下载文档原格式
logo.gif (2519 bytes)广西医科大学学报JOURNAL OF GOUNGXI MEDICALUNIVERSITY 1999年 第16卷 第2期 Vol.16 No.2 1999qklogo.gif (1030 bytes)外周血DNA简易提取法周小玲 林伟雄 从人血液中或组织中提取DNA是现代分子生物学研究获得大分子DNA的普遍方法，我们对经典［1～4］的DNA提取法进行了一些改进和简化，获得了较好的效果，现介绍如下。
1 方法与结果 取ACD抗凝血2ml，加入等量质量浓度为3%明胶生理盐水(含0.5%EDTA-Na2)，混匀后置37℃水浴(若气温较高可免水浴)，约5～10 min红细胞沉降分层，可在上层液还残留少许红细胞时尽可能多地吸取上层液(甚至可吸取少量界面上的红细胞)，上层液(富含白细胞)3500 r/min离心5min，弃上清液，沉淀的白细胞加入2ml TES(15 mmol/L Tris-HCl pH8.0、15 mmol/L EDTA pH8.0、15 mmol/L NaCl)混匀，加质量浓度为10%SDS 至终浓度0.5%，待细胞充分裂解(液体由混浊变清和粘稠)，加等体积饱和酚，用吸管抽吸使酚水两相充分混合成乳浊液，若太粘稠可加适量TES再抽提，3500 r/min离心10 min后吸上清液至另一管，重复酚抽提一次，加等体积氯仿/异戊醇(24/1,V/V)抽提一次，将最后离心获得的上清液吸出后加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻摇动使纤维状的DNA析出，DNA用体积分数为75%乙醇洗涤一次，于有盖锥形离心管中开盖风干，加适量TE(10 mmol/L Tris-HCl pH8.0、1mmol/L EDTA-Na2 pH8.0)溶解即可用于PCR等分子生物学实验，表1是简易法与经典方法(中分子右旋醣酐悬浮加上蛋白酶K水解)提取的DNA比较(血液标本每份2 ml)，图1是用简易法提取的DNA进行PCR-SSP检测人HLA 基因型的PCR产物电泳图谱。
文章编号: 1007-6611(2006)01-0012-02外周血D NA提取方法的比较及改良赵嘉惠, 张华屏 (山西医科大学医学实验中心分子生物学实验室, 太原 030001)摘要: 目的 对3种提取外周血的实验方法进行了比较,并建立一种简便、快速、有效的外周血基因组DNA的提取方法。
方法 采用常规酚/氯仿提取法、碘化钾法和外周血液DNA提取法。
结果 外周血液DNA提取方法提取外周血基因组DNA的纯度高,通过电泳图明显可见。
结论 外周血液DNA提取简便、快速、有效适用于临床标本的研究。
关键词: 外周血; 基因组DNA; 提取中图分类号: R349.61 文献标识码: A 快速经济地从外周血提取高产量高纯度的DNA,对于分子水平的研究非常重要。
目前,外周血DNA的提取方法较多,如:常规酚/氯仿提取法、碘化钾法等,为适应临床检验工作的需要,我们经过长期的实验摸索了一种外周血提取DNA的有效方法。
1 材料与方法1.1 仪器 紫外分光光度计:英国CECIL公司生产的CE1020型;PCR扩增仪:美国MJ Research Ine 公司生产的PTC2100型;离心机:美国Heraeus公司生产的Biofuge PrinmoR;电泳仪:日本Hoefer公司生产的PS3000;紫外凝胶成像系统:德国UVP公司生产的G DS7500。
1.2 方法1.2.1 DNA的提取1.2.1.1 常规酚/氯仿提取法 取枸橼酸钠抗凝血80μl,操作方法见参考文献[1]。
1.2.1.2 碘化钾提取法 取100μl ED TA2Na2抗凝血,提取法见参考文献[2]。
1.2.1.3 T KM2血液DNA提取法 取2ml含抗凝剂的全血加入2ml已配制好的溶液Ⅰ缓冲液(10 mmol Tris2HCl p H7.4,10mmol KCl10mmol Mg2 Cl22mmol ED TA)和50μl NP240,旋涡振荡器上充分混匀,3000r/min室温离心10min,弃上清,细胞沉淀中再加溶液Ⅰ缓冲液,混匀后再离心,如此反复3-5次,直至上清由红色变为无色。
一种外周血基因组dna快速提取方法与流程外周血基因组dna快速提取方法主要包括细胞裂解、蛋白质沉淀、dna沉淀、洗涤、溶解等步骤。
Cell lysis is the first step,which breaks open the cells and releases the DNA.细胞裂解后，使用蛋白质沉淀剂使蛋白质凝聚沉淀，分离dna。
After cell lysis, a protein precipitation reagent is used to precipitate the proteins, separating them from the DNA.接着，用酒精使dna沉淀，加速dna的分离和提取。
