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分子标记概述遗传标记主要有四种类型：形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）.分子标记是其中非常重要的一种，他是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。
早在1923年，Sax等就提出利用微效基因与主基因的紧密连锁，对微效基因进行选择的设想。
但由于形态标记数目有限,而且许多标记对育种家来说是不利性状，因而难以广泛应用。
细胞标记主要依靠染色体核型和带型，数目有限。
同工酶标记在过去的二、三十年中得到了广泛的发展与应用.作为基因表达的产物，其结构上的多样性在一定的程度上能反映生物DNA组成上的差异和生物遗传多样性。
但由于其为基因表达加工后的产物，仅是DNA全部多态性的一部分，而且其特异性易受环境条件和发育时期的影响；此外同工酶标记的数量有限，不能满足育种需要。
近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新技术手段,即分子标记技术。
与其它标记方法相比,分子标记具有无比的优越性。
它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题;数量极多，基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的;多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁;许多标记为共显性,对隐性的性状的选择十分便利，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息。
随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。
分子标记的概念有广义和狭义之分.广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
分⼦标记介绍分⼦标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋⽩质。
即DNA⽚段即能反映⽣物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA ⽚段；能受基因控制并且能够稳定遗传的，能代表个体或群体的遗传特征，并可被⽤作遗传分析的物质。
它能够直接反映基因组间DNA间的差异。
常⽤的分⼦标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、EST等。
RAPD、AFLP属于以PCR为基础的分⼦标记；RFLP属于以Southern为基础的分⼦标记；SSR、ISSR属于以重复序列为基础的分⼦标记；EST以mRNA为基础的分⼦标记。
1 主要的分⼦标记介绍1.1 限制性⽚段长度多态性（RFLP）RFLP是应⽤Southern杂交技术检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA⽚段的⼤⼩。
所以对于引起酶切位点变异的突变如点突变或部分DNA⽚段的缺失、插⼊、倒位⽽引起酶切位点缺失或获得等均可应⽤。
此⽅法的基本步骤包括：DNA的提取、⽤限制性内切酶酶切DNA、凝胶电泳分开DNA⽚段、把DNA⽚段转移到滤膜上、利⽤放射性标记的探针显⽰特定的DNA⽚段、分析结果。
探针⼀般选择单拷贝的。
其优点为共显性标记，稳定且可重复但耗时，昂贵且需应⽤同位素。
⽤该技术可作出植物的RFLP图谱，并应⽤于植物遗传和育种研究。
杨长红等采⽤PCR-RFLP技术，对库尔勒⾹梨等19个主要梨品种的cpDNA遗传多态性进⾏研究，其利⽤10对通⽤引物对总DNA进⾏扩增，并且采⽤7种限制性内切酶对PCR产物进⾏酶切，通过软件分析得出：7对引物（cp01、cp02、cp03、cp04、cp06、cp09、cp10）能在梨属植物上扩增出1条特异性谱带，cp09／MvaI，cp03／Hin6I的酶切位点有显著差异。
根据结果分析，库尔勒⾹梨与鸭梨、砀⼭梨、苹果梨、早酥、慈梨、⾦川雪梨、锦丰、新疆句句梨的平均距离系数较⼩，与其他梨的平均距离系数较⼤。
1.2 随机扩增多态性DNA(RAPD)RAPD是以8-10个碱基的随机寡聚核苷酸序列为引物，利⽤PCR技术⾮特异性扩增DNA⽚段，然后⽤凝胶电泳分开扩增⽚段，即得到⼀系列多态性DNA⽚段.染⾊后即可进⾏多态性分析。
分子标记（Molecular Markers），是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。
每一代的分子标记技术代表如下：
（1）限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）
RFLP是第一代分子标记技术，指把特定的DNA用特点的限制性核酸内切酶进行切割，将切割形成的片段进行标记之后与其他个体进行杂交，以检测不同物种间的多态性。
（2
