ROS荧光探针-DHE说明书

中国免疫学杂志2021年第37卷活性氧（ROS ）对类风湿性关节炎骨破坏的影响研究①郭婉怡袁蓓张铌雪孔祥英苏晓慧林娜（中国中医科学院中药研究所，北京100700）中图分类号R593.22文献标志码A文章编号1000-484X （2021）18-2182-06［摘要］目的：探索活性氧（ROS ）对类风湿性关节炎（RA ）骨破坏的影响。

方法：建立Ⅱ型胶原诱导性类风湿性关节炎（CIA ）大鼠模型，观察大鼠关节红肿畸形等症状；HE 和Masson 三色染色观察关节滑膜、软骨、骨组织等病理变化；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP ）染色观察关节破骨细胞生成情况；二氢乙锭（DHE ）荧光探针检测关节组织中ROS 的表达。

体外巨噬细胞集落刺激因子（M -CSF ）和核因子κB 受体活化因子配体（RANKL ）诱导小鼠原代骨髓巨噬细胞（BMMs ）48h 、96h 后，TRAP 和鬼笔环肽染色观察破骨细胞形成和分化情况，RT -PCR 和免疫荧光技术检测TRAP 、基质金属蛋白酶9（MMP -9）、组织蛋白酶K （CTSK ）mRNA 和CTSK 、MMP -9蛋白的表达；DCFH -DA 探针检测破骨细胞中ROS 水平变化。

结果：CIA 大鼠关节组织呈现炎症细胞浸润、滑膜异常增生、TRAP 阳性细胞大量形成，骨破坏严重区域ROS 表达明显增强。

此外，成功构建体外破骨细胞分化模型，48h 开始出现多核破骨细胞，96h 形成大量成熟破骨细胞。

溶骨功能相关因子mRNA 和蛋白的表达呈诱导时间依赖性增加，同时ROS 的表达呈现趋势性累积；而且，ROS 抑制剂NAC 明显抑制了破骨细胞的分化。

结论：ROS 可能通过调控破骨细胞的分化促进RA 骨破坏，抑制ROS 产生可明显抑制破骨细胞分化。

［关键词］活性氧；破骨细胞；骨髓巨噬细胞；类风湿性关节炎；大鼠Effect of reactive oxygen species （ROS ）on bone destruction in rheumatoid arthritisGUO Wan -Yi ，YUAN Bei ，ZHANG Ni -Xue ，KONG Xiang -Ying ，SU Xiao -Hui ，LIN Na.Institute of Chinese Materia Medica China Academy of Chinese Medical Sciences ，Beijing 100700，China［Abstract ］Objective ：To study the effect of reactive oxygen species （ROS ）on bone destruction of rheumatoid arthritis （RA ）.Methods ：The rat model of collagen -induced rheumatoid arthritis （CIA ）was established ，then the rats'symptoms of joint swelling and deformity in each group were recorded.The pathological changes of synovium ，cartilage and bone were observed by HE and Masson staining.TRAP staining was used to mark mature osteoclasts.The ROS in adjuvant arthritis rats were analyzed by DHE fluorescent.Bone marrow macrophages （BMMs ）were treated with M -CSF and RANKL for 48h ，96h.Formation and activation of osteoclasts were observed by TRAP staining and phalloidin staining.The expression of osteoclast specific genes ，TRAP ，MMP -9，CTSK mRNA and MMP -9，CTSK proteins levels were detected by RT -PCR and immunofluorescence staining separately.DCFH -DA fluorescence staining was used for intracellular ROS detection.Results ：The results of pathological sections showed that CIA rats had arthritic cell infiltra‐tion ，synovial hyperplasia and a massive formation of TRAP positive cells with the vigorous ROS expression at the same time.And os‐teoclast differentiation model was successfully constructed in vitro ，then multinucleated osteoclast were formed at 48h and more at 96h.The expression of ROS in cells showed a tendency accumulation with time as well as the expression of osteoclast related genes under RANKL induction ；moreover ，after intervention with NAC ，a ROS inhibitor ，osteoclast differentiation was significantly inhibited.Con⁃clusion ：ROS affects RA bone destruction by participating in osteoclast differentiation.Inhibition of ROS production can significantlyinhibit osteoclast differentiation.［Key words ］Reactive oxygen species ；Osteoclasts ；Bone marrow macrophages ；Rheumatoid arthritis ；Rats关节周围的软骨破坏和骨质侵蚀是类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis ，RA ）的主要病理特征，也是RA 患者致残的主要原因［1］。

