗晓霞;石红梅;肖兵【期刊名称】《广东医学》【年(卷),期】2016(037)017【摘要】目的：研究雷公藤红素（Celastrol）对肝癌细胞株HepG2增殖活力的影响。

方法将人正常肝细胞LO2及人肝癌细胞株HepG2接种在DEME培养基中，传代后取对数生长期细胞进行实验，用MTT法测定不同浓度雷公藤红素对正常肝细胞LO2及肝癌细胞株HepG2增殖的量效关系（1、2、4、8、16、32μmol／L）和在0.5μg／mL浓度的雷公藤红素作用下的时效关系（1、2、4、8、12、24 h），Hoechst 荧光染色观察凋亡细胞形态变化以及Western blot检测肝癌细胞株HepG2中半胱氨酸蛋白酶（ caspase ）－3、caspase －8、caspase －9与胞内磷脂酰肌醇3激酶（p－PI3K）、t－胞内磷脂酰肌醇3激酶（t－PI3K）、磷酸化蛋白激酶（p－AKT）、t－AKT、细胞外信号调节激酶（p－ERK）、t－ERK的表达情况。

结果经MTT法检测，不同浓度雷公藤红素对正常肝细胞的增殖没有明显抑制作用，而对肝癌细胞HepG2的抑制率依次为6.83％、15.11％、18.32％、21.77％、23.77％、25.51％，作用强度随着浓度的升高而增强；在浓度为0.5μg／mL雷公藤红素作用下，不同时间抑制率分别为6.66％、10.63％、13.31％、15.50％、20.54％、32.34％，呈时间依赖性；Hoechst 荧光染色在显微镜下均显现凋亡细胞。

Western blot结果显示， caspase－3、caspase－8、caspase－9、p－PI3K、p－AKT、p－ERK显影，caspase－3、caspase－8、caspase－9表达量增加，而p－PI3K、p－AKT、p－ERK表达量降低。

结论雷公藤红素通过诱导HepG2凋亡及细胞自噬作用，发挥增殖活力抑制作用，可能与调控caspase－3、caspase－8、caspase－9、p－PI3K、p－AKT、p－ERK等相关因子的表达情况有关。

雷公藤红素抗肿瘤作用研究进展李文龙;朱国福;钟伟才;潘颖宜【摘要】Celastrol is a compound of Tripterygium wilfordii Hook, f, which has strong anti-tumor activity in vitro and in vivo. Researchrnhas shown celastrol can inhibit tumor metastasis and angiogenesis, and induce apoptosis of tumour cells. According to a large number ofrndomestic and international studies on Celastrol in recent years, anti-tumor effects of Celastrol were reviewed, so as to provide a basis forrnthe anti-tumor research of Celastrol.%雷公藤红素是中药雷公藤的一个单体成分,在体内外均具有较强的抗肿瘤活性.研究表明雷公藤红素具有抑制肿瘤细胞转移,以及抑制血管内皮细胞生长等作用.作者查阅了近年来国内外的文献,对雷公藤红素的抗肿瘤作用进行综述,为雷公藤红素的抗肿瘤研究提供依据.【期刊名称】《世界中医药》【年(卷),期】2012(007)006【总页数】3页(P574-576)【关键词】雷公藤红素;抗肿瘤【作者】李文龙;朱国福;钟伟才;潘颖宜【作者单位】上海中医药大学,上海市蔡伦路1200号,201203;上海中医药大学,上海市蔡伦路1200号,201203;上海中医药大学,上海市蔡伦路1200号,201203;上海中医药大学,上海市蔡伦路1200号,201203【正文语种】中文雷公藤为卫矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)的根或根的木质部。

标题：雷公藤甲素诱导的caspase(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)依赖的细胞死亡通过介导在白血病细胞线粒体途径引言：雷公藤甲素诱导的caspase依赖的细胞凋亡通过线粒体介导的通路在白血病细胞雷公藤甲素，从分离出一种二萜中国herbTripterygium wilfordiiHook.f，表现出抗肿瘤活广泛一系列实体瘤。

