脂蛋白相关磷脂酶A2Lp-PLA2

心血管疾病治疗新目标：脂蛋白相关磷脂酶A2陈芡茹【摘要】在冠状动脉粥样硬化病变的发展和转归中,炎症被认为是一种重要因素.虽然有研究证实多种炎症指标如超敏C反应蛋白和白介素等与冠状动脉斑块的易损性相关,但此类指标均为非特异性;人血浆脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)是一种由炎症细胞产生、存在于粥样硬化斑块中特有的蛋白酶,越来越多的证据表明,Lp-PLA2对炎症的高特异性和低生物差异性使其成为评价斑块易损性的一个“理想指标”,其在血清中的增加与心血管事件密切相关.而且,Lp-PLA2已被认为是一种动脉粥样硬化的特异性药物治疗中的靶向目标,可通过间接(他汀类药物、阿司匹林、p 受体阻滞剂)或直接药物(Lp-PLA2抑制剂darapladib)降低血清Lp-PLA2水平进而改善冠心病患者的临床预后.现主要介绍各种药物降低血清Lp-PLA2水平的作用机理及临床研究进展.【期刊名称】《心血管病学进展》【年(卷),期】2016(037)002【总页数】5页(P188-192)【关键词】脂蛋白相关磷脂酶A2;炎症;动脉粥样硬化;药物治疗【作者】陈芡茹【作者单位】南京医科大学附属南京医院南京市第一医院心血管内科,江苏南京210000【正文语种】中文【中图分类】R541.4动脉粥样硬化是一种全身系统、多因素介导的疾病，主要表现为心脑血管的临床事件(如急性冠状动脉综合征、心肌梗死和脑血栓形成等)。

炎症是促进动脉粥样硬化斑块形成、发展和由此促发心脑血管事件等致命并发症的关键途径[1]，高风险易损斑块的特征是大的脂质坏死核心、大量炎症细胞聚集(巨噬细胞、T淋巴细胞和肥大细胞)和薄的纤维帽，而人血浆脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)高表达在脂质坏死核心中，围绕在薄纤维帽和破裂斑块的巨噬细胞周围，被认为有促进斑块不稳定的潜在作用[2]。

大量证据表明Lp-PLA2是一种独立于传统心血管疾病危险因素如高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和超敏C反应蛋白(hs-CRP)之外的风险指标[3]。

血浆脂蛋白相关磷脂酶A2的研究进展于波心;张亚杰;王佳贺【摘要】精准医疗可依靠于生物标志物将疾病预防、诊断和治疗分类.近年来,血浆脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)已成为一个新型血管炎症生物标志物,Lp-PLA2与心脑血管疾病有密切联系,它通过与低密度脂蛋白(LDL)结合等一系列复杂的作用机制,促进了动脉粥样硬化的发生和发展.Lp-PLA2作为动态指标,可与其他传统炎症指标联合,从而反映血管炎症程度,预测动脉粥样硬化及其他心脑血管疾病的进展水平.Lp-PLA2也可以成为一个重要的治疗靶点,在预防、诊断、危险分层和个体化精准治疗中起到重要作用.【期刊名称】《实用医学杂志》【年(卷),期】2018(034)008【总页数】3页(P1394-1396)【关键词】血浆脂蛋白相关磷脂酶A2;动脉粥样硬化;作用机制;炎性标记物【作者】于波心;张亚杰;王佳贺【作者单位】中国医科大学附属盛京医院老年病科沈阳110004;中国医科大学附属盛京医院急诊科沈阳110004;中国医科大学附属盛京医院老年病科沈阳110004【正文语种】中文近年来研究表明，血浆脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp⁃PLA2）已成为心脑血管疾病领域中的一种新型炎性标志物，它在动脉粥样硬化的形成、发展过程中起到了重要的作用［1-2］。

相比于传统的炎性标记物，如C⁃反应蛋白（C⁃re⁃active protein，CRP）和白细胞介素（interleukin，IL）等，Lp⁃PLA2具有早期识别、高度特异性和检测简便等特点。

Lp⁃PLA2不仅可以在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）中反映斑块的稳定性、炎症的病变程度，而且在缺血性脑梗死、急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）、心力衰竭、代谢综合征等疾病中亦具有重要的临床指导意义［3⁃5］。

因此，本文将从 Lp⁃PLA2 的概念、作用机制及临床意义等方面进行阐述。

脂蛋白相关的磷脂酶A2 临床应用中国专家建议要点总结主要内容脂蛋白相关的磷脂动脉粥样硬化性心脏病是心血管疾病中首要致死和致残原因。

除血脂异常外，炎症和氧化应激也是动脉粥样硬化病理生理发生和发展的重要机制。

目前，国内外指南均建议采用传统危险因素为基础的模型预测动脉粥样硬化性心血管疾病的短期和长期风险。

与C- 反应蛋白（CRP）不同，脂蛋白相关的磷脂酶A2（LP-PLA2）是具有血管特异性的炎症标志物，研究发现Lp-PLA2 为冠心病和缺血性卒中的独立危险因素。

新近美国FDA 批准其用于预测冠心病和缺血性卒中风险。

这次长城五洲国际心血管病会上发布了《脂蛋白相关磷脂酶A2 临床应用中国专家建议》，现总结要点如下：Lp-PLA2 的生物学特性Lp-PLA2 是磷脂酶超家族中的亚型之一，也是被认为是血小板活化因子乙酰水解酶，由于血管内膜中的巨噬细胞、T 细胞和肥大细胞分泌。