精子细胞氧化应激活性氧（ROS）高质荧光检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途精子细胞氧化应激活性氧（ROS）高质荧光检测试剂是一种旨在使用透膜荧光染色剂氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯，在细胞氧化条件下，产生荧光，来定量检测精子细胞内活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心研制、成功实验证明的。

适用于动物和人体精子细胞的活性氧族的检测。

可以被用于细胞凋亡、衰老、代谢和营养学，以及发育生物学（男性不育）等的研究。

产品严格无菌，即到即用，操作简便，性能稳定，荧光清晰。

技术背景超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，甚而导致诸如男性不育、冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。

其中精子细胞（spermatozoa）对于活性氧较为敏感：低浓度活性氧可以调节正常精子功能、精子获能、顶体反应、精卵融合等；高浓度活性氧则影响精子细胞的质量和功能，因为精子细胞质膜含有大量不饱和脂肪酸，胞浆含有少量的祛除活性氧的相关酶蛋白，由此活性氧容易造成精子质膜的流动性和DNA完整性受到损害，精子运动能力降低，不能参与授精活动，最终导致特发性不育症（idiopathic infertility）。

Dihydroethidium (DHE)—超氧化物阴离子荧光探针呼~深吸一口气，你感受到了什么？饱含O2的气流，进入肺部，通过交换进入血液，再运输至全身各处，于是一种愉悦的情绪开始从身体内部升起、蔓延……这种深呼吸带来的安定感，除了供氧充足外，还没有给出特别合理的解释，只有斯坦福大学的一支团队给我们带来了一点启示，他们发现在小鼠脑干深处，有一群微小的神经元集群，它们将呼吸与放松、关注、兴奋和焦虑联系起来，连结着大脑的唤醒中心，可调节情绪状态。

这个发现也许能给呼吸与情绪的关系带来一定的启发，毕竟呼吸是那么的重要，它伴随着我们的一生，当然，任何过程都伴随着小小的隐患。

一个成年人一天大概需要0.75公斤的O2，氧分子在代谢过程中可能被单个电子还原，形成中间产物超氧阴离子O2-，其性质活泼，易与多种大分子结合使其失去活性。

生物体正常代谢过程和在各种环境胁迫下均能产生超氧化物，它们的积累将引起生物体内细胞结构和功能的破坏。

人体内正常有一套活性氧清除系统，但在某些疾病的影响下，会出现氧化应激现象（即氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化），超氧化物增多，所以在科研及疾病诊断中可以通过检测超氧化物的含量，来反应呼吸及疾病程度。