在这里，我们研究它的对白血病细胞和效果发现，在100纳米或更小，它有效诱导凋亡的各种白血病细胞系和原发性急性髓性白血病（AML）的原始细胞。

然后，我们试图找出其作用机制。

伴随着雷公藤甲素诱导caspasedependent细胞死亡显著降低XIAP水平。

ForcedXIAP表达减弱triptolideinduced细胞死亡。

雷公藤甲素也减少Mcl-1的，但不BCL-2和Bcl-XLlevels。

Bcl-2的过度抑制triptolideinduced凋亡。

线粒体膜此外，雷公藤甲素引起的损耗潜力和细胞色素C释放。

caspase-9的基因敲除细胞耐药，同时的caspase-8缺失细胞对雷公藤甲素敏感，暗示的关键性线粒体但没有死亡受体途径雷公藤甲素诱导的细胞凋亡。

雷公藤甲素也增强了细胞死亡诱导其他抗癌剂。

总的来说，我们的结果表明，雷公藤减小XIAP和强效诱导caspasedependent凋亡通过线粒体途径介导在白血病细胞低纳摩尔浓度。

强效雷公藤甲素的体外抗白血病活性值得进一步研究这种化合物对白血病的治疗和其他恶性肿瘤。

介绍：雷公藤Hook.f中，卫矛科的一员植物家族，已用于中国药世纪。

雷公藤内酯醇，二萜类化合物，首次从植物和结构上的特点在1972年并已被用于治疗各种自身免疫疾病的并作为患者的器官和组织移植的免疫抑制剂。

近日，雷公藤甲素所表现出具有抗肿瘤特性范围广泛的抑制生长和诱导细胞凋亡人肿瘤细胞。

雷公藤也显示敏感细胞死亡诱导的各种试剂，如Apo2/Trail ，TNF-α，和不同的化疗药物。

雷公藤红素对体外胃癌细胞增殖与凋亡的影响的开
题报告
题目：雷公藤红素对体外胃癌细胞增殖与凋亡的影响研究
研究背景及意义：
胃癌是发生于胃部的一种恶性肿瘤，其发生率在全球范围内排名前五位。

尽管近年来治疗手段有所进步，但依然需要探索更为有效的药物治疗手段。

雷公藤红素是一种从雷公藤中提取的有效成分，对肿瘤细胞具有良好的抗增殖和诱导凋亡作用，因此被广泛应用于肿瘤治疗领域。

然而，目前针对雷公藤红素的细胞实验仅报道了其对某些肿瘤细胞系的抗增殖和诱导凋亡作用，还缺乏对其对胃癌细胞的作用机制进行深入研究的报道。

研究内容及方法：
本实验将选取人胃癌细胞系进行实验，预先制备不同浓度的雷公藤红素处理人胃癌细胞系，以RLR的抑制作用为评价指标，对浓度不同所处理的人胃癌细胞系的生长抑制情况进行评价。

同时，通过流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡，探究其作用机制。

预期结果及意义：
通过本次实验，我们预计可以得到雷公藤红素对体外胃癌细胞增殖和凋亡的作用情况，为深入研究雷公藤红素在胃癌治疗领域应用提供新的理论依据。

此外，本研究对于进一步探索雷公藤红素的作用机制、寻找更为有效的药物治疗手段提供了实验基础。

雷公藤红素对人乳腺癌细胞系MCF-7的作用发表时间：2014-05-07T08:53:24.950Z 来源：《中外健康文摘》2013年第43期供稿作者：郑鹏飞[导读] 由于其具有抗氧化和抗炎症的作用,一直被有效地用于自身免疫性疾病、哮喘、慢性炎症以及神经变性等疾病的治疗中。

郑鹏飞（辽宁省北票市职业病防治医院 122100）【摘要】目的研究雷公藤红素对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞生长周期的影响及其分子生物学机制。

方法以不同浓度的雷公藤红素处理MCF-7细胞不同时间，采用四甲基偶氮唑盐分析法检测各组MCF-7细胞增殖情况，流式细胞仪检测药物作用前后对细胞周期的变化，Western blot检测药物作用前后生存蛋白及p21蛋白表达的变化。

结果 MTT法检测结果显示雷公藤红素对MCF-7细胞增殖的抑制呈浓度依赖性和时间依赖性（P<0.05）且存在最大抑制浓度1μmol/L；流式细胞仪检测发现随着魟鱼骨素作用时间的延长G1期细胞百分比明显增加（P<0.05）而G2/M期细胞比例明显减少（P<0.05）且细胞凋亡率随药物作用时间的延长明显升高 (P<0.05)；Western blot检测结果显示随着药物作用时间延长，MCF-7细胞中的生存蛋白表达降低，p21蛋白表达逐渐增高（P<0.05）。