动脉粥样硬化斑块中Lp-PLA2 表达上调，并且在易损斑块纤维帽的巨噬细胞中强表达。

Lp-PLA2 可水解ox-LDL 中的氧化磷脂，生成脂类促炎物质，如溶血卵磷脂和氧化游离脂肪酸，进而产生多种致动脉粥样硬化作用，包括内皮细胞死亡和内皮功能异常，刺激粘附因子和细胞因子的产生。

这些物质可通过趋化炎症细胞进一步产生自我强化的循环，产生更多促炎物质。

Lp-PLA2 的临床检测1. Lp-PLA2 测定方法临床上推荐测定 Lp-PLA2 质量来反映 Lp-PLA2 水平，目前已有可供临床检测使用的商业化试剂盒。

Lp-PLA2 基本不受体位改变和日常活动的影响，故标本采集时无需固定体位和时间，但测定前2 h 应避免剧烈运动。

Lp-PLA2 监测样本可采用EDTA-K2/ 肝素抗凝血浆、枸橼酸钠抗凝血浆及血清均可。

抽血后尽快分离出血浆（清）并及时进行测定，标本2-8 摄氏度可保存一周，-20 摄氏度可贮存3 个月。

2. Lp-PLA2 的参考区间Lp-PLA2 水平受性别和种族影响，国外报道成人血清 Lp-PLA2 参考区间为男性131-376（平均为251）ng/ml, 女120-342（平均为174）ng/ml，（PLAC 法）。

脂蛋白相关磷脂酶a2和磷脂酶a2
脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）和磷脂酶A2（PLA2）都是与
脂质代谢和炎症相关的酶。

首先，让我们从生物学角度来看这两种酶。

磷脂酶A2是一类酶的总称，它在细胞膜中催化磷脂酰胆碱的水解，产生游离的脂肪酸和溶血磷脂酰胆碱。

这些游离脂肪酸和溶血
磷脂酰胆碱在炎症和动脉粥样硬化等疾病中起着重要作用。

而脂蛋
白相关磷脂酶A2是一种血浆酶，主要与低密度脂蛋白（LDL）结合，它在动脉粥样硬化的形成和斑块不稳定性中发挥重要作用。

接下来，我们从临床角度来看这两种酶。

磷脂酶A2的活性与心
血管疾病的发生和发展密切相关。

高水平的磷脂酶A2活性与动脉粥
样硬化斑块的不稳定性和心脑血管事件的发生风险增加有关。

因此，磷脂酶A2活性已成为心血管疾病的生物标志物之一。

而脂蛋白相关
磷脂酶A2作为一种血清标志物，也被广泛用于心血管疾病的风险评
估和预后判断。

此外，从药物研发角度来看，这两种酶也成为潜在的药物靶点。

针对磷脂酶A2的抑制剂已被研究用于治疗动脉粥样硬化等疾病，而
针对脂蛋白相关磷脂酶A2的抑制剂也被认为具有潜在的治疗作用。

总的来说，磷脂酶A2和脂蛋白相关磷脂酶A2在生物学、临床和药物研发等方面都具有重要意义，对于疾病的发生发展以及治疗具有重要的指导意义。

希望这些信息能够全面回答你的问题。

脂蛋白相关磷脂酶A2脂蛋白相关磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase2,Lp-PLA2)，亦称血小板活化因子乙酰水解酶（PAF-AH），由PLA2G7基因编码的441个氨基酸组成，分子量约为45 kDa。

Lp-PLA2经成熟的巨噬细胞和淋巴细胞合成和分泌，并受炎性介质的调节，具有促炎症和促动脉粥样硬化的作用。

近年来越来越多的证据表明其具有促进动脉粥样硬化(AS)的作用，是AS中的一种新的炎性反应标志物。

Lp-PLA2在血液中的浓度可动态地反映动脉粥样斑块的炎症程度，浓度越高风险越大。

此外，检测血中Lp-PLA2水平可以用来识别冠心病的高危个体，根据Mayo Medical Laboratories的研究，当血液中Lp-PLA2浓度高于235ng/mL，提示心肌梗死、冠心病和缺血性脑卒中等心血管疾病的发生的风险。

Lp-PLA2为反映动脉粥样硬化斑块破裂及血栓形成事件的独立风险因子，与其具有高度一致性及精确性，是急性动脉粥样硬化血栓复发事件高风险患者的准确风险评估标志物。

人Lp-PLA2单克隆抗体科赛格最新推出一批高质量的抗人Lp-PLA2单克隆抗体，其中4株抗体能够用于高灵敏度的双抗夹心法免疫检测。

利用我公司化学发光检测平台对自产抗体对进行表征，显示其检测范围广，灵敏度高。

检测范围约为0.13-1000ng/mL，最低检出限可达0.13ng/mL。

将所推荐的抗体对经过大量的正常血清样本、贫血样本和炎症病理样本测试，临床检测结果显示符合率高。

性质参数靶标种属人类宿主Balb/c小鼠融合细胞Sp2/0免疫原人脂蛋白相关磷脂酶A2纯化方式Protein G亲和纯化保存缓冲液磷酸盐缓冲液（pH7.4）应用范围化学发光法，胶乳增强免疫比浊法等货号CSB-DA113BmN①, CSB-DA113BmN③, CSB-DA113BmN④, CSB-DA113BmN⑤.校准曲线所有的单克隆抗体分别用作捕获抗体和标记抗体，然后组合成不同抗体对，用于双抗夹心法免疫检测。