为此我们需要用到可以特异性识别超氧化物的产品——Dihydroethidium (DHE)就是我们今天的主角。

Dihydroethidium (DHE)是一种最常用的超氧化物阴离子荧光检测探针,能有效地检测活性氧类。

这种染料可以自由地进入细胞，在细胞内超氧化物阴离子作用下脱氢形成溴化乙锭。

溴化乙锭可以与RNA或DNA结合产生红色荧光。

当细胞内的超氧化物阴离子水平较高时，产生的溴化乙锭较多，红色荧光就较强，反之则较弱。

这样就可以用二氢乙锭进行超氧化物阴离子水平的检测。

在下面这篇文章中我们可以看到具体的DHE的应用。

这是一篇探究体外培养的CD34+细胞在缺氧和常氧状态下，抗氧化酶和谷胱甘肽氧化还原状态的变化的文章。

Dihydroethidium (超氧化物阴离子荧光探针)产品简介：Dihydroethidium简称DHE，是最常用的检测细胞内超氧化物阴离子水平的荧光探针。

分子式为C21H21N3，分子量为315.41。

Dihydroethidium是一种最常用的超氧化物阴离子荧光检测探针。

可以直接用于活细胞的标记。

Dihydroethidium被活细胞摄入后，可以在细胞内的超氧化物阴离子作用下脱氢，产生ethidium。

Ethidium (例如溴化乙锭)可以和RNA或DNA结合产生红色荧光。

当细胞内的超氧化物阴离子水平较高时，产生的ethidium较多，红色荧光就较强，反之则较弱。

这样就可以用dihydroethidium进行超氧化物阴离子水平的检测。

Dihydroethidium本身为蓝色荧光，最大激发波长为370nm，最大发射波长为420nm，脱氢后和RNA或DNA结合产生红色荧光，最大激发波长为300nm，最大发射波长为610nm，实际观察时也可以使用535nm作为激发波长。

Dihydroethidium可以溶解于DMSO，配制成适当的母液。

用于细胞内超氧化物阴离子检测时， Dihydroethidium的常用浓度为1-10μM。

通常用含有0.5-5μM的Dihydroethidium的适当溶液和细胞一起在37℃孵育30分钟左右进行荧光探针装载，随后可以适当洗涤，接着可以直接用流式细胞仪或其它适当荧光检测仪器进行检测。

保存条件：-20℃避光保存，6个月有效。

易在空气中氧化，尽量避免暴露于空气中。

注意事项：Dihydroethidium易在空气中氧化，请尽量避免暴露于空气中。

Dihydroethidium脱氢后产生毒性较高的ethidium，请注意防护。

荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用本产品的文献：1.Fan J, Cai H, Yang S, Yan L, Tan W.Comparison between the effects of normoxia and hypoxia on antioxidant enzymes and glutathione redox state in ex vivo culture of CD34(+) cells.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 2008 Oct;151(2):153-8.2.Gao P, Guo RW, Chen JF, Chen Y, Wang H, Yu Y, Huang L.A meprin inhibitor suppresses atherosclerotic plaque formation in ApoE-/- mice.Atherosclerosis. 2009 Nov;207(1):84-92.3.Li Z, Shi K, Guan L, Cao T, Jiang Q, Yang Y, Xu C.ROS leads to MnSOD upregulation through ERK2 translocation and p53 activation in selenite-induced apoptosis of NB4 cells.FEBS Lett. 2010;584(11):2291-7. Epub 2010 Mar 28.4.Peng N, Liu JT, Guo F, Li R.Epigallocatechin-3-gallate inhibits interleukin-6- and angiotensin II-induced production of C-reactive protein in vascular smooth muscle cells.Life Sci. 2010;86(11-12):410-5. Epub 2010 Jan 255. Wei L, Lu N, Dai Q, Rong J, Chen Y, Li Z, You Q, Guo Q.Different apoptotic effects of wogonin via induction of H(2)O(2) generation and Ca(2+) overload in malignant hepatoma and normal hepatic cells.J Cell Biochem. 2010 Dec 15;111(6):1629-41.6. Savickiene J, Treigyte G, Gineitis A, Navakauskiene R.A critical role of redox state in determining HL-60 cell granulocytic differentiation and apoptosis via involvement of PKC and NF-kappaB.In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2010 Jun;46(6):547-59.7.Shi XR, Hong ZY, Liu HR, Zhang YC, Zhu YZ.Neuroprotective effects of SCM198 on 6-hydroxydopamine-induced behavioral deficit in rats andcytotoxicity in neuronal SH-SY5Y cells. Neurochem Int. 2011 Jul;58(8):851-60.8.He X, Zhang HL, Zhao M, Yang JL, Cheng G, Sun L, Li DL, Jiang HK, Zhao Q, Yu XJ, Zang WJAmlodipine ameliorates endothelial dysfunction in mesenteric arteries from spontaneouslyhypertensive rats.Clin Exp Pharmacol Physiol. 2011 Apr;38(4):255-61.9.Sang J, Yang K, Sun Y, Han Y, Cang H, Chen Y, Shi G, Wang K, Zhou J, Wang X, Yi J.SUMO2 and SUMO3 transcription is differentially regulated by oxidative stress in an Sp1-dependent manner.Biochem J. 2011 Apr 15;435(2):489-98.10.Liu F, Li XL, Lin T, He DW, Wei GH, Liu JH, Li LS.The cyclophosphamide metabolite, acrolein, induces cytoskeletal changes and oxidative stress inSertoli cells.Mol Biol Rep. 2012 Jan;39(1):493-500.11.Xie XQ, Li F, Ying SH, Feng MGAdditive contributions of two manganese-cored superoxide dismutases (MnSODs) to antioxidation,UV tolerance and virulence of Beauveria bassiana. PLoS One. 2012;7(1):e30298.12.Fan J, Cai H, Li Q, Du Z, Tan W.The effects of ROS-mediating oxygen tension on human CD34(+)CD38(-) cells induced into mature dendritic cells.J Biotechnol. 2012 Apr 15;158(3):104-11..。