结论雷公藤红素抑制MCF-7细胞增殖，阻滞细胞停留在G1期，其机制可能与调控此两种蛋白表达有关，雷公藤红素可能成为未来治疗乳腺癌药物之一。

【关键词】乳腺癌雷公藤红素 MCF-7细胞系细胞增殖生存蛋白【中图分类号】R73-3 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）43-0019-02本实验室以经雷公藤红素处理过的MCF-7人乳腺癌细胞为模型进行体外培养, 研究有效的药物作用浓度和时间，分析其对细胞周期的影响，观察其对生存蛋白基因及p21表达的影响, 研究它的抗肿瘤作用及抑癌机制。

雷公藤红素抑制C2C12细胞增殖及诱导其凋亡许艳华;刘津;陈华群【摘要】雷公藤红素(Celastrol)是传统草药雷公藤根部有效的提取成分,被广泛用于炎症性疾病如类风湿性关节炎、肾炎等治疗.近年来发现,其能抑制肿瘤细胞增殖,具有诱人的肿瘤治疗应用前景.本研究观察到雷公藤红素会抑制C2C12小鼠骨骼肌母细胞的增殖,并可能通过诱导Caspase-3的降解致使C2C12凋亡,提示雷公藤红素临床应用的安全性值得关注.【期刊名称】《南京师大学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(036)003【总页数】4页(P93-96)【关键词】雷公藤红素;C2C12成肌细胞;细胞增殖;细胞凋亡【作者】许艳华;刘津;陈华群【作者单位】南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学生物技术重点实验室,江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学生物技术重点实验室,江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学生物技术重点实验室,江苏南京210023【正文语种】中文【中图分类】Q28雷公藤红素(Celastrol)又名南蛇藤素，是一种从传统中药雷公藤的根皮部提取出的中药有效成分，是临床上用于治疗关节炎、风湿病、肾炎等疾病的药物雷公藤片、雷公藤多苷片等的主要成分［1，2］.雷公藤红素具有多种生物活性和显著药理活性，如抗炎、免疫抑制等［3，4］.雷公藤红素有广泛的药理作用，特别是随着其抗肿瘤效应的发现而备受关注［5］.然而，雷公藤红素对正常细胞的作用则缺乏报道.本研究发现，雷公藤红素体外可抑制培养的C2C12小鼠成肌细胞的增殖并诱导其凋亡.1 材料和方法1.1 材料1.1.1 试剂雷公藤红素(纯度≥98%)购自Sigma-aldrich，以DMSO溶解，0.2 μm滤膜过滤，制备浓度为5 mg/mL的储存液;高糖DMEM培养基购自Thermo生物公司;胎牛血清购自Gibico公司;GAPDH抗体购自上海康成生物工程有限公司;兔抗被切割的Caspase－3抗体购自Cell signaling technology公司;磷脂酰丝氨酸V凋亡试剂盒购自南京凯基.1.1.2 细胞小鼠成肌细胞系C2C12细胞购自ATCC.在5%CO2、37℃细胞培养箱中培养，培养基为含有10%胎牛血清、10 μg/mL链霉素和10 U/mL青霉素的高糖DMEM.1.2 方法1.2.1 MTT 检测细胞的活性96孔培养板中的细胞加入 MTT［3－(4，5－dimethythiazol－2－yl)－2，5－diphenyl－tetrazolium bromide，噻唑蓝］，30 μL/孔(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h.吸去上清，每孔加入150 μL DMSO，室温低速震荡 10 min至紫色结晶完全溶解，酶标仪测定570 nm OD值.以对照组OD值为100%，计算实验组细胞活力.1.2.2 凋亡细胞的测定凋亡细胞以FITC标记的磷脂酰丝氨酸V凋亡试剂盒测定，方法按照试剂盒说明书进行.简述如下:收集细胞，重悬于500 μL Binding buffer，浓度约为2×105个细胞/mL，每管内分别加入5 μL Annexin－V－FITC 和5 μL PI染液，室温避光孵育 15 min，流式细胞仪测定(Guava Technologies，Hayward，CA，USA)，结果以Guava TUNEL软件进行分析，早期和晚期的凋亡细胞均记为凋亡细胞.1.2.3 Western blot分析收集细胞，以预冷的PBS洗2次，加入细胞裂解缓冲液［20 mmol/L Tris(pH7.5)，135 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA，2 mmol/L DTT，25 mmol/L β2 glycerophosphate，0.1%glycerol，0.1%Triton X － 100，1 mmol/LNa3VO4，10 ng/mL aprotinin，10 ng/mL leupeptin 和 1 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)］，置于冰上震荡裂解30 min，12 000 rpm/min离心15 min，取上清加入SDS样品缓冲液，95℃孵育5 min，10%SDS PAGE电泳，转移蛋白至PVDF膜上，以5%脱脂牛奶的TBST封闭1 h，分别加入相应抗体，4℃孵育过夜，TBST洗3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔(Casepase－3)、羊抗鼠(GAPDH)，室温孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min.