小鼠脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)水平。

用纯化的小鼠脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)，再与HRP标记的Lp-PLA2抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)浓度。

试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：13.5µg/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

血浆脂蛋白相关磷脂酶A2研究进展【摘要】血浆脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）在动脉粥样硬化的形成、发展过程中已成为一个新型血管炎症生物标志物，并对动脉粥样硬化有促动作用。

它与心脑血管等疾病的关系是近年来的研究热点，但也存在一定争议。

本文将从Lp-PLA2的结构、作用机制、与传统炎症因子的比较、与心血管疾病及其他疾病的相关性等方面做一综述。

【关键词】血浆脂蛋白相关磷脂酶 A2，动脉粥样硬化，相关性近年来，血浆脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）在动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）的形成、发展过程中已成为一个新型血管炎症生物标志物，并对动脉粥样硬化有促动作用。

本文将从Lp-PLA2的结构、作用机制、与传统炎症因子的比较、与心脑血管疾病及其他疾病的相关性等方面进行阐述。

一、Lp-PLA2的结构Lp-PLA2是水解磷脂酶超家族的一员，是一个50kD的钙独立磷脂酶，具有441个氨基酸的丝氨酸酯酶，由于其可以降解血小板活化因子（PAF），因此又被称为血小板活化因子乙酰水解酶（PAF-AH），是由成熟的巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞等细胞合成，分泌入血后主要与富含ApoB的脂蛋白结合，主要是低密度脂蛋白（LDL-C），有80%与其结合[1]，随着LDL-C转运到血管壁易受损区域，对其进行水解氧化，产生强烈的致炎因子[2]，诱导血管内皮细胞合成释放细胞因子，促进单核细胞聚集并移行入血管内膜，并进一步分化为巨噬细胞、泡沫细胞，导致和促进粥样斑块形成[3]。

二、Lp-PLA2的作用机制Lp-PLA2在动脉粥样硬化进展中发挥作用是由于它有促炎及抗炎的双重作用[4]。

Lp-PLA2可以刺激机体产生大量的细胞因子，导致单核细胞进一步的蓄积并演变为巨噬细胞，摄入Ox-LDL，产生泡沫细胞，泡沫细胞聚集成动脉粥样硬化斑块，并引起血管舒缩功能障碍，损害血管内皮细胞，形成AS斑块，脆弱的斑块破裂易致血栓形成；同时巨噬细胞对Lp-PLA2有反馈调节作用，诱导产生更多的Lp-PLA2，因此形成恶性循环，促使动脉粥样硬化的进展。

脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）测定试剂盒（速率法）适用范围：该产品用于体外定量测定人血清或血浆中脂蛋白相关磷脂酶A2的浓度。

1.1 产品规格1.2 组成成分1.2.1 试剂组成试剂1：磷酸盐缓冲液（pH=7.6）50mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）2mmol/L试剂2a：缓冲液pH2.7 100mmol/L试剂2b：1-肉豆蔻酰-2-（4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱50mmol/L1.2.2校准品的组成校准品为液体，校准品组成是在磷酸盐缓冲液中加入含一定浓度的脂蛋白相关磷脂酶A2纯品。

1个水平校准品目标浓度为900U/L，浓度有批特异性，具体定值详见瓶签。

1.2.3质控品的组成两水平液体质控品，在牛血清(20g/L)中加入脂蛋白相关磷脂酶A2纯品。

靶值范围分别为：（200～600） U/L、（600～1200）U/L。

2.1 外观试剂 1 为无色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物；试剂 2a 为无色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物；试剂 2b为无色至淡黄色液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物；校准品：无色至淡黄色澄清液体；质控品：无色至淡黄色澄清液体。

2.2 净含量液体试剂的净含量不得低于标示体积。

2.3 试剂空白2.3.1试剂空白吸光度试剂空白吸光度应≤1.000；2.3.2试剂空白吸光度变化率空白吸光度变化率（ΔA/min）应≤0.01。

2.4 分析灵敏度测定分析灵敏度：浓度为800U/L时，吸光度变化应≥0.01。

2.5 试剂测定线性测试血清样本，测试血清样本，试剂线性在[50，1600]U/L范围内，线性相关系数（r）应不小于0.990；测定结果在[50，500]U/L时绝对偏差不超过±75U/L；在（500，1600]U/L范围内的相对偏差不超过±15%。