RAPD是指把第一个生物的基因组用特定的限制性核酸内切酶进行切割，将切割后形成的片段进行扩增，以这些片段为探针来检测2个或多个物种的多态性。
SSR是第二代分子标记技术，指将人工合成或提取的2-8个核苷酸为探针，将其标记之后检测2个或多个物种的多态性。
（4
SNP是第三代分子标记技术，标记单个特殊的核苷酸，用来检测不同个体间的差异性。
检测SNP 的最佳方法是DNA 芯片技术。
对单个核苷酸的差异进行检测，SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。
分子标记遗传标记作为识别基因型的表现形式，在生物基因研究方面起到了重要作用，目前通过遗传标记的方法定位基因位置已成为基因定位的常用方法。
遗传标记主要有形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）四种类型。
形态标记、细胞标记因其自身局限性的原因，目前鲜有使用。
虽然以同工酶标记为代表的生化标记得到了广泛的发展，但由于其检测的范围狭窄、统计难度大等缺陷，目前仅在少数方面有所应用。
从20世纪70年代分子标记出现至今的40年，分子标记因其无比的优越性，使得其成为目前应用最广泛的遗传标记方法。
一、分子标记的概念分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记。
广义的分子标记是指可遗传并能检测的蛋白质或DNA序列。
而狭义的分子标记仅仅是指基于DNA分子多态性构建的标记方法。
二、分子标记的特点理想的分子标记一定要达到以下标准：1、具有高的多态性；2、共显性遗传即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；3、能明确辨别等位基因；4、遍布整个基因组；5、除特殊位点的标记外要求分子标记均匀分布于整个基因组；6、选择中性即无基因多效性；7、检测手段简单、快速如实验程序易自动化；8、开发成本和使用成本尽量低廉；9、在实验室内和实验空间重复性好便于数据交换。
目前，在现实条件下并没有这种绝对理想的分子标记，但相比形态标记、细胞标记、生化标记，分子标记依旧有着明显的优越性：1、直接以DNA形式表现，在生物体各组织、各时期均可检测，不受环境限制；2、数量多，遍布全基因组，有近乎无限的检测座位；3、多态性高；4、表现为中性，不影响目标性状的表达；5、许多标记为共显性，能区别纯合体与杂合体。
三、分子标记的分类分子标记技术通常被分为基于分子杂交的分子标记技术（RFLP）（或叫做非PCR基础上的分子标记技术）、基于PCR技术的分子标记技术和同时基于分子杂交和PCR两种技术的分子标记技术三大类型。
分子标记分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。
分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。
每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。
植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。
②不受环境影响。
因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。
③标记数量多,遍及整个基因组。
④多态性高,自然存在许多等位变异。
⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。
⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。
⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。
因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。
1. 1 第1 代分子标记1.1. 1 RFLP 标记技术。
1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术。
RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。
优点：RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。
缺点：在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。
分子标记技术概述现代生物技术是近几十年来发展起来的以现代生命科学为基础，利用生物体系和现代工程原理，集中多学科的新知识生产生物制品和创造新物种的综合科学技术。
随着分子生物学的快速发展，现代生物技术为作物育种提供了强有力的工具，分子标记辅助选择（MAS）是其中一项重要的技术手段，弥补了传统作物育种中选择效率低的缺点，加快了育种进程，为育种家广泛采用。
一、分子标记的定义与特点遗传标记（genetic marker）是指可追踪的染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。
