《双向电泳技术》PPT课件

高通量
该技术可以同时分离大量蛋白质，提高了实 验的通量。
高稳定性
该技术具有较高的稳定性，实验结果重复性 好。
缺点
实验周期长
双向电泳技术的实验周期较长 ，需要耗费较多的时间和人力
。
对样品要求高
该技术需要大量的起始样品， 并且对样品的纯度要求较高。
对实验条件要求严格
双向电泳技术的实验条件较为 苛刻，需要精确控制实验参数 。
在药物研发中的应用
总结词
双向电泳技术为药物研发提供了高通量和高效率的蛋白质分离手段，有助于发现潜在的药物靶点和筛 选候选药物。
详细描述
在药物研发过程中，双向电泳技术可用于分析药物对蛋白质表达谱的影响，从而发现药物作用的靶点 。此外，通过比较不同物种或组织的蛋白质表达谱，可以发现潜在的药物靶点，为新药研发提供思路 和候选药物。
应用领域的拓展
疾病诊断与治疗
利用双向电泳技术分析疾病相关蛋白质，为疾病诊断 和治疗提供依据。
药物研发
通过双向电泳技术筛选药物作用靶点，加速新药研发 进程。
生物工程与农业
在生物工程和农业领域中应用双向电泳技术，优化生 物过程和育种。
未来发展方向与挑战
标准化与规范化
建立双向电泳技术的标准化操作流程和质量控制体系，提高实验 结果的可靠性和可比性。
CHAPTER 02
双向电泳技术的实验流程
样本制备
01
02
03
样本选择与处理
选择适当的组织或细胞样 本，进行适当的处理以提 取蛋白质。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和试剂 ，从样本中提取蛋白质。
蛋白定量
使用蛋白质定量方法，确 定蛋白质的浓度。
蛋白质提取
溶解蛋白质

中国历史上吸烟的历史和现状、所采 取的措 施以及 由此带 来的痛 苦和灾 难，可 以进一 步了解 吸烟对 人民健 康的危 害，提 高师生 的控烟 意识
• 最高电压10,000 V • 10–25C 温度控制 • 7, 11, 17, 18, 和 24 cm的聚
焦盘，可以各放12根胶条 • 可以储存10个程序，每个程序有
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实验操 作
Method
原理
Theory
应用
Application
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二维SDS-PAGE
• 同普通SDS-PAGE类似。
• 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因 为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩， 可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺 胶）充当了浓缩胶。
l 设置等电聚焦时的温度。（17℃）
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配制SDS-PAGE凝胶
配制12%的丙烯酰胺凝胶，直接用双向电 泳专用梳子；或在上部留0.5cm的空间， 用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封胶。 聚合30分钟。
第
一
向

固相pH介质是丙烯酰胺的衍生物，通过化学 方法以共价键的形式结合到聚丙烯酰胺凝胶上。pH 梯度在凝胶聚合时就已经形成，所以，该pH梯度不 受脱水、重新水化和电场等因素的影响，能得到很 稳定的pH梯度，不会产生pH漂移，电泳时不同pI的 蛋白质，根据其pI聚焦在相应的位置。
• 双向电泳根据其第一向电泳使用的介质的不同可以分为两类， • 一类是ISO-Dalt(等电点—道尔顿)，是用载体两性电解质配制成 的聚焦凝胶系统； • 另一类是IPG-Dalt(固相pH—道尔顿)，是将载体两性电解质偶联 在凝胶上的聚焦系统。
二、 双向电泳技术
1．ISO-Dalt系统 原理：以等电聚焦为第一向电泳，首先在x轴横坐标
方向将不同pI的蛋白质通过等电聚焦电泳分离，获
得了按等电点差异分离的蛋白质组分，然后再经 SDS-PAGE，将等电点相同或相近的、相对分子质 量有差异的蛋白质组分分开，最终得到不同相对分 子质量的蛋白质组分。
一般情况细胞内同时具有pI和相对分子质量都相同的 蛋白质，其概率是非常少的。所以，双向电泳得到的蛋白 质组分绝大部分都是单一组分。
• 双向电泳由第一向等电聚焦 (IEF)电泳和第二
向 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 组成，
第一向使等电点不同的蛋白得到分离，第二
向使分子量不同的蛋白得到分离，两向结合
便得到高分辨率的蛋白图谱。
2．组合方式
样品首先经过等电聚焦分离(按等电点的差异分离)，然后进行 SDS-PAGE分离(按相对分子质量大小不同分离)。但是也有少数 先采用分子质量分离，后进行等电聚焦分离。
第四节 双向电泳
2DGE(two-dimensional gel electrophoresis)
一、概述