Then,alcohol is used to precipitate the DNA, facilitating its separation and extraction.洗涤步骤可以去除杂质和污染物，提高dna的纯度。
Washingsteps can remove impurities and contaminants, increasing the purity of the DNA.最后，使用溶解液将dna溶解，得到纯净的基因组dna。
Finally, a dissolution solution is used to dissolve the DNA, obtaining pure genomic DNA.这种方法简单快捷，适用于大规模的外周血样品提取。
This method is simple and fast, suitable for large-scaleextraction of peripheral blood samples.与传统方法相比，该提取方法省时、高效。
Compared with traditional methods, this extraction method is time-savingand efficient.这种提取方法对于分子生物学研究和临床诊断具有重要意义。
人类基因组DNA的提取【实验目的】1.学习和掌握从人全血中提取基因组DNA的方法。
【实验原理】全血中含有白细胞，可从白细胞中获得基因组DNA。
非离子去污剂如Triton X-100可直接破裂血中红细胞和白细胞的细胞膜，释出血红蛋白及细胞核，反应体系中含一定浓度蔗糖，维护核膜内外的渗透压，以防止核膜破裂，通过离心等手段即可获得白细胞的细胞核。
核悬液中加入核裂解液破坏核膜，并使DNA从核蛋白中解离，裂解液中的EDTA能抑制细胞中DNase的活性，保护DNA暂时不被降解。
再经异丙醇沉淀即可获得基因组DNA。
基因组DNA提取应遵循以下原则，1、尽量保证核酸一级结构的完整性。
2、排除其它分子(如蛋白质、多糖、脂类、有机溶剂等)的污染，使下游试验顺利进行。
【实验用品】1.材料：外周血2.器材：水浴锅、离心机、微量移液器、Tip头、Eppendorf管3.试剂：（1）细胞裂解液：（2）核裂解液（3）蛋白沉淀液（4）DNA溶解液（5）RNA酶（6）异丙醇（7）70%乙醇（8）TE缓冲液【实验步骤】1. 1.5ml离心管中加入300ul经抗凝处理的人全血，加入900ul细胞裂解液翻转5-6次混匀。
2.室温保存10分钟（其间翻转2-3次）裂解红细胞。
室温13000*g离心20秒，弃上清（会有约20ul残留液）。
3.涡旋震荡10-15秒（使细胞核充分重悬）。
加入300ul核裂解液，移液器抽吸5-6次混匀（此时溶液会变粘稠）。
37℃温浴10分钟。
4.加入100ul 蛋白沉淀液，涡旋震荡10-20秒。
5.室温13000*g离心3分钟。
可见到深褐色的蛋白沉淀。
6.将上清转移至1.5ml离心管中，加入300ul室温异丙醇。
7.轻柔翻转离心管，可观察到白色丝状物（即DNA）8.室温13000*g离心1分钟。
可见离心管底部有DNA白色沉淀物。
弃上清。
9.加入300ul 70%乙醇，轻柔翻转清洗DNA，室温13000*g离心1分钟。
血液中DNA提取的原理：如果以外周血为DNA提取材料，在外周血中提取DNA就是从有核的白细胞中提取DNA。
因此，从外周血中提取DNA包括以下几个关键步骤：第一，破坏红细胞，通常利用红细胞与白细胞膜结构的差异，先使红细胞裂解，经离心后收集白细胞；第二，白细胞裂解：使膜蛋白和核蛋白变性，游离DNA，通常是采用离子型表面活性剂使蛋白质变性；第三，除去变性蛋白质：通常采用蛋白沉淀剂沉淀变性蛋白质，使DNA留在上清液中；第四，在高盐环境下使DNA从有机溶剂如无水乙醇中析出。
取材取外周血5ml，EDTA抗凝1.新鲜抗凝血，离心弃去上清液；2.取出4℃冰箱预冷的ELS裂解液，按1:6-10的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液（1ml 细胞压积加入6-10ml裂解液），轻轻吹打混匀；红细胞裂解液ELS配方：NH4Cl:4.15克加双蒸水500ml,取450ml;Tris:1.0297克加双蒸水50ml,再加上上面的450ml,共计500ml,高压灭菌,用时加10-20ml3.800-1000rpm离心5-8分钟，离心弃去上层红色清液；4.收集沉淀部分，加入Hank’s液或无血清培养液离心洗2-3次；5.如裂解不完全可重复步骤2和3；6.重悬细胞，用于后续实验；提取DNA，最好是于步骤4开始使用DEPC水配制的溶液进行.酚氯仿方法提取DNA在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。