2.6 重复性试剂盒测试项目重复性 CV≤10%。

2.7 批间差不同批号之间测定结果的相对极差应≤15%。

脂蛋白相关性磷脂酶A2促进血管平滑肌细胞泡沫化机制的研究梁荣珍,王太成,林德文,殷雪娇,林莉摘要目的:探究脂蛋白相关性磷脂酶A2(LP-PLA2)在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)作用下的血管平滑肌细胞(VSMC)泡沫化中的作用及其相关分子途径㊂方法:采用组织块贴壁法分离小鼠原代主动脉VSMC,α-肌动蛋白(α-SAM)标记的免疫荧光染色进行鉴定;采用脂质体转染技术将过表达LP-PLA2质粒(oe-LP-PLA2)与阴性对照质粒(oe-NC)转染入细胞中,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)与蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测转染后细胞中LP-PLA2mRNA和蛋白表达水平;采用ox-LDL和大胞饮抑制剂LY294002处理VSMC,并将细胞分为4组,正常培养的control组,ox-LDL处理的转染oe-LP-PLA2细胞的ox-LDL+oe-LP-PLA2组㊁ox-LDL+oe-NC组㊁联合使用ox-LDL和LY294002处理的转染oe-LP-PLA2细胞的ox-LDL+oe-LP-PLA2+LY294002组㊂油红O染色检测各组VSMC中脂质聚积水平,试剂盒检测细胞内总胆固醇含量,酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)㊁白细胞介素-6(IL-6)和单核细胞趋化因子-1(MCP-1)的表达水平,DCFH-DA法检测各组VSMC细胞中活性氧(ROS)含量,Western Blot检测各组细胞中LP-PLA2和泡沫化信号通路中固醇酰基转移酶1(ACA Tl)㊁细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)/应激活化蛋白激酶(SAPK)蛋白的表达水平㊂结果:成功分离了原代VSMC,且α-SAM标记的阳性细胞比率达95%以上;与control组比较,转染oe-LP-PLA2质粒后细胞中LP-PLA2mRNA和蛋白表达水平均升高(P<0.01);与control组比较,ox-LDL+oe-NC组㊁ox-LDL+oe-LP-PLA2组和ox-LDL+oe-LP-PLA2+LY294002组细胞的油红O染色阳性面积㊁细胞中总胆固醇含量㊁细胞上清液中TNF-α㊁IL-6㊁MCP-1的表达水平和细胞中活性氧含量均增加(P<0.05或P<0.01);与ox-LDL+oe-NC 组比较,ox-LDL+oe-LP-PLA2组油红O染色阳性面积㊁细胞中总胆固醇含量㊁细胞上清液中TNF-α㊁IL-6㊁MCP-1的表达水平和细胞中活性氧含量均增加(P<0.05);与ox-LDL+oe-LP-PLA2组比较,ox-LDL+oe-LP-PLA2+LY294002组中上述检测指标均降低(P<0.05); Western Blot检测结果显示,与control组比较,ox-LDL+oe-NC组㊁ox-LDL+oe-LP-PLA2组和ox-LDL+oe-LP-PLA2+LY294002组中LP-PLA2㊁ACATl㊁ERK1/2和JNK/SAPK蛋白表达均升高(P<0.05或P<0.01);与ox-LDL+oe-NC组比较,ox-LDL+oe-LP-PLA2组LP-PLA2㊁ACATl㊁ERK1/2㊁JNK/SAPK蛋白表达水平升高(P<0.05),ox-LDL+oe-LP-PLA2+LY294002组中除LP-PLA2升高外(P< 0.05),其他蛋白表达水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);与ox-LDL+oe-LP-PLA2组比较,ox-LDL+oe-LP-PLA2+LY294002组细胞中ACATl㊁ERK1/2㊁JNK/SAPK蛋白表达水平均降低(P<0.05)㊂结论:上调LP-PLA2表达可通过大胞饮机制促进ox-LDL作用下的VSMC的泡沫化进程,而这可能与ERK和JNK/SAPK通路的表达上调有关㊂关键词脂蛋白相关性磷脂酶;血管平滑肌细胞;泡沫细胞;氧化型低密度脂蛋白;大胞饮;小鼠;实验研究d o i:10.12102/j.i s s n.1672-1349.2023.15.012动脉粥样硬化是导致包括冠状动脉阻塞在内的多种心血管疾病的主要病因[1]㊂在动脉粥样硬化过程中,泡沫细胞在内皮下的不断形成与累积及其坏死所引发的炎症反应,加剧了斑块的不稳定性,从而诱导冠状动脉阻塞,导致急性心肌梗死等心血管疾病的发生[2]㊂既往研究表明,巨噬细胞是泡沫细胞的主要来源,但越来越多的数据表明,特定环境下发生表型改变的血管平滑细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)不仅具有巨噬细胞的特征,同时也能在细胞内积聚胆固醇,且在中晚期的动脉硬化中,VSMC是斑块基金项目海南省卫生健康行业科研项目(No.20A200521)作者单位海南医学院第二附属医院(海口570311)通讯作者林莉,E-mail:*********************引用信息梁荣珍,王太成,林德文,等.脂蛋白相关性磷脂酶A2促进血管平滑肌细胞泡沫化机制的研究[J].中西医结合心脑血管病杂志, 2023,21(15):2777-2784.中泡沫细胞和炎症反应的主要来源[3]㊂这提示在动脉粥样硬化中,VSMC同样具有泡沫样变的能力㊂尽管一些清道夫受体参与了泡沫细胞形成过程中的脂质摄取,但导致VSMC发生泡沫化的具体机制尚未明确㊂脂蛋白相关性磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2,LP-PLA2)又称血小板活化因子乙酰水解酶,其主要来源于巨噬细胞㊁单核细胞㊁泡沫细胞等炎性细胞的分泌[4]㊂LP-PLA2可与低密度脂蛋白(LDL)结合,促进动脉粥样硬化的炎症反应与氧化应激,并导致内皮细胞的结构与功能破坏,加速斑块的形成与发展[5]㊂然而,关于LP-PLA2是否参与VSMC泡沫样变及其具体作用尚未明确㊂因此,本研究通过探讨LP-PLA2在VSMC泡沫化中的作用,旨在进一步揭示动脉粥样硬化的发生机制㊂1材料与方法1.1主要试剂与仪器无特定病原体(SPF)级雄性4周龄C57BL/6小鼠6只,体质量(16.0ʃ1.5)g,购自海南药物研究所有限责任公司㊂大鼠抗小鼠α-SAM抗体(美国Abacm公司);FITC标记的山羊抗兔二抗(美国BD公司);过表达LP-PLA2质粒(oe-LP-PLA2)与阴性对照质粒(oe-NC) (广州锐博生物公司);大胞饮抑制剂LY294002㊁氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)㊁DCFH-DA试剂盒㊁胆固醇检测量试剂盒(美国Sigma 