dhe染色步骤DHE染色步骤引言：DHE染色（Dihydroethidium staining）是一种常用的细胞染色方法，用于检测活细胞中的活性氧（ROS）产生情况。

该方法基于化学物质DHE与ROS反应生成荧光染色的原理，可广泛应用于细胞生物学、免疫学和病理学等领域。

本文将详细介绍DHE染色的步骤，以帮助读者了解和运用该技术。

步骤一：制备DHE工作溶液1. 取出DHE粉末，称取适量（一般为毫克级）。

2. 使用无菌DMSO（二甲亚砜）将DHE粉末溶解，得到高浓度的DHE溶液。

3. 将高浓度的DHE溶液稀释至所需浓度，通常为1-10μM。

步骤二：处理细胞样品1. 取出培养好的细胞样品，如培养皿中的细胞或载玻片上的细胞。

2. 用PBS（无菌磷酸盐缓冲液）或其他细胞培养液洗涤细胞样品，去除细胞培养物和杂质。

3. 将洗涤后的细胞样品加入适量的PBS或其他适宜的缓冲液中，以保持细胞的生理状态。

步骤三：加入DHE工作溶液1. 将制备好的DHE工作溶液加入处理好的细胞样品中，使其完全覆盖细胞。

2. 保护样品免受光照，将样品放入避光条件下孵育，一般为37°C 的恒温培养箱中。

步骤四：孵育细胞样品1. 根据具体实验要求，将细胞样品在恒温培养箱中孵育一定的时间，一般为30分钟至1小时。

2. 孵育过程中，细胞内的活性氧与DHE发生反应，形成荧光染色的产物。

步骤五：观察和拍照1. 从恒温培养箱中取出处理好的细胞样品。

2. 使用荧光显微镜观察细胞样品，选择适当的荧光滤光片和荧光标记物的激发波长进行观察。

3. 使用相机或图像采集系统拍摄荧光图像。

步骤六：分析和解读结果1. 分析荧光图像中的荧光强度和分布情况，可以使用图像处理软件进行量化分析。

2. 根据实验目的和研究问题，解读荧光图像中的结果，判断细胞中活性氧的产生情况。

结论：DHE染色是一种简便有效的方法，用于研究细胞内活性氧的产生情况。

通过制备DHE工作溶液、处理细胞样品、加入DHE溶液、孵育细胞样品、观察和拍照、分析和解读结果等步骤，可以获取关于活性氧水平的重要信息。

DNase检测试剂盒(荧光探针法)盒操作手册DNase检测试剂盒基于荧光基团标记的DNA探针，其一端标记有荧光报告基团分子（Fluor），另一端标记有淬灭基团。

当样本中不含DNase活性时，该探针稳定存在，淬灭基团的物理接近会将荧光报告基团中的荧光淬灭到极低水平，不会产生荧光信号；当样本中含有DNase活性时，探针被降解，荧光报告基团和淬灭基团在溶液中的空间上发生分离，产生逐渐增强的荧光信号；荧光信号增加的速率与酶的数量和活性成正相关。

一．主要组成成分及储存条件名称HBP002902（192T）HBP002903（48T）储存温度DNA探针1管1管-25~-15℃TE缓冲液 2.0mL0.5mL-25~-15℃DNase I标准品20μL10μL-25~-15℃(2U/μL)标准品稀释液12mL6mL-25~-15℃无DNase无DNase水25mL25mL-25~30℃二．预期用途可定量或定性检测单个环境，试剂或者耗材样品中的DNase，判断样本是否被DNase污染。