这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。
2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。
文章编号:1005-8982(2004)02-0070-03一种快速微量外周血基因组DNA的提取方法王龙武1,2,石 柯3,彭爱红2,张 志2,徐克前1(1.中南大学湘雅医学院检验系,湖南长沙410008;2.湖南省临床检验中心,长沙410008;3.中南大学湘雅医院,湖南长沙410008)摘要:目的 建立一种简便、快速、有效、微量外周血基因组DNA的提取方法。
方法 采用NaI作细胞裂解剂裂解细胞和细胞核,用氯仿∶异戊醇(24∶1)直接提取基因组DNA。
结果 该方法提取外周血基因组DNA 的纯度高A260nm/A280nm=(1.87±0.11),提取效率每毫升外周血可得DNA(31±3.12)μg。
结论 该法简便、快速、有效,适应于批量临床标本的处理。
关键词: 基因组DNA;碘化钠;外周血;提取中图分类号: R446.61 文献标识码: AA rapid and simple method for extracting hum an genomicDNA from peripheral bloodW ANGLong-wu1,2,SHI ke3,PE NG Ai-hong2,ZH ANG zhi2and X U K e-quan1(1.Department o f Clinical Lab,Xiangya Medical College,Changsha,Hunan410008,China;2.Departmet o f Clinical Lab o f Hunan Province,Changsha,Hunan410003,China;3.Xiangya o f Central South Univer sity,Changsha City,Hunan410008,China)Abstract: Objective:T o establish a rapid,sim ple,efficient method for extracting human genomic DNA from periph2 eral blood.Methods:peripheral blood is lysed by adding a chaotropic agent NaI,then genomic DNA is directly extracteded with chloroform:is oamyl alcohol(24∶1).R esults:The G enomic DNA extracted with this method is of large m olecular weight and A260/280=(1.87±0.11),(31±3.12)μg DNA can be gained from per milliliter peripheral blood.The results of PCR and restriction endonucleases digestion for the DNA are g ood.Conclusions:The me thod is sim ple,rapid,efficient and could be used to handle a largenumber of clinical sam ples.K ey w ords: G enomicDNA;s odium iodide;Peripheral blood;extractionC LC number: R446.61 Document code: A 基因分析的关键步骤,即基因组DNA提取和纯化一直是耗时,繁琐的过程,且自动化程度不高[1]。
外周血DNA提取技术方法一：1. 标本预处理：将1ml EDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml 磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500g离心15min,倾去含裂解红细胞上清。
重复一次。
用0.7ml DNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。
2. 消化：上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K 0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。