以ECL western blotting检测试剂盒(Syngene，Britain)进行显色. 1.2.4 所有实验均重复3次以上，结果以t－检验进行分析，以平均值±标准差表示，P＜0.05表示有显著性差异.2 结果2.1 雷公藤红素抑制C2C12的增殖、诱导细胞的死亡雷公藤红素处理C2C12细胞24 h，低浓度组细胞形态无明显变化，但细胞的密度较对照组低;高浓度时，细胞发生明显的形态改变，体积变小，部分细胞变圆，显示死亡形态(图1A).MTT分析发现，雷公藤红素明显抑制细胞活力，并具有浓度依赖性(图1B).以对照组细胞活力为100%，在0.1 μmol/L时，细胞活力为(97.11±2.92)%，显示细胞没有受到明显影响;随着浓度升高(0.5 μmol/L)，细胞活力显著降低，为(91.70 ±4.21)%;到1.5 μmol/L 时，实验组与对照组产生非常明显的差异(P ＜0.001)，其 IC50值约为1.21 μmol/L.后续实验我们选择以 0.5μmol/L、1.0 μmol/L 和2.0 μmol/L 3 种浓度处理细胞.图1 雷公藤红素诱导C2C12细胞死亡Fig.1 Celastrol induced C2C12 cell deathA:光镜下形态学变化(10×);B:MTT分析A:morphologicalchange(10×);B:MTT analysis2.2 雷公藤红素诱导C2C12细胞凋亡已有的研究发现，雷公藤红素诱导细胞死亡的方式主要是细胞凋亡［6，7］.在早期凋亡细胞，细胞膜胞质侧的磷脂酰丝氨酸发生外翻.Annexin V是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合，显示早期细胞的凋亡［9］.碘化丙啶(Propidium iodide，PI)是一种荧光染料，可与DNA结合并对其进行染色.在活细胞和早期凋亡细胞，其质膜完整，PI不能进入细胞.在晚期凋亡细胞，质膜的完整性被破坏，PI进入细胞结合DNA，细胞显示Annexin V和PI染色呈双阳性.雷公藤红素处理6 h，Annexin V阳性的早期凋亡细胞和Annexin V/PI双染色的晚期凋亡细胞均处于较高水平且显著高于对照组，并具有浓度依赖性(Fig.2A).随着雷公藤红素浓度的升高，早期和晚期凋亡细胞总数显著增加(Fig.2B).图2 雷公藤红素诱导C2C12细胞凋亡Fig.2 Celastrol induces apoptosis ofC2C12 cells.A:Annexin V和PI染色－流式细胞技术测定早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞;B:A图的早期和晚期凋亡细胞的总合并进行统计学分析结果A.the percentage of early and late stages of apoptotic cells were detected byflow cytometry using annexin V/PI staining;B.total apoptotic cells wereshowed by bar chart2.3 雷公藤红素诱导Caspase－3的降解细胞发生凋亡时，胞质内无活性的Procaspase－3被切割成为Cleaved caspase －3(切割Caspase－3)的活性形式，进入细胞核内，激活内源性核酸酶，DNA发生降解，形成凋亡小体［10］.对照组C2C12细胞中Caspase－3仅有小部分被切割成17 kD产物.以不同浓度雷公藤红素处理12 h后明显促进了活性Caspase －3的产生，且具有剂量依赖性(Fig.3).图3 雷公藤红素诱导caspase－3的激活，Western Blotting分析细胞中被切割的caspase－3，实验重复3次Fig.3 Effects of Celastrol on the expression level of cleaved casepase －3.Representative data of Western blot analysis.The experiments were repeated for three times3 讨论雷公藤红素具有显著的抗肿瘤活性.对于非小细胞肺癌、急性髓系白血病HL－60、结肠癌、乳腺癌等均具有强烈的抑制增殖或促进凋亡的作用［11－14］.本研究发现，雷公藤红素同样可抑制C2C12细胞的增殖，促进细胞凋亡，表明其对骨骼肌可能存在毒性作用.药物的毒副作用往往与其对药物的耐受程度相关.本研究发现，C2C12对于雷公藤红素的IC50较低，为1.21 μmol/L.而目前其他报道中，肿瘤细胞对于雷公藤红素的耐受普遍不低于或远高于 C2C12［11－13］.在结肠癌细胞株 HT29 中，其 IC50高达56 μmol/L［11］，仅骨髓瘤中 IC50低于 C2C12细胞［14］.虽然雷公藤红素的广谱抗肿瘤效应让人们对其应用前景寄予厚望，但毒副作用将是其临床应用的一大障碍.