第二向电泳
将胶放入第二向电泳槽中进行SDSPAGE电泳，分离蛋白。
染色及图像分析
染色
根据需要选择合适的染色方法（如Coomassie Blue染色、银染等）对分离后的 蛋白进行染色。
图像分析
使用凝胶图像分析软件对染色后的凝胶进行图像分析，包括蛋白点检测、定量和 比较等操作。
03
双向凝胶电泳的优缺点
《双向凝胶电泳》 PPT课件
contents
目录
• 双向凝胶电泳简介 • 双向凝胶电泳实验流程 • 双向凝胶电泳的优缺点 • 双向凝胶电泳的发展趋势和未来展望 • 双向凝胶电泳的实际应用案例
01
双向凝胶电泳简介
双向凝胶电泳的定义
双向凝胶电泳是一种分离蛋白质的技 术，通过两次不同方向的电泳分离， 将复杂的蛋白质混合物进行分离和鉴 定。
02
双向凝胶电泳实验流程
样本制备
细胞或组织破碎
使用超声波破碎仪或玻璃匀浆器将细胞或组织破 碎成匀浆。
蛋白提取
使用蛋白提取试剂盒从匀浆中提取总蛋白。
蛋白定量
使用BCA法或Bradford法进行蛋白定量，确保蛋 白浓度一致。
2D胶的配制
制备第一向等电聚焦胶
选择合适的pH范围，按照配方比例混合原料，灌制胶模并凝固。
制备第二向SDS-PAGE胶
选择合适的分子量范围，按照配方比例混合原料，灌制胶模并凝固。
蛋白上样及第一向电泳
准备上样缓冲液
根据蛋白浓度加入适量的上样缓冲液。
上样
将蛋白样品加入到点样孔中，进行第一向等电聚焦电泳。
固定
电泳结束后，将胶固定在相应的设备上，进行固定操作。
胶的平衡及第二向电泳
平衡液浸泡
将固定好的胶用平衡液浸泡，以去除 多余的固定剂。

它带电荷的性质，具有不同pI的两性电解质在同一环境中带有不同 性质和数量的电荷，
另一方面，溶液中的两性电解质又破坏了水的解离平衡：
H2O
H++OH－
使溶液的pH有所改变。当某一两性电解质的pI较低，即释
放质子（ H+ ）能力较强，使溶液 pH 值下降，这类两性电
解质称为酸性两性电解质；而pI高的两性电解质可使溶液
1.2.1组合摸式：双向电泳主要是电荷分离——分子质量分 离的组合摸式。 （ 1 ）第一向为电荷分离：通过聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 毛细管电泳将样品按蛋白质等电点的差异进行分离。 （ 2 ）第二向为质量分离：通过 SDS— 聚丙稀酰胺凝胶电 泳按相对分子质量大小不同进行分离。
1.2.2分类：双向电泳根据其第一向使用的介质的不同可以
们到达净电荷为零的位置时才停止。
具有最低和最高等电点的分子带电荷最多，泳动速度最快， 所以pI梯度的形成开始在正、负级两端，然后不同pI的载 体两性电解质分子逐渐到达它们自己的等电点位置而形成
一个连续的pI梯度。如图所示。
A
B
C
载体两性电解质在电场中形成pI梯度的模式图
A 原始状态 B pI梯度的形成过程 C连续pI梯度的形成
出的优点。
图 等电聚焦的“聚焦效应”
等电聚焦电泳根据蛋白质等电点不同而将其分离，也可以根据蛋白 条带在pH梯度中形成的位置测定其等电点。
3第二向电泳——SDS电泳的基本原理
3.1蛋白质-SDS复合物
(1)SDS的作用：SDS是一种阴离子去污剂，它在水溶液中
以单体和分子团(micellae)的混合形式存在，作为一种变性
中存在三个物理效应和四个不连续性的分离系统。
3.2.1三个物理效应