在遗传分析上遗传标记可用作标记基因，它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。
传统的遗传标记主要包括形态标记、组织细胞标记、生化标记与免疫学标记等，这些标记都是基因表达的产物，易受生理状态、贮藏加工等多个因素的影响，具有较大的局限性。
Bostein 等（1980）利用限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）作为遗传标记分析的手段，开创了应用生物体DNA多态性发展遗传标记的新阶段。
分子标记是根据基因组DNA 存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上差异的一类遗传标记，它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后发展起来的新型遗传标记技术。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA 序列或蛋白质分子。
而通常所说的分子标记是指以DNA 多态性为基础的遗传标记，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，直接反映出生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。
相对于传统的遗传标记，DNA 分子标记的优势在于：DNA 分子标记多为共显性标记，能够简单直观地分辨出纯合和杂合的基因型，对隐性性状的选择十分有利；多态性高，由于自然界中存在丰富的基因组变异，能够开发出几乎无限的DNA 分子标记；稳定性好，不受环境和生物生长与发育阶段的影响，任何时候任何组织的DNA 都可用于标记分析；由于DNA 分子标记是在DNA 水平上开发而来，表现为中性，不会与其他性状连锁，因此不影响目标性状的表达；检测手段简便、迅速，成本低。
分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
即DNA片段即能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段；能受基因控制并且能够稳定遗传的，能代表个体或群体的遗传特征，并可被用作遗传分析的物质。
它能够直接反映基因组间DNA间的差异。
常用的分子标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、EST等。
RAPD、AFLP属于以PCR为基础的分子标记；RFLP属于以Southern为基础的分子标记；SSR、ISSR属于以重复序列为基础的分子标记；EST以mRNA为基础的分子标记。
1 主要的分子标记介绍
1.1 限制性片段长度多态性（RFLP）
RFLP是应用Southern杂交技术检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。
所以对于引起酶切位点变异的突变如点突变或部分DNA片段的缺失、插入、倒位而引起酶切位点缺失或获得等均可应用。
此方法的基本步骤包括：DNA的提取、用限制性内切酶酶切DNA、凝胶电泳分开DNA片段、把DNA片段转移到滤膜上、利用放射性标记的探针显示特定的DNA片段、分析结果。
探针一般选择单拷贝的。
其优点为共显性标记，稳定且可重复但耗时，昂贵且需应用同位素。
用该技术可作出植物的RFLP图谱，并应用于植物遗传和育种研究。
杨长红等采用PCR-RFLP技术，对库尔勒香梨等19个主要梨品种的cpDNA遗传多态性进行研究，其利用10对通用引物对总DNA进行扩增，并且采用7种限制性内切酶对PCR产物进行酶切，通过软件分析得出：7对引物（cp01、cp02、cp03、cp04、cp06、cp09、cp10）能在梨属植物上扩增出1条特异性谱带，cp09／MvaI，cp03／Hin6I的酶切位点有显著差异。
根据结果分析，库尔勒香梨与鸭梨、砀山梨、苹果梨、早酥、慈梨、金川雪梨、锦丰、新疆句句梨的平均距离系数较小，与其他梨的平均距离系数较大。
1.2 随机扩增多态性DNA(RAPD)
RAPD是以8-10个碱基的随机寡聚核苷酸序列为引物，利用PCR技术非特异性扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分开扩增片段，即得到一系列多态性DNA片段.染色后即可进行多态性分析。
其特点包括：无需知道模板的结构信息及无种属特异性；用一个引物就可扩增出许多片段；不涉及放射自显影及其他技术；所需样品少且成本低；仅为显性遗传且重复性差。
其主要应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上。
傅明洋等运用RAPD技术对白杨派中7个树种和3个人工杂交种共计50个无性系的亲缘关系进行分析共筛选出的26条随机引物共扩增产生222条谱带,其中200条为多态性谱带,多态性带达90.09%,且种间遗传变异大于种内无性系间的遗传变异。
聚类分析结果显示,参试的50个材料可分为2大类：第一类由山杨、小叶杨、河北杨组成;第二类由毛白杨、银毛杨、84K杨、银白杨、银灰杨、新疆杨和银新杨组成;3个人工杂交种与白杨亚派树种的亲缘关系较近;人工杂交种银毛杨与84K杨间亲缘关系最近。