因此，如何降低毒性作用是雷公藤红素研究的一个热点问题.既可通过化学结构改造来降低其毒性作用，也可通过联合用药降低其使用剂量来降低其毒性作用.有研究发现，低浓度(0.099 μmol/L)雷公藤红素就可显著增强5氟尿嘧啶的杀瘤活性［15］.总之，本研究结果表明雷公藤红素对于体外培养的C2C12细胞具有毒性作用，其体内作用机制仍需进一步研究.［参考文献］［1］ Li H，Zhang Y Y，Tan H W，et al.Therapeutic effect of tripterine on adjuvant arthritis in rats［J］.J Ethnopharmacol，2008，118(3):479－484. ［2］陈铭祥，冯玉静，王定勇，等.雷公藤红素的研究进展［J］.中成药，2010，32(3):473－476.［3］雷万军，王建军.雷公藤免疫抑制作用研究概况［J］.洛阳医专学报，1996，15(2):129－133.［4］ Yu X，Tao W，Jiang F，et al.Celastrol attenuates hypertension-induced inflammation and oxidative stress in vascular smooth muscle cells via induction of heme oxygenase －1［J］.Am J Hypertens，2010，23(8):895 －903.［5］ Yang H，Chen D，Cui Q C，et al.Celastrol，a triterpene extracted from the Chinese"Thunder of God Vine"is a potent proteasome inhibitor and suppresses human prostate cancer growth in nude mice［J］.Cancer Res，2006，66(9):4 758 －4 765.［6］鲍一笑，张登海，张玲珍，等.雷公藤红素诱导CEM－6T细胞凋亡的机制研究［J］.上海免疫学杂志，2003，23(3):187－189.［7］ Mou H，Zheng Y，Zhao P，et al.Celastrol induces apoptosis in non-small-cell lung cancer A549 cells through activation of mitochondria-and Fas/FasL-mediated pathways［J］.Toxicol in Vitro，2011，25(5):1 027 －1 032.［8］ Vermes I，Haanen C，Steffens-Nakken H，et al.A novel assay for apoptosis:Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V［J］.J Immunol Methods，1995，184(1):39 －51.［9］ David Y，Ora S.Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle［J］.Nature，1977，270(5639):725 －727.［10］ Philippe G，Wei H Y，Raymond A S.Ischemic preconditioning by caspase cleavage of poly(ADP-Ribose)polymerase－1［J］.The Journal of Neuroscience，2003，23(22):7 967 －7 973.［11］徐银海，严杰.雷公藤红素诱导人急性髓系白血病HL－60细胞凋亡及其机制的研究［J］.浙江大学学报:理学版，2008，35(3):311 －314.［12］ Lu W，Jia G，Meng X，et al.Beta-catenin mediates the apoptosis induction effect of celastrol in HT29 cells［J］.Life Sci，2012，91(7/8):279－283.［13］ Zhou L L，Lin Z X，Fung K P，et al.Celastrol-induced apoptosis in human HaCaT keratinocytes involves the inhibition of NF-κB activity ［J］.Eur J Pharmacol，2011，670(2/3):399 －408.［14］ Kannaiyan R，Manu K A，Chen L，et al.Celastrol inhibits tumor cell proliferation and promotes apoptosis through the activation of c-Jun N-terminal kinase and suppression of PI3 K/Akt signaling pathways［J］.Apoptosis，2011，16(10):1 028 －1 041.［15］罗伟，陈卫昌.雷公藤红素联合5－氟尿嘧啶在人结肠癌细胞中的相互作用［J］.中国现代医药杂志，2008，10(12):4－7.。

