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logo.gif (2519 bytes)广西医科大学学报JOURNAL OF GOUNGXI MEDICALUNIVERSITY 1999年 第16卷 第2期 Vol.16 No.2 1999qklogo.gif (1030 bytes)外周血DNA简易提取法周小玲 林伟雄 从人血液中或组织中提取DNA是现代分子生物学研究获得大分子DNA的普遍方法，我们对经典［1～4］的DNA提取法进行了一些改进和简化，获得了较好的效果，现介绍如下。
1 方法与结果 取ACD抗凝血2ml，加入等量质量浓度为3%明胶生理盐水(含0.5%EDTA-Na2)，混匀后置37℃水浴(若气温较高可免水浴)，约5～10 min红细胞沉降分层，可在上层液还残留少许红细胞时尽可能多地吸取上层液(甚至可吸取少量界面上的红细胞)，上层液(富含白细胞)3500 r/min离心5min，弃上清液，沉淀的白细胞加入2ml TES(15 mmol/L Tris-HCl pH8.0、15 mmol/L EDTA pH8.0、15 mmol/L NaCl)混匀，加质量浓度为10%SDS 至终浓度0.5%，待细胞充分裂解(液体由混浊变清和粘稠)，加等体积饱和酚，用吸管抽吸使酚水两相充分混合成乳浊液，若太粘稠可加适量TES再抽提，3500 r/min离心10 min后吸上清液至另一管，重复酚抽提一次，加等体积氯仿/异戊醇(24/1,V/V)抽提一次，将最后离心获得的上清液吸出后加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻摇动使纤维状的DNA析出，DNA用体积分数为75%乙醇洗涤一次，于有盖锥形离心管中开盖风干，加适量TE(10 mmol/L Tris-HCl pH8.0、1mmol/L EDTA-Na2 pH8.0)溶解即可用于PCR等分子生物学实验，表1是简易法与经典方法(中分子右旋醣酐悬浮加上蛋白酶K水解)提取的DNA比较(血液标本每份2 ml)，图1是用简易法提取的DNA进行PCR-SSP检测人HLA 基因型的PCR产物电泳图谱。
文章编号: 1007-6611(2006)01-0012-02外周血D NA提取方法的比较及改良赵嘉惠, 张华屏 (山西医科大学医学实验中心分子生物学实验室, 太原 030001)摘要: 目的 对3种提取外周血的实验方法进行了比较,并建立一种简便、快速、有效的外周血基因组DNA的提取方法。
方法 采用常规酚/氯仿提取法、碘化钾法和外周血液DNA提取法。
结果 外周血液DNA提取方法提取外周血基因组DNA的纯度高,通过电泳图明显可见。
结论 外周血液DNA提取简便、快速、有效适用于临床标本的研究。
关键词: 外周血; 基因组DNA; 提取中图分类号: R349.61 文献标识码: A 快速经济地从外周血提取高产量高纯度的DNA,对于分子水平的研究非常重要。
目前,外周血DNA的提取方法较多,如:常规酚/氯仿提取法、碘化钾法等,为适应临床检验工作的需要,我们经过长期的实验摸索了一种外周血提取DNA的有效方法。
1 材料与方法1.1 仪器 紫外分光光度计:英国CECIL公司生产的CE1020型;PCR扩增仪:美国MJ Research Ine 公司生产的PTC2100型;离心机:美国Heraeus公司生产的Biofuge PrinmoR;电泳仪:日本Hoefer公司生产的PS3000;紫外凝胶成像系统:德国UVP公司生产的G DS7500。
1.2 方法1.2.1 DNA的提取1.2.1.1 常规酚/氯仿提取法 取枸橼酸钠抗凝血80μl,操作方法见参考文献[1]。
1.2.1.2 碘化钾提取法 取100μl ED TA2Na2抗凝血,提取法见参考文献[2]。
1.2.1.3 T KM2血液DNA提取法 取2ml含抗凝剂的全血加入2ml已配制好的溶液Ⅰ缓冲液(10 mmol Tris2HCl p H7.4,10mmol KCl10mmol Mg2 Cl22mmol ED TA)和50μl NP240,旋涡振荡器上充分混匀,3000r/min室温离心10min,弃上清,细胞沉淀中再加溶液Ⅰ缓冲液,混匀后再离心,如此反复3-5次,直至上清由红色变为无色。
一种外周血基因组dna快速提取方法与流程外周血基因组dna快速提取方法主要包括细胞裂解、蛋白质沉淀、dna沉淀、洗涤、溶解等步骤。
Cell lysis is the first step,which breaks open the cells and releases the DNA.细胞裂解后，使用蛋白质沉淀剂使蛋白质凝聚沉淀，分离dna。