三．实验环境1.操作过程中需全程穿戴实验服，手套和口罩，严格控制DNase污染；2.为了防止操作过程中引入外源的DNase，前期加样请在超净工作台中进行，实验前用核酸酶清除剂清洁超净工作台中的操作表面，并打开超清洁工作平台紫外照射30分钟；3.其他工作区域在整个实验开始前，也先使用核酸酶清除剂对实验环境进行处理。

四．客户自备耗材仪器210μL移液器桌面离心机3100μL移液器qPCR仪/酶标仪4200μL移液器5DNase DNase free枪头6200μL EP管72ml棕色EP管8黑色平底酶标板/PCR96孔板（高管）9核酸酶清除剂10无酶水11离心管架本实验操作根据酶标仪增益功能不同，分为3种类型进行详细说明，用户可根据自己酶标仪的具体功能，选择对应的实验操作方法。

1.具备自动优化+手动设置增益值的酶标仪，以下以Tecan Spark为例；2.只能选择自动优化或者高中低增益值的酶标仪，以下以SpectraMax iD5为例；3.对于不具备自动优化的酶标仪，比如Fluoroskan FL，这种酶标仪不推荐使用，此时建议使用具有FAM通道的qPCR仪，以下以Thermofisher7500为例。

dhe荧光光谱
Dihydroethidium (DHE) 是一种常用的超氧化物阴离子（O2•−）荧光探针，经常被用于检测细胞内的活性氧（ROS）水平。

DHE 在进入细胞后，可以在细胞内的超氧化物阴离子作用下脱氢，形成乙锭（Ethidium），进一步嵌入到细胞的RNA 或 DNA 中，产生红色荧光。

荧光信号的强度与细胞内的超氧化物阴离子浓度正相关。

荧光光谱是描述荧光物质发射光的波长（颜色）和强度的数据集合。

对于 DHE，其荧光光谱特征如下：
激发波长（Excitation Wavelength）：DHE 的激发波长通常在 518 nm 左右。

这是激发 DHE 产生荧光的光源所需的波长。

发射波长（Emissions Wavelength）：DHE 的发射波长通常在 616 nm 左右。

这是 DHE 被激发后发出的光的主要波长，通常呈现为红色荧光。

Stokes 位移：Stokes 位移是指激发光和发射光之间的波长差。

对于 DHE，Stokes 位移约为 100 nm 左右（即 518 nm - 616 nm = −98 nm），表示发射光的波长比激发光的波长更长。

在实际应用中，研究人员会使用荧光显微镜或荧光光谱仪来观察和分析 DHE 的荧光信号。

通过调整荧光显微镜或光谱仪上的激发和发射滤光片，可以优化对 DHE 的检测。

为了获取准确的荧光光谱数据，必须严格控制实验条件，包括样本的处理、孵育时间、检测时的温度和 pH 值等。

此外，还需要避免自动荧光和其他可能干扰的荧光信号，确保结果的可靠性和精确性。

dhe与ros反应的原理DHE与ROS反应的原理DHE（Diffie-Hellman密钥交换）和ROS（Random Oracle模型）是密码学领域中两个重要的概念，它们在保护网络通信安全方面起着重要的作用。