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利用双向电泳可以分辩出5000—10000个蛋白质组 分
分离得到的蛋白质组分纯度达到90%以上，可以 稳定地保存在凝胶上
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注意
双向电泳分离的结果使蛋白质点而不是条带。 根据
Cartesin坐标系统，从左到右是pI的增加，从下到上是分子
质量的增加。
PI增加
分 子 质 量 增 加
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蛋白质双向电泳技术
—— 基本原理
2020/12/09
姓 名：郭吉星 学 号：2010103024 任课老师：祝建波 教授

双向电泳 技术
双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE） 是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取 的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数 千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分 辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分 离方法所无与伦比的。双向电泳技术、计算机图 像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称 为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
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第二向SDS-PAGE
SDS-PAGE是利用SDS使蛋白质变性，多肽链 变成长棒状，不同长短肽链间短轴基本相等，长 轴长度与肽链长度成正比。SDS与蛋白质形成复 合物，并且按1.4gSDS与1g蛋白质等比例结合（相 当于两个氨基酸残基结合一分子的SDS）使之带 上大量负电荷
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双向电泳技术
第一向按蛋白质等电点的不同，每个蛋白质分子 沿pH梯度迁移至与其等电点相等的位置

《蛋白质双向电泳》ppt课件
目录 Contents
• 蛋白质双向电泳概述 • 实验流程与技术 • 双向电泳的优缺点 • 双向电泳的应用实例 • 未来展望与研究方向
01
蛋白质双向电泳概述
定义与原理
定义
蛋白质双向电泳是一种分离和鉴定蛋白质混合物的技术，通过两次不同pH值 的电泳分离蛋白质。
原理
利用蛋白质的电荷和分子量差异，在电场中实现分离。在第一向电泳中，蛋白 质根据等电点不同被分离；在第二向电泳中，蛋白质根据分子量被分离。
蛋白质组学与其他技术的结合
与质谱技术联用
01
将蛋白质双向电泳技术与质谱技术联用，实现蛋白质
的精准鉴定和定量分析。
与基因组学、代谢组学等多学科交叉
02 将蛋白质双Hale Waihona Puke 电泳技术与基因组学、代谢组学等多学
科交叉，全面解析生命活动的调控机制。
与单细胞技术结合
03
将蛋白质双向电泳技术与单细胞技术结合，揭示单个
蛋白质定量
选择合适的蛋白质定量方法：如BCA 法、Lowry法等，确保准确性。
按照定量方法操作步骤进行定量，记 录数据并进行分析。
蛋白质溶解与分离
溶解蛋白质
将蛋白质样品溶解于适当的缓冲液中 ，以便进行电泳分离。
电泳分离
将溶解的蛋白质样品进行等电聚焦电 泳和SDS-PAGE电泳，实现蛋白质的 分离。
凝胶染色与图像分析
凝胶染色
采用银染、考马斯亮蓝染色等方法对凝胶上的蛋白质进行染 色。
图像分析
对染色后的凝胶进行拍照，并利用相关软件进行蛋白质点的 检测、匹配和比较分析。
03
双向电泳的优缺点
优点
高分辨率
双向电泳可以根据蛋白质的等电 点和分子量进行分离，具有较高 的分辨率，能够分离出更多的蛋 白质。

第二步：把未溶解的pellet用标准IEF样品液溶解提取 高疏水性蛋白；
第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽 提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的 11%（W/W）。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸 展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能 量域。其典型代表是尿素和硫尿。
双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括 多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。
防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰
（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证
Amount 4.1ml of 8.5 stock or 2.1g urea in 3ml H2O 760mg
50ul of 200mM TBP stock
200mg See table 10ul of 0.1% stock To 5ml
Multiple surfactant solution preparation 经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用
IPG pH Range 3-10 4-7