After cell lysis, a protein precipitation reagent is used to precipitate the proteins, separating them from the DNA.接着，用酒精使dna沉淀，加速dna的分离和提取。
Then,alcohol is used to precipitate the DNA, facilitating its separation and extraction.洗涤步骤可以去除杂质和污染物，提高dna的纯度。
Washingsteps can remove impurities and contaminants, increasing the purity of the DNA.最后，使用溶解液将dna溶解，得到纯净的基因组dna。
Finally, a dissolution solution is used to dissolve the DNA, obtaining pure genomic DNA.这种方法简单快捷，适用于大规模的外周血样品提取。
This method is simple and fast, suitable for large-scaleextraction of peripheral blood samples.与传统方法相比，该提取方法省时、高效。
Compared with traditional methods, this extraction method is time-savingand efficient.这种提取方法对于分子生物学研究和临床诊断具有重要意义。
人类基因组DNA的提取【实验目的】1.学习和掌握从人全血中提取基因组DNA的方法。
【实验原理】全血中含有白细胞，可从白细胞中获得基因组DNA。
非离子去污剂如Triton X-100可直接破裂血中红细胞和白细胞的细胞膜，释出血红蛋白及细胞核，反应体系中含一定浓度蔗糖，维护核膜内外的渗透压，以防止核膜破裂，通过离心等手段即可获得白细胞的细胞核。
核悬液中加入核裂解液破坏核膜，并使DNA从核蛋白中解离，裂解液中的EDTA能抑制细胞中DNase的活性，保护DNA暂时不被降解。
再经异丙醇沉淀即可获得基因组DNA。
基因组DNA提取应遵循以下原则，1、尽量保证核酸一级结构的完整性。
2、排除其它分子(如蛋白质、多糖、脂类、有机溶剂等)的污染，使下游试验顺利进行。
【实验用品】1.材料：外周血2.器材：水浴锅、离心机、微量移液器、Tip头、Eppendorf管3.试剂：（1）细胞裂解液：（2）核裂解液（3）蛋白沉淀液（4）DNA溶解液（5）RNA酶（6）异丙醇（7）70%乙醇（8）TE缓冲液【实验步骤】1. 1.5ml离心管中加入300ul经抗凝处理的人全血，加入900ul细胞裂解液翻转5-6次混匀。
2.室温保存10分钟（其间翻转2-3次）裂解红细胞。
室温13000*g离心20秒，弃上清（会有约20ul残留液）。
3.涡旋震荡10-15秒（使细胞核充分重悬）。
加入300ul核裂解液，移液器抽吸5-6次混匀（此时溶液会变粘稠）。
37℃温浴10分钟。
4.加入100ul 蛋白沉淀液，涡旋震荡10-20秒。
5.室温13000*g离心3分钟。
可见到深褐色的蛋白沉淀。
6.将上清转移至1.5ml离心管中，加入300ul室温异丙醇。
7.轻柔翻转离心管，可观察到白色丝状物（即DNA）8.室温13000*g离心1分钟。
可见离心管底部有DNA白色沉淀物。
弃上清。
9.加入300ul 70%乙醇，轻柔翻转清洗DNA，室温13000*g离心1分钟。
血液中DNA提取的原理：如果以外周血为DNA提取材料，在外周血中提取DNA就是从有核的白细胞中提取DNA。
因此，从外周血中提取DNA包括以下几个关键步骤：第一，破坏红细胞，通常利用红细胞与白细胞膜结构的差异，先使红细胞裂解，经离心后收集白细胞；第二，白细胞裂解：使膜蛋白和核蛋白变性，游离DNA，通常是采用离子型表面活性剂使蛋白质变性；第三，除去变性蛋白质：通常采用蛋白沉淀剂沉淀变性蛋白质，使DNA留在上清液中；第四，在高盐环境下使DNA从有机溶剂如无水乙醇中析出。