公司);Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(美国Applied Biosystems公司);TRIzol试剂㊁反转录试剂盒(美国Invitrogen公司);Lipofectamine2000试剂(美国Thermo公司);二喹啉甲酸法(BCA)蛋白定量试剂盒㊁肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)㊁白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattractant protrin-1, MCP-1)表达的酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(江苏碧云天生物技术公司);大鼠抗LP-PLA2㊁固醇酰基转移酶1(cholesterol acyltransferases1,ACATl)㊁细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular-signal regulated kinase1/2,ERK1/2)㊁c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase,JNK)/应激活化蛋白激酶(stress activated protein kinase,SAPK)和β-actin抗体(美国Cell Signaling Technology公司);辣根过氧化物酶标记的兔抗大鼠二抗(美国Jackson ImmunoResearch公司);实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)引物设计与合成(上海生工生物工程有限公司)㊂细胞培养箱(MCO-175型,日本三洋公司);紫外分光光度计(Du-640型,美国Beckman公司);荧光显微镜(DM IL LED型,德国Lecia公司)㊂1.2小鼠原代主动脉VSMC的培养和鉴定参考文献[6]方法分离培养小鼠原代主动脉VSMC㊂解剖小鼠主动脉,并除去外膜和内皮组织,将血管中膜剪成1mmˑ1mmˑ1mm大小,并置入培养瓶中使用含20%FBS和1%青链霉素-抗真菌剂的DMEM/F12培养基,在37ħ㊁5%CO2培养箱中培养㊂培养至5~7d时组织块边缘可见有VSMC爬出,10d 时VSMC可融合生长㊂使用含EDTA的0.25%胰蛋白酶进行常规消化并传代进行扩大培养,取传至3代以后的VSMC进行后续相关实验㊂采用针对平滑肌的特异性抗体α-SAM进行鉴定VSMC㊂取生长良好的VSMC,常规消化后接种于载玻片上,37ħ㊁5%CO2培养箱中培养,待细胞贴壁后,弃原培养液,4%多聚甲醛溶液固定细胞,Triton X-100破膜,加入α-SAM抗体(1ʒ200),4ħ下孵育过夜,次日加入FITC标记的荧光二抗(1ʒ500),室温下避光孵育1h,加入DAPI试剂进行染核,最后加入防荧光猝灭剂封片,荧光显微镜下观察拍照㊂1.3细胞转染和分组取生长状态良好的VSMC,常规消化后,调整细胞密度,按2ˑ105个/孔接种于6孔板中,待细胞生长融合至70%时,按转染试剂Lipofectamine2000操作说明书方法将oe-LP-PLA2质粒及阴性对照质粒oe-NC 转染入VSMC中㊂取转染48h的细胞,用于后续实验㊂取转染后的细胞,按处理方式的不同将VSMC分为4组:正常培养的control组,采用100μg/mL ox-LDL处理的转染oe-LP-PLA2的ox-LDL+oe-LP-PLA2组和ox-LDL+oe-NC组,联合使用100μg/mL ox-LDL 与33μmol/L LY294002处理的转染oe-LP-PLA2的x-LDL+oe-LP-PLA2+LY294002组㊂ox-LDL与LY294002的使用浓度参考文献[7-8]㊂上述各组细胞置于37ħ㊁5%CO2培养箱中培养24h后用于后续实验检测㊂1.4油红O染色取各组VSMC,弃原培养液,磷酸缓冲盐溶液(PBS)充分洗涤细胞后采用4%多聚甲醛于室温下固定30min,PBS再次洗涤,加入油红O工作液在室温下进行染色30min,蒸馏水洗涤细胞,随后在倒置显微镜下观察,每组至少随机选取5个低倍率视野进行拍照㊂Image J软件对细胞中的红色脂滴面积进行计算分析㊂1.5细胞内总胆固醇的测定取各组VSMC,按试剂盒操作说明书方法采用异丙醇提取细胞内脂质成分,并使用耦合酶测定法测定细胞内总胆固醇(total cholesterol,TC)含量㊂实验单独重复3次㊂1.6ELISA检测炎性因子TNF-α㊁IL-6㊁MCP-1含量取各组VSMC上清液,4ħ下1000r/min离心10 min后,按照ELISA试剂盒使用说明书方法检测上清液中TNF-α㊁IL-6和MCP-1含量㊂实验单独重复3次㊂1.7DCFH-DA法检测活性氧(ROS)水平取各组VSMC,使用DCFH-DA法检测细胞中ROS含量㊂根据DCFH-DA试剂盒说明书方法,加入含10mmol/L的DCFH-DA工作液在37ħ下避光孵育30min后,PBS溶液充分洗涤细胞后,荧光显微镜下观察绿色荧光强度㊂1.8RT-PCR检测细胞中LP-PLA2mRNA表达水平用TRIzol试剂提取待测细胞中的总RNA,按照反转录试剂盒说明书方法进行合成cDNA㊂使用Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒在StepOne系统进行RT-PCR㊂LP-PLA2引物序列,正向引物: 5'-CGGATTGATGAGATGCCTGA-3',反向引物: 5'-CTTGTTGGGCTTGCCAAACT-3';β-actin-引物序列,正向引物:5'-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3,反向引物:5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'㊂以β-actin为内参基因,采用2-әәCt方法分析LP-PLA2 mRNA的相对表达水平,并将其与对照组进行标准化处理㊂实验单独重复3次㊂1.9蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测细胞中泡沫化信号通路相关蛋白的表达采用细胞裂解液在冰上裂解待测细胞,离心后收集总蛋白㊂用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度㊂将等量的蛋白样品置于15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离,并转移到聚偏氟乙烯膜上㊂膜在室温下用5%脱脂奶粉封闭1h,然后加入一抗: LP-PLA2(1ʒ500)㊁ACA