50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。
保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。
3. 酚抽提纯化DNA：上述反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。
5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。
重复酚抽提一次。
加等体积的氯仿﹕异戊醇（24﹕1），上下转动混匀，5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。
重复一次。
4. 加入1/5体积的3mol/L NaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。
用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5 ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，5000g离心5min洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。
重复一次。
室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。
加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24小时。
5. DNA的浓度测定及纯度判定：取DNA溶液用TE液做适量稀释，以TE液作空白对照，在紫外分光光度计上读取A260和A280的光密度值。
按下面公式计算浓度：DNA浓度(ug/ul)= A260*50*稀释倍数/1000DNA纯度的判定：A260/A280 比值应介于1.7-2.0之间。
方法二：分别采集外周静脉血5ml，2%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝待用(要求采血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶)。
外周血提取DNA及DNA电泳检测DNA电泳是一种常用的分子生物学技术，用于分析DNA样本的大小和纯度。
而外周血提取DNA则是从外周血样本中获取DNA的过程。
本文将介绍外周血提取DNA的步骤，并详细讲解DNA电泳的原理和操作方法。
一、外周血提取DNA外周血提取DNA是一种常用的DNA样本获取方法，适用于临床与实验室研究。
以下将按步骤介绍外周血提取DNA的过程。
1. 收集外周血样本：首先，使用抗凝剂处理外周血样本，以防止凝结。
通常使用EDTA作为抗凝剂，将其加入到试管中。
然后，用注射器采集外周血样本，并将其轻轻倒入带有抗凝剂的试管中。
2. 破坏红细胞膜：外周血样本中富含红细胞，需要将其破坏以释放DNA。
可以使用红细胞裂解液，如红细胞溶解液或混合液，加入到试管中，并轻轻摇晃样本混匀。
红细胞膜破坏后，红细胞内的DNA会被释放出来。
3. 沉淀DNA：通过离心过程，将DNA从样本中分离出来。
将试管放入离心机中，进行适当的离心操作，使DNA沉淀在离心管底部。
然后，将上清液去除，留下沉淀的DNA。
4. 洗涤DNA：使用酒精洗涤DNA，以去除杂质和残余污染物。
将酒精加入到含有DNA沉淀的离心管中，轻轻摇晃样本混匀，然后进行再次离心。
去除上清液，重复这个步骤。
5. 溶解DNA：最后，使用适量的溶解液将DNA溶解。
常用的溶解液为Tris-EDTA缓冲液。
加入适量的溶解液到离心管中，并轻轻摇晃样本混匀，使DNA完全溶解在溶液中。
二、DNA电泳检测DNA电泳是一种常用的DNA分析方法，可用于测量DNA分子的大小和纯度。
本节将介绍DNA电泳检测的原理和操作方法。
1. 准备电泳胶：首先，准备琼脂糖电泳胶。
将适量的琼脂糖加入到缓冲液中，加热搅拌溶解。
然后，将溶解的琼脂糖缓冲液倒入电泳槽中，并插入电极。
2. 加载DNA样本：取一定量的DNA样本，并将其与DNA标记物混合。
然后，将混合物缓慢地加入到电泳槽中的样本槽中。
注意不要漏掉样本，以避免结果的偏差。
专利名称：外周血单核细胞基因组DNA的提取方法专利类型：发明专利
发明人：辛竹
申请号：CN201310537799.3
申请日：20131105
公开号：CN103614364A
公开日：
20140305