取材取外周血5ml，EDTA抗凝1.新鲜抗凝血，离心弃去上清液；2.取出4℃冰箱预冷的ELS裂解液，按1:6-10的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液（1ml 细胞压积加入6-10ml裂解液），轻轻吹打混匀；红细胞裂解液ELS配方：NH4Cl:4.15克加双蒸水500ml,取450ml;Tris:1.0297克加双蒸水50ml,再加上上面的450ml,共计500ml,高压灭菌,用时加10-20ml3.800-1000rpm离心5-8分钟，离心弃去上层红色清液；4.收集沉淀部分，加入Hank’s液或无血清培养液离心洗2-3次；5.如裂解不完全可重复步骤2和3；6.重悬细胞，用于后续实验；提取DNA，最好是于步骤4开始使用DEPC水配制的溶液进行.酚氯仿方法提取DNA在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。
这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。
2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。
文章编号:1005-8982(2004)02-0070-03一种快速微量外周血基因组DNA的提取方法王龙武1,2,石 柯3,彭爱红2,张 志2,徐克前1(1.中南大学湘雅医学院检验系,湖南长沙410008;2.湖南省临床检验中心,长沙410008;3.中南大学湘雅医院,湖南长沙410008)摘要:目的 建立一种简便、快速、有效、微量外周血基因组DNA的提取方法。
方法 采用NaI作细胞裂解剂裂解细胞和细胞核,用氯仿∶异戊醇(24∶1)直接提取基因组DNA。
结果 该方法提取外周血基因组DNA 的纯度高A260nm/A280nm=(1.87±0.11),提取效率每毫升外周血可得DNA(31±3.12)μg。
结论 该法简便、快速、有效,适应于批量临床标本的处理。
关键词: 基因组DNA;碘化钠;外周血;提取中图分类号: R446.61 文献标识码: AA rapid and simple method for extracting hum an genomicDNA from peripheral bloodW ANGLong-wu1,2,SHI ke3,PE NG Ai-hong2,ZH ANG zhi2and X U K e-quan1(1.Department o f Clinical Lab,Xiangya Medical College,Changsha,Hunan410008,China;2.Departmet o f Clinical Lab o f Hunan Province,Changsha,Hunan410003,China;3.Xiangya o f Central South Univer sity,Changsha City,Hunan410008,China)Abstract: Objective:T o establish a rapid,sim ple,efficient method for extracting human genomic DNA from periph2 eral blood.Methods:peripheral blood is lysed by adding a chaotropic agent NaI,then genomic DNA is directly extracteded with chloroform:is oamyl alcohol(24∶1).R esults:The G enomic DNA extracted with this method is of large m olecular weight and A260/280=(1.87±0.11),(31±3.12)μg DNA can be gained from per milliliter peripheral blood.The results of PCR and restriction endonucleases digestion for the DNA are g ood.Conclusions:The me thod is sim ple,rapid,efficient and could be used to handle a largenumber of clinical sam ples.K ey w ords: G enomicDNA;s odium iodide;Peripheral blood;extractionC LC number: R446.61 Document code: A 基因分析的关键步骤,即基因组DNA提取和纯化一直是耗时,繁琐的过程,且自动化程度不高[1]。