Tl(1ʒ800)㊁ERK1/2(1ʒ800)㊁JNK/SAPK(1ʒ800)和β-actin(1ʒ1000),4ħ下孵育过夜,在三乙醇胺缓冲盐溶液(TBS)中洗涤后,在室温下与辣根过氧化物酶偶联的二抗(1ʒ5000)孵育2h㊂最后,在Tanon-5500化学发光成像系统中进行蛋白条带灰度成像并拍照,应用Image J软件进行定量㊂以β-actin为内参,分析目的蛋白表达水平㊂实验单独重复3次㊂1.10统计学处理采用SPSS21.0和GraphPad Prism6.0软件进行数据分析㊂符合正态分布的定量资料以均数ʃ标准差(xʃs)表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1原代VSMC的鉴定光镜观察结果显示,采用组织块贴壁法培养至5~ 7d时可见有VSMC从组织块边缘爬出,10d左右时VSMC可融合生长,呈多角形㊁梭形或不规则形(见图1)㊂免疫荧光染色结果表明,VSMC显示出α-SAM标记的绿色荧光,且阳性细胞比例达95%以上(见图2)㊂上述结果提示,本实验分离培养的细胞为VSMC,且纯度可满足后续实验要求㊂图1光镜下观察VSMC的细胞形态(ˑ40)图2原代VSMC的免疫荧光鉴定(Bar=100μm) 2.2转染后VSMC中LP-PLA2的表达RT-PCR与Western Blot法检测转染后VSMC中LP-PLA2mRNA和蛋白表达的结果显示,与control组比较,转染oe-LP-PLA2质粒后细胞中LP-PLA2 mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.01),而转染oe-NC的细胞中无明显变化(P>0.05)㊂详见图3~图5㊂图3转染后VSMC中LP-PLA2mRNA表达水平(与control组比较,*P<0.01)图4转染后VSMC中LP-PLA2蛋白表达条带图图5各组VSMC中LP-PLA2蛋白表达水平(与control组比较,*P<0.01)2.3过表达LP-PLA2对VSMC源性泡沫细胞形成的影响油红O染色结果显示,细胞形态增大变圆,胞核突出,胞质内出现大量红色脂滴,并呈 戒环 状聚集在细胞周边,符合VSMC泡沫样变㊂与control组比较, ox-LDL+oe-NC组㊁ox-LDL+oe-LP-PLA2组和ox-LDL+oe-LP-PLA2+LY294002组细胞的油红O阳性面积明显增加(P<0.01);与ox-LDL+oe-NC组比较,ox-LDL+oe-LP-PLA2组油红O阳性面积明显增加(P<0.05);与ox-LDL+oe-LP-PLA2组比较, ox-LDL+oe-LP-PLA2+LY294002组油红O阳性面积明显减少(P<0.05)㊂详见图6㊁图7㊂图6各组VSMC的油红O染色结果图(ˑ200)图7各组VSMC油红O染色的定量分析(与control组比较,*P<0.01;与ox-LDL+oe-NC组比较,#P<0.05;与ox-LDL+oe-LP-PLA2组比较,әP<0.05)细胞内总胆固醇含量测定结果表明,与control组比较,ox-LDL+oe-NC组㊁ox-LDL+oe-LP-PLA2组和ox-LDL+oe-LP-PLA2+LY294002组VSMC中总胆固醇含量升高(P<0.01);与ox-LDL+oe-NC组比较, ox-LDL+oe-LP-PLA2组总胆固醇含量升高(P<0.05),但ox-LDL+oe-LP-PLA2+LY294002组无改变(P>0.05);与ox-LDL+oe-LP-PLA2组比较,ox-LDL+ oe-LP-PLA2+LY294002组VSMC中总胆固醇含量降低(P<0.05)㊂详见图8㊂图8各组VSMC中总胆固醇含量检测(与control组比较,*P<0.01;与ox-LDL+oe-NC组比较,#P<0.05;与ox-LDL+oe-LP-PLA2组比较,әP<0.05)2.4过表达LP-PLA2对VSMC源性泡沫细胞炎症与氧化应激的影响ELISA检测结果显示,与control组比较,ox-LDL+ oe-NC组㊁ox-LDL+oe-LP-PLA2组和ox-LDL+oe-LP-PLA2+LY294002组上清液中TNF-α㊁IL-6㊁MCP-1含量升高(P<0.05或P<0.01);与ox-LDL+oe-NC 组比较,ox-LDL+oe-LP-PLA2组TNF-α㊁IL-6㊁MCP-1含量升高(P<0.05);与ox-LDL+oe-LP-PLA2组比较,ox-LDL+oe-LP-PLA2+LY294002组中TNF-α㊁IL-6㊁MCP-1含量降低(P<0.05)㊂详见表1㊂表1ELISA检测各组VSMC中TNF-α㊁IL-6和MCP-1含量(xʃs)单位:pg/mL 组别样本量TNF-αIL-6MCP-1 control组321.18ʃ7.1314.16ʃ5.2249.62ʃ11.25 ox-LDL+oe-NC组347.40ʃ10.65①56.39ʃ9.96①115.47ʃ17.16②ox-LDL+oe-LP-PLA2组389.91ʃ12.04①③122.71ʃ14.37①③278.66ʃ23.01②③ox-LDL+oe-LP-PLA2+LY294002组350.07ʃ8.26①③④52.37ʃ9.11①③④109.34ʃ18.25②③④注:与control组比较,①P<0.05,②P<0.01;与ox-LDL+oe-NC组比较,③P<0.05;与ox-LDL+oe-LP-PLA2相比较,④P<0.05㊂DCFH-DA法检测各组VSMC源性泡沫细胞中ROS水平的结果显示,与control组比较,ox-LDL+ oe-NC组㊁ox-LDL+oe-LP-PLA2组和ox-LDL+oe-LP-PLA2+LY294002组细胞中ROS表达水平升高(P<0.01);与ox-LDL+oe-NC组比较,ox-LDL+oe-LP-PLA2组ROS表达升高(P<0.05);与ox-LDL+oe-LP-PLA2组比较,ox-LDL+oe-LP-PLA2+LY294002组细胞中ROS表达降低(P<0.05)㊂详见图9㊁图10㊂图9DCFH-DA法检测各组VSMC中ROS 的表达水平图10各组VSMC中ROS表达水平的定量分析(与control组比较,*P<0.01;与ox-LDL+oe-NC组比较,#P<0.05;与ox-LDL+oe-LP-PLA2组比较,әP<0.05)2.5过表达LP-PLA2对VSMC源性泡沫化信号通路的影响Western Blot检测结果显示,与control组比较, ox-LDL+oe-NC组㊁ox-LDL+oe-LP-PLA2组和ox-LDL+oe-LP-PLA2+LY294002组VSMC源性泡沫细胞中LP-PLA2和泡沫化信号通路中ACA Tl㊁ERK1/2㊁JNK/SAPK蛋白表达均升高(P<0.05或P<0.01);与ox-LDL+oe-NC组比较,ox-LDL+oe-LP-PLA2组LP-PLA2㊁ACATl㊁ERK1/2㊁JNK/SAPK蛋白表达水平升高(P<0.05或P<0.01),ox-LDL+oe-LP-PLA2+ LY294002组中除LP-PLA2升高外(P<0.05),其他蛋白表达水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);与ox-LDL+oe-LP-PLA2组比较,ox-LDL+oe-LP-PLA2+ LY294002组细胞中ACATl㊁ERK1/2㊁JNK/SAPK蛋白表达水平均降低(P<0.05),而LP-PLA2蛋白表达水平无统计学差异(P>0.05)㊂详见图11㊁图12㊂图11各组VSMC源性泡沫细胞泡沫化信号通路中ACATl㊁ERK1/2和JNK/SAPK 蛋白表达条带图图12各组VSMC源性泡沫细胞泡沫化信号通路中ACATl㊁ERK1/2和JNK/SAPK蛋白表达的定量分析(与control组比较,*P<0.05,#P<0.01;与ox-LDL+oe-NC组比较,әP<0.05;与ox-LDL+oe-LP-PLA2组比较,ʀP<0.05)3讨论研究表明,靶向VSMC的泡沫化进程可能是缓解动脉粥样硬化的关键策略[9]㊂本研究结果表明,上调VSMC中LP-PLA2表达可通过大胞饮机制和ERK1/2㊁JNK/SAPK途径促进ox-LDL作用下的细胞中脂质累积与炎性因子和ROS的产生,从而加速诱导VSMC 的泡沫化转变㊂在动脉粥样硬化形成过程中,多种炎性细胞可分泌LP-PLA2,如单核细胞㊁巨噬细胞㊁泡沫细胞等[5,10]㊂同时,单核细胞成熟为巨噬细胞也伴随着LP-PLA2mRNA和蛋白水平的明显增加,且在用ox-LDL处理巨噬细胞以诱导其泡沫化过程中, LP-PLA2表达水平也呈现出明显的升高趋势[11],这与在临床中动脉粥样硬化斑块中观察到的结果一致[12],均表明LP-PLA2是巨噬细胞发生泡沫化的关键因子㊂而在VSMC来源的泡沫化细胞中,LP-PLA2的具体作用尚不明确㊂细胞中脂质积累和炎症反应及氧化应激是VSMC发生泡沫化最为明显的㊁相互关联的病理变化[13]㊂而ox-LDL作为内源性脂质配体的主要成分,其可导致内皮细胞损伤,并积聚在巨噬细胞和VSMC 中,可进一步诱导细胞炎症反应的发生[14]㊂研究显示,LP-PLA2参与ox-LDL诱导的炎症反应和ROS生成[15]㊂本课题组通过ox-LDL处理原代分离的小鼠VSMC发现,细胞中脂质累积和促炎因子TNF-α㊁IL-6㊁MCP-1和ROS的表达水平均明显升高,而上调VSMC中LP-PLA2表达则明显促进了上述现象的发生㊂表明VSMC泡沫化进程中LP-PLA2同样具有重要作用㊂TNF-α和IL-6作为炎症性标志物,其在动脉粥样硬化中能够介导内皮细胞损伤,参与凝血功能障碍与炎症级联反应的放大,并影响粥样斑块的稳定性[16]㊂而MCP-1是一种在动脉粥样斑块中发现的,可被单核细胞㊁VSMC和内皮细胞等多种细胞表达的一种C-C型促炎趋化因子[17]㊂研究发现,MCP-1不仅能促进内皮细胞与单核细胞之间的黏附,还能促进VSMC的增殖,使其由收缩型转变为合成型,而后者可大量摄取ox-LDL并发生泡沫化[18]㊂同时,发生泡沫样变的VSMC对MCP的分泌能力也明显增强,这与在人类动脉粥样硬化中发现的VSMC高表达MCP-1的现象一致[17-18]㊂此外,促炎因子TNF-α㊁IL-6等还能直接激活与内皮细胞膜结合的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶,进而催化产生ROS,作为信号分子调节血管与细胞内黏附分子基因的转录与表达,从而加速动脉粥样硬化的形成与发展[19]㊂大胞饮是一种可无需肌动蛋白参与的细胞外物质进入胞内的途径之一,其与细胞的免疫反应,营养物质的摄取和粥样硬化中细胞的泡沫样变等多种生理及病理学改变均密切相关[20-21]㊂在巨噬细胞来源的泡沫细胞中,Anzinger等[22]研究表明,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子诱导的小鼠巨噬细胞可通过大胞饮机制摄取LDL,使其发生泡沫化,并促进主动脉的脂质积聚㊂而对于VSMC的泡沫化进程,陈雪等[23]研究表明,炎症可诱导VSMC通过大胞饮机制来摄取天然低密度脂蛋白,从而增加细胞内脂质的聚集,促进细胞的泡沫化形成㊂本研究在上述研究的基础上,通过应用胞饮抑制剂LY294002测试,结果表明阻滞VSMC的胞饮途径可降低过表达LP-PLA2所促进的VSMC的泡沫化进程㊂提示大胞饮机制可能是LP-PLA2促进VSMC 发生泡沫化的重要途径㊂ACATl是细胞内催化游离胆固醇和脂肪酸合成胆固醇酯的关键酶,其在细胞发生泡沫化进程中具有重要作用[24]㊂而抑制ACATl在一定程度上可改善动脉粥样硬化的发展[25]㊂ERK和JNK/SAPK作为丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)通路的两条重要途径,均参与了动脉粥样硬化的病理过程[26]㊂研究表明,ox-LDL所致的内皮细胞功能紊乱㊁VSMC的增殖与迁移及其与巨噬细胞中脂质代谢稳态的失衡等都与ERK和JNK/SAPK途径有关[26-27]㊂本研究结果表明,上调VSMC中LP-PLA2表达水平可促进ox-LDL刺激作用下的细胞中ERK和JNK/SAPK通路,而大胞饮抑制剂则能削弱LP-PLA2对ERK和JNK/SAPK蛋白表达水平的促进作用㊂4小结综上所述,本实验结果表明,上调LP-PLA2表达可通过大胞饮机制促进ox-LDL作用下的VSMC的泡沫化进程,而这可能与ERK和JNK/SAPK通路的表达上调有关㊂本研究进一步补充了VSMC发生泡沫化的相关机制,有望LP-PLA2成为今后预防和治疗动脉粥样硬化思路与策略的研究靶点提供新的思路与策略㊂参考文献:[1]LIBBY P.The changing landscape of atherosclerosis[J].Nature,2021,592(7855):524-533.[2]POREDOŠP,CÍFKOVÁR,MARIE MAIER J A,et al.Preclinicalatherosclerosis and cardiovascular events:do we have aconsensus about the role of preclinical atherosclerosis in theprediction of cardiovascular events?[J].Atherosclerosis,2022,348:25-35.[3]BASATEMUR G L,JØRGENSEN H F,CLARKE M C H,et al.Vascular smooth muscle cells in atherosclerosis[J].NatureReviews 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脂蛋白相关磷脂酶A2检测项目简介
脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）,为磷脂酶A2超家族，是由成熟的巨噬细胞和淋巴细胞合成和分泌，属于强特异性血管炎症的标志物，不受其他部位炎症的影响。