(10)申请公布号 CN 102499942 A(43)申请公布日 2012.06.20C N 102499942 A*CN102499942A*(21)申请号 201110384505.9(22)申请日 2011.11.28A61K 33/24(2006.01)A61P 35/00(2006.01)A61K 31/585(2006.01)(71)申请人广州市赛普特医药科技有限公司地址510600 广东省广州市高新技术产业开发区科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器C 区C208(72)发明人胡海燕 朱文博 李晶洁(74)专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司 44102代理人陈卫(54)发明名称雷公藤甲素顺铂联合运用在制备抗耐药性胰腺癌药物中的应用(57)摘要本发明公开了雷公藤甲素顺铂联合运用在制备抗耐药性胰腺癌药物中的应用。

在两种耐药性胰腺癌细胞PANC-1和MIAPaCa-2上，以及侧腹接种PANC-1细胞的裸鼠上，证实雷公藤甲素-顺铂联合运用对耐药性胰腺癌具有协同抑瘤作用。

到目前为止，还没有关于雷公藤甲素-顺铂联合运用具有协同抑制胰腺癌的研究报导。

在裸鼠异种移植模型上，联合运用低剂量的雷公藤甲素和顺铂显著抑制肿瘤的生长，而单用雷公藤甲素或顺铂均不能引起肿瘤的生长抑制。

对各组的肿瘤切片的免疫组化结果表明，两种药物联用显著下调HSP27的蛋白表达，与细胞株上的结果一致。

这说明雷公藤甲素和顺铂联合运用能作为抗肿瘤药物的增敏剂。

(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书6页 附图6页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 6 页1/1页1.一种组合物，其特征在于，由雷公藤甲素和顺铂组成，雷公藤甲素和顺铂重量份数比为1—20:2—120。

2. 权利要求1所述组合物在制备抗耐药性胰腺癌药物中的应用。

3.权利要求1所述组合物在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用。

专利名称：雷公藤红素在诱导癌细胞自噬上的应用及其与替莫唑胺的联合用药
专利类型：发明专利
发明人：高伟,王秀娟,刘喜红,赵培源
申请号：CN201910030824.6
申请日：20190114
公开号：CN109481448A
公开日：
20190319
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：雷公藤红素在诱导癌细胞自噬上的应用。

通过实验证实，雷公藤红素可以有效的引起癌细胞自噬的发生。

同时证实了抑制雷公藤红素引起的细胞自噬可以促进癌细胞的凋亡和癌细胞的死亡。

雷公藤红素可以提高p‑JNK和p‑p38蛋白的表达，降低p‑Akt和p‑mTOR的表达，多水平改变自噬主要信号通路ROS/JNK和PI3K/Akt/mTOR的主要蛋白的表达，引起自噬的发生，从而影响癌细胞的活性。

申请人：首都医科大学
地址：100069 北京市丰台区右安门外西头条10号
国籍：CN
代理机构：北京中济纬天专利代理有限公司
代理人：覃婧婵
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雷公藤甲素通过 ERK 通路诱导肺癌 A549细胞自噬王伟;王坤【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2016(032)009【摘要】目的：研究雷公藤甲素（tripchlorolide，TP）对肺癌 A549细胞活力及自噬的影响，并初步探讨其作用机制。

方法：应用 TP 作用于肺癌 A549细胞后，MTT 法检测细胞活力；吖啶橙染色（AO）法在荧光显微镜下观察细胞自噬状态；GFP－LC3质粒转染实验观察细胞胞质中绿色点状聚集的自噬小体； Western blot 法检测自噬相关蛋白 LC3－Ⅱ的表达情况及有关的信号通路 ERK 蛋白水平的变化。