1.3 扩增片段长度多态性(AFLP)
AFLP将PCR与RFLP相结合，将植物基因组DNA经2个限制性内切酶酶切后，与特定接头相连接，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行特异性PCR扩增，最后分离扩增的DNA片断，可用放射性法、荧光法或银染染色法检测。
其操作步骤为：①DNA提取和质量检测；
②双酶切和酶切片段连接；③酶切连接片段的预扩增；④选择性扩增；⑤扩增产物在聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳；⑥将电泳后的凝胶进行显影检测及数据分析。
魏朔南等应用植物形态学和AFLP分子标记，对陕西8个漆树栽培品种和6个野生居群进行了鉴别。
从26个形态性状中筛选出3个主成分，其中：第1主成分指标7个(第5小叶长／宽、花瓣长、花瓣宽、花丝长、花丝直径、花药长和宽)贡献率为30．383Vo；第2主成分指标5个(小叶数、复叶长、复叶柄长、第5小叶叶柄长、顶端小叶叶柄长)贡献率为19．321％；第3主成分指标2个(第5小叶顶角角度、顶端小叶顶角角度)贡献率为13．777 ，并且筛选的8对AFLP引物组合（预扩增引物组合在3＇端带一个选择性碱基，选择性扩增的引物组合在其3＇端带3个选择性碱基），均可将漆树14个样品完全区分开。
植物形态学和AFLP分子标记相结合，不仅可用于漆树不同品
种及野生居群间的鉴别，而且可反映其相互间的亲缘关系。
1.4 单核苷酸多态性（SNPs）
SNPs是广泛存在于基因组中的一类DNA序列变异，其频率为l％或更高。
它是由单个碱基的转换或颠换引起的点突变，稳定而可靠，其通常以二等位基因的形式出现，并利用这些差异，在分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测。
近缘种群或同种个体之间的SNPs是存在于生物基因组上由单个核苷酸的变异所引起的一种DNA序列多态性。
卫尊征等对小叶杨36株基因型个体的PsGA20Ox基因组DNA序列进行比对和分析,检测到49个单核苷酸多态性（SNP）位点,频率为1/35bp。
其中,15个是常见SNPs,34个为罕见SNPs。
在这些SNPs中,37个属于转换,12个属于颠换。
在外显子区域,共检测到26个SNP位点,其中23个为同义突变,3个为错义突变。
对PsGA20Ox基因内SNPs进行的连锁不平衡分析表明,随着核苷酸序列长度的增加,SNPs的连锁不平衡在基因内部就迅速衰退,得出在小叶杨中,基于候选基因的连锁不平衡作图是可行的,而基于整个杨树基因组的连锁不平衡作图是不可行的,也是不必要的。
1.5 简单重复序列(SSR)
SSR又称微卫星序列指DNA分子中2～4个核苷酸串连重复序列分布于整个基因组的不同位置上，不同品种间其重复长度有高度的变异性，串联重复次数一般为10-50次，同一类微卫星DNA可分布在基因组的不同位置上，长度一般在100 bp以下，由于重复次数不同，从而造成了每个位点的多态性。
但微卫星DNA两端的序列多是保守的单拷贝序列，根据两端的序列设计一对特异引物，经PCR扩增，PAGE电泳及放射自显影，可以得到因简单序列重复单位数不同而引起的扩增片段的多态性，即获知不同个体在这个位点上由于基本单元重复次数不同而形成的多态性。
殷继艳等从新疆额尔齐斯河流域两岸及河谷共收集杨属黑杨派、白杨派和青杨派等3大组6个种共83份样本单株，首次对新疆额尔齐斯河流域两岸及河谷天然林杨属种间亲缘关系、银灰杨杂种形成机制、额河杨和新疆杨的分类地位问题，从分子水平进行了比较系统的研究和分析，表明黑杨派和青杨派的亲缘关系比较近，而白杨派则较远。
1.6 表达序列标签（EST）
EST是将mRNA反转录成cDNA并克隆到质粒或噬菌体载体构建成cDNA文库后，大规模随机挑选cDNA克隆，对其5’或3’端进行一步测序，所获序列与基因数据库中已知序列进行比较，从而获得对生物体生长、发育、代谢、繁殖、衰老死亡等一系列生理生化过程。
2 应用
分子标记可应用在木本植物育种的各个的方面，木本植物的转基因研究成果在提高木本植物抗性、加速世代交替、抵抗环境污染、维持生态平衡、提供优质木材等方面发挥着越来越重要的作用。
2.1 种质资源的遗传多样性分析
木本植物个体基因型高度杂合，存在着大量的多态性。
由于遗传变异表现在外部形态、蛋白质分子结构等方面，所以非编码区域的变异对于生物的遗传和进化也起着重要作用，借助分子标记技术可以较全面地对研究对象进行比较分析，提高分类的准确性和可靠性
2.2 遗传性状的基因定位研究
通常借助个别性状基因(如抗性)的导人对木本植物品种进行改良，所以找寻与目的基因紧密连锁的分子标记即可实现品种改良的目的。
其方法主要有连锁图法(Linkage map)、近等位基因系法(NIL)、集群分离分析法(BSA)3种。
2.3 分子辅助育种
分子标记辅助选择系统的建立，使一些不易区分的性状可通过间接选择来达到目的，同时还可能对其杂交后代进行早期选择与预测，从而使对亲本的选配更具可控性。
在木本植物育种工作中，确定目标性状是由质量性状或QTL控制，并利用与目标质量性状基因紧密连锁的分子标记，是进行质量性状选择的有效途径。