在血浆中Lp-PLA2 是以与脂蛋白颗粒结合的形式存在, 其中2/3 与低密度脂蛋白(LDL)结合。

Lp-PLA2主要的生理作用是水解氧化型LDL上的磷脂，生成溶血卵磷脂和氧化脂肪酸，二者均为促炎物质，进而起到促炎症和促动脉粥样硬化的作用，并且其含量与动脉粥样硬化的炎症程度及斑块的不稳定性成正相关，可作为冠心病和缺血性脑卒中动脉粥样硬化相关疾病的临床超前预测指标。

临床意义
1、辅助诊断：辅助诊断动脉粥样硬化，即动脉粥样硬化的炎症程度及其稳定性的动态监测指标；
2、风险预测：
对中高危人群可预测其冠心病以及脑血栓等动脉粥样硬化相关疾病的发生风险；
对中高危人群可预警心肌梗死和脑梗死等严重心脑血管突发事件的发生风险；
对发生过中风、ACS、AMI等急性不良事件的患者，预测二次事件的发生风险，并评估其出院后的生
存率；
3、治疗监测：对接受治疗的患者，评估其治疗方案是否有效。

适检人群
1、高危人群：冠心病、脑血栓、高血压、高血脂症、高粘血症、糖尿病、肾病综合征等患者及肥胖、烟酒过度、缺乏运动等人群的门诊常规血液检测。

2、作为住院病人的常规血液检测以监测心脑血管疾病患者的治疗效果、评估其复发风险和其预后。

3、处于血脂≥临界值、临界高血压的健康人群。

办公白领、高工作量、高精神压力者或40岁以上人群体检的常规血液检测项目。

标本采集要求
2-3ml静脉血放置2-8℃保存
临床项目收费标准。