结果： TP 可以显著抑制肺癌 A549细胞的增殖（P ＜0．05），并呈一定的剂量－时间依赖关系。

TP 作用于肺癌 A549细胞48 h 后，细胞内酸性滤泡染成亮红色荧光比例增多。

GFP－LC3转染实验结果显示在100 nmol／L TP 处理后，细胞胞质中出现绿色点状聚集的自噬小体，而正常培养组极少细胞有自噬小体形成；同时转染 GFP－control 质粒的细胞在100 nmol／L TP 处理及正常培养条件下均未观察到点状聚集的自噬小体产生。

TP 作用于肺癌 A549细胞48 h 后，与对照组相比，100 nmol／L TP 组 LC3－Ⅱ蛋白表达水平显著升高（P ＜0．01），同时 p－ERK／ERK 蛋白水平也显著升高（P ＜0．01）；与100 nmol／L TP 组相比，TP ＋3－MA 组 LC3－Ⅱ蛋白表达水平显著下降（P ＜0．01），同时 p－ERK／ERK 蛋白水平也显著下降（P ＜0．01）。

结论： TP 可显著抑制肺癌 A549细胞活力并诱导细胞发生自噬，这种作用可能与影响 ERK 的磷酸化有关。

【总页数】5页(P1551-1555)【作者】王伟;王坤【作者单位】杭州市下沙医院药学部，浙江杭州 310018;杭州市下沙医院神经外科，浙江杭州 310018【正文语种】中文【中图分类】R730.23【相关文献】1.秦皮甲素通过抑制Ras/ERK通路诱导人肺癌细胞A549凋亡 [J], 王晶2.和厚朴酚通过mTOR信号通路诱导肺癌A549细胞自噬 [J], LUO Min;MIU Ping;WU Ai-xiang;SHAO Zhong-yi;YANG Hua;SU Sai-sai3.黄芪多糖对黄嘌呤氧化酶诱导的肺癌A549细胞自噬及PI3K/AKT信号通路的影响 [J], 王雪林; 李杨; 刘丹; 王彦君; 明海霞4.雷公藤甲素对非小细胞肺癌细胞系A549增殖的抑制和凋亡的诱导 [J], 刘倩; 汤建华; 张志华5.miR-100-5p靶向mTOR信号通路调控人非小细胞肺癌A549细胞自噬 [J], 桂坤;黄昱;王美锦;欧阳伟炜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

雷公藤红素逆转宫颈癌细胞顺铂耐药性实验研究孙菊萍;姜凯【摘要】目的：研究中药活性成分雷公藤红素逆转耐药宫颈癌细胞株Hela/R对顺铂的耐药性，并探讨其机制。

方法采用顺铂梯度暴露法构建顺铂耐药宫颈癌细胞株Hela/R；采用MTT法检测雷公藤红素是否能增强顺铂对Hela/R的杀伤活性；Western blot试验检测常规Hela细胞及Hela/R细胞抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-w 及Bcl-xl表达水平；流式细胞术检测雷公藤红素联合顺铂对Hela/R细胞的凋亡诱导效应及对线粒体膜电位的影响。

结果1、2、4、8、16、32、64μmol/L顺铂对Hela及Hela/R细胞的细胞活力抑制率分别为：（18.6±1.5）%（Hela），（1.9±1.0）%（Hela/R）；（23.9±2.4）%（Hela），（3.1±1.2）%（Hela/R）；（47.8±3.9）%（Hela），（6.8±1.5）%（Hela/R）；（63.4±5.4）%（Hela），（11.6±1.8）%（Hela/R）；（72.7±5.9）%（Hela），（20.4±2.0）%（Hela/R），（85.7±6.7）%（Hela），（41.2±3.3）%（Hela/R）；（91.8±7.9）%（Hela），（55.8±4.3）%（Hela/R），两组比较，P均约0.05。

2μmol/L雷公藤红素对Hela/R细胞的细胞活力抑制率为（6.6±1.1）%；2μmol/L雷公藤红素分别加10、20、40μmol/L 顺铂组Hela/R细胞的细胞活力抑制率优于单用10、20、40μmol/L顺铂组[（57.2±3.9）%比（12.4±1.2）%、（71.4±5.1）%比（27.8±1.9）%、（84.8±6.8）%比（45.2±3.1）%，P<0.05]。