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了外周血单核细胞基因组ＤＮＡ的提取方法，其特征在于，步骤如下：首先，取目的淋巴细胞，其中注入所需缓冲液GA，震荡至彻底悬浮；加入PA，100毫升，高速离心振荡至少半分钟，然后在35摄氏度的环境下静置3-5分钟；加入蛋白酶，颠倒混匀，放置10分钟后，再次颠倒混匀，反复三到四次；加入缓冲液，吹打混匀；加入纯无水乙醇；注入离心管中，高速离心，去除沉淀物；将沉淀物吸附出来；沉淀物种加入漂洗也，然后弃上清；采用分光光度计即可进行测定ＲＮＡ纯度；在进行鉴定浓度之前，需要在先在零下十度的环境下放置三到五分钟；所述测定浓度之前，可以向其中央滴入三到四滴洗脱缓冲液。
本发明的有益效果是：操作简单，成本较低，为肿瘤免疫治疗提供新的思路、方法和途径，同时可以促进免疫杀伤作用。
申请人：辛竹
地址：116000 辽宁省大连市西岗区中山路222号血液净化中心
国籍：CN
更多信息请下载全文后查看。
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811175820.9(22)申请日 2018.10.10(71)申请人 南通中科基因医学检验所有限公司地址 226100 江苏省南通市海门市临江新区生物医药科技创业园A9号(72)发明人 陆军 姜昕 刘慧君 董新波 (74)专利代理机构 南京正联知识产权代理有限公司 32243代理人 卢海洋(51)Int.Cl.C12N 15/10(2006.01)(54)发明名称一种外周血基因组DNA快速提取方法(57)摘要本发明提供了一种外周血基因组DNA快速提取方法，包括如下步骤：1）取100-150μL血液样品，加入200-250μL Lysis Buffer和20-35μLProteinase K的预混溶液，充分颠倒混匀，60℃放置10min，95℃放置10min，期间颠倒混匀数次；2）室温放置2-5min后，12000rpm离心2min，取50μL左右上清；3）将90-92μL磁珠加入至装有上述上清的PCR管中，轻轻吹打混匀6次，室温静置孵育5-10min，将PCR管置于磁力架上3-5min。
本发明具有如下技术效果：1）本发明在整个DNA的提取过程中只涉及了3种试剂，且试剂使用量和样品需求量均较低，因此成本较低；2）整个提取过程耗时较短，每一个步骤简单明确，对PCR的扩增效果影响较小；3）通过实际项目验证，采用该方法提取的DNA ，符合绝大部分PCR反应以及MassARRAY平台的检测。
权利要求书1页 说明书3页CN 109207474 A 2019.01.15C N 109207474A1.一种外周血基因组DNA快速提取方法，其特征在于，包括如下步骤：1）取100-150μL血液样品，加入200-250μL Lysis Buffer和20-35μL Proteinase K的预混溶液，充分颠倒混匀，60℃放置10min，95℃放置10min，期间颠倒混匀数次；2）室温放置2-5min后，12000rpm离心2min，取50μL左右上清；3）将90-92μL磁珠加入至装有上述上清的PCR管中，轻轻吹打混匀6次，室温静置孵育5-10min，将PCR管置于磁力架上3-5min；4）移除上清，将PCR管继续放置于磁力架上，向PCR管中加入300-350μL 75%乙醇溶液，静置30S；5）移除上清，再向PCR管中加入300-350μL 75%乙醇溶液，静置30S后彻底移除上清；6）室温静置2-5min，使残留乙醇彻底挥发；7）加入10-12μL的Nuclease free water ，把PCR管从磁力架取下，轻轻吹打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2-3min；8）将PCR管置于磁力架上2min；9）用移液器吸取10-11μL上清液，转移到新的PCR管中，在反应管上标记样本编号。
一种碘化钾提取外周血基因组DNA的方法
赵书平;张俊洁;尤建
【期刊名称】《中华医学遗传学杂志》
【年(卷),期】1999(016)006
【摘要】目的建立外周血基因组ＤＮＡ的快速提取方法。
方法用碘化钾直接从外周血中提取基因组ＤＮＡ。
结果用该方法的取的ＤＮＡ为大分子量ＤＮＡ；Ａ２６０／Ａ２８０为１．８５，Ａ２６０／Ａ２３０为２．２；提取效率大于９０％；ＤＮＡ体外扩增结果良好。
结论该方法简便，快速，经济，可用于大量临床标本的研究。
【总页数】1页(P395)
【作者】赵书平;张俊洁;尤建
【作者单位】解放军第88医院中心实验室;上海长海医院妇产科
【正文语种】中文
【中图分类】R394－33
【相关文献】
1.改良碘化钾法提取冻存外周血基因组 DNA 的方法探讨
2.酚/氯仿法和盐析法提取人类外周血基因组DNA方法的比较
3.经济、有效提取外周血基因组DNA的方法
4.人类外周血基因组DNA提取方法的比较分析
5.一种快速微量外周血基因组DNA的提取方法
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