本文将介绍DHE与ROS反应的原理，并从人类的视角进行叙述，使读者更容易理解。

在现代互联网的通信中，保护数据的安全性是至关重要的。

DHE是一种安全协议，用于在通信的两个终端之间交换密钥，确保通信过程中的数据机密性。

ROS是一种密码学理论模型，用于分析和设计密码学算法的安全性。

DHE与ROS的结合为网络通信提供了更高的安全性。

让我们了解DHE的原理。

DHE协议基于离散对数问题，这是一种数学难题。

在DHE协议中，通信的两个终端（例如Alice和Bob）共同生成一个公共参数，然后各自生成自己的私钥。

接下来，Alice 和Bob分别使用自己的私钥和公共参数进行计算，生成一个共享的密钥。

这个密钥只有Alice和Bob知道，其他人无法获取。

通过DHE协议，Alice和Bob可以安全地交换密钥，从而实现安全的通信。

在DHE协议中，ROS的作用是确保密钥交换的安全性。

ROS模型假设存在一个称为“随机神谕”的理想机器，它可以产生随机的输出，并将输入映射到唯一的输出。

在DHE协议中，ROS模型用于分析密钥交换的安全性。

它假设密钥交换算法能够在随机神谕的帮助下进行计算，并且输出的信息具有随机性。

通过ROS模型的分析，可以评估密钥交换算法的安全性，并确保它们对攻击具有足够的强度。

DHE与ROS反应的原理是通过DHE协议实现安全的密钥交换，并通过ROS模型评估密钥交换算法的安全性。

DHE和ROS结合起来，为网络通信提供了更高的安全性保障。

在现代互联网的通信中，DHE与ROS的应用广泛，它们对保护数据的机密性和安全性起着重要的作用。

通过以上的描述，我们希望读者能够更好地理解DHE与ROS反应的原理，并认识到它们在网络通信安全中的重要性。

dhe与ros反应的原理DHE（Diffie-Hellman密钥交换算法）与ROS（Rivest-Shamir-Adleman加密算法）是现代密码学领域中两个重要的算法，它们分别用于密钥交换和数据加密。

下面将通过一个情景来解释它们的原理和应用。

假设有两个人，小明和小红，他们希望在网络上进行加密通信，保护他们的隐私不被窃听者所知。

为了实现这一目标，他们决定使用DHE和ROS算法。

小明和小红需要协商一个共享的密钥，用于加密和解密他们的通信内容。

这是非常关键的一步，因为如果密钥被他人获取，那么通信内容就会暴露。

在DHE算法中，小明和小红需要选择两个大素数p 和g作为公开参数。

p是一个足够大的素数，g是p的一个原根。

小明选择一个私密的整数a，并计算出A = g^a mod p。

小红也选择一个私密的整数b，并计算出B = g^b mod p。

然后，小明和小红互相交换A和B。

最后，小明计算出共享密钥K = B^a mod p，小红计算出共享密钥K = A^b mod p。

由于离散对数问题的复杂性，即使窃听者知道p、g、A和B，也很难计算出a和b，从而无法得到共享密钥K。

这样，小明和小红就成功地协商了一个共享的密钥。

一旦共享密钥K被协商完成，小明和小红就可以使用ROS算法来加密和解密他们的通信内容。

ROS算法使用非对称加密的方式，其中包括公钥和私钥。

小明生成一对公钥和私钥，将公钥发送给小红，而私钥保密。

小红使用小明的公钥对要发送的数据进行加密。

只有小明拥有相应的私钥，才能对加密的数据进行解密。

通过使用ROS 算法，小明和小红能够确保只有他们两个能够读取和理解通信内容，其他人无法获取其中的信息。

DHE和ROS算法通过密钥交换和数据加密的方式，保护了小明和小红的通信隐私。

DHE算法实现了安全的密钥协商，而ROS算法实现了加密和解密的功能。

这两个算法的结合使得小明和小红能够在网络上安全地进行通信，确保他们的隐私不被窃听者所知。

dhe探针检测ros步骤
使用DHE（二氢乙啶）探针检测ROS（活性氧）的步骤如下：
1.溶解DHE成为stock溶液。

2.将DHE加到需要检测的样品中，如分离后的线粒体样品。

一般所用DHE浓度为5~20
μM。

将加有DHE的样品在适宜温度（如37°C）下孵育一定时间（如30分钟），让DHE能进入细胞内。

3.用荧光分光光度计检测该样品的荧光强度。

DHE在与ROS发生反应后，能被氧化成为
红色荧光的二氢乙烯八酮(DHEO)。

因此检测荧光强度即可反映ROS的含量。

激发波长一般选择为485nm，发射波长选择580nm。

4.根据标准曲线，计算出样品中的ROS浓度。

制作DHE标准曲线时，需要使用已知浓度
的H2O2或其他ROS作为标准品。

5.在不同时间点重复检测，以观察ROS浓度的变化。

请注意，使用DHE检测ROS的主要限制在于DHE自身也可能产生背景荧光，有部分DHE可能还原成未氧化的形式。

但总的来说，DHE仍是一种敏感、有效的ROS检测方法，它能很好地反映线粒体样品中ROS的变化情况。

植物体中活性氧的组织化学定位实验目的：1.掌握活性氧在植物生长发育及逆境响应中的重要应用；2.掌握荧光探针法测ROS 的组织定位。

一、实验试剂和仪器试剂：荧光探针2’，7’—dichlorodihydrofluorescein diacetata（H 2DCFDA,CALBIOCHEM),NADPH 氧化酶抑制剂DPI （CALBIOCHEM)均配成5mg/ml 的储存液（溶解在DMSO 中，摩尔浓度分别为10.26和15.89mmol/L ），—80℃条件下避光贮存。

仪器：荧光显微镜，抽气泵，脱色摇床，小青霉素瓶，单面刀片，牙签，载玻片，盖玻片二、实验材料：col-0生态型拟南芥幼苗（分别用平板和垂直板培养）三、实验原理：H 2DCFDA −−−−−−→−COOH CH 32-/esteraseH 2DCF; H 2DCF+H 2O 2−−−−−→−O H peroxidase 2/DCF(fluorecant)四、实验步骤1、拟南芥培养：将拟南芥种（cd-0）表面灭菌水清洗三次，然后放在有固体MS 培养基（PH5.8)的培养皿中培养，先在4℃春化2天，然后转移到生长室中。

生长室光照时数16h/8h （白天/黑夜）光照强度150培养温度22-23℃。

2、DCFDA 荧光探针测定ROS 总含量①室温下取拟南芥主根尖0.5cm 切段25℃下黑暗中在10μmH 2O 2荧光探针H 2DCFDA 中培养1h （荧光探针加在10mM 的Tris-HCl ，PH7.4Buffer 中）（先抽真空10min 使组织浸透，然后再探针孵育）；②用10mM 的Tris-HCl Buffer 漂洗两次，每次15m 立即在激光共聚焦显微镜上进行整根观察（激发光495nm ，发射光515nm ）③用未染色的切片测背景值，即自光荧光。

五、实验结果注：因为荧光探针的问题，全班材料在激发光下均没有荧光现象，以下均为明场观察结果。

ros fluorescence method -回复ROS荧光方法是一种用于检测细胞中活性氧物种（ROS）水平的常用方法。

ROS是由代谢过程中产生的一类高度反应性氧化物质，包括超氧阴离子（O2- ）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（OH·）等。

虽然ROS在细胞正常生理过程中具有重要作用，但过量的ROS会导致氧化应激，损害细胞膜、蛋白质、核酸等生物大分子结构，从而引发炎症、衰老和许多疾病。

ROS的浓度与细胞中的活性氧物种产生和清除的平衡相关。

因此，对ROS 水平进行准确、灵敏的检测对于研究细胞氧化应激过程的调控机制以及相关疾病的防治具有重要意义。

而ROS荧光方法正是一种常用于检测细胞中ROS浓度的方法。

ROS荧光方法的基本原理是通过荧光探针与ROS反应，产生荧光信号，进而测定ROS的浓度。

根据检测的荧光探针不同，ROS荧光方法可以分为直接法和间接法两种。

直接法是指通过荧光染料与ROS直接反应产生荧光信号。

例如，DCFH-DA （2',7'-二氯二氟荧光素醋酯）是一种常用的直接法荧光染料。

DCFH-DA 本身是一种非荧光化合物，在细胞内被酯酶水解成DCFH（2',7'-二氯荧光素）后，DCFH与ROS反应生成强荧光产物DCF。

荧光信号的强度与ROS 的浓度呈正相关关系。

通过荧光显微镜或荧光板读数仪可以测定荧光信号的强度，进而计算出ROS的浓度。

间接法是指通过荧光染料与ROS产生的反应产生荧光信号。

例如，DHE （二羟乙基-2'-环氧-5'-羟基活性言）是一种常用的间接法荧光染料。

DHE 可以与超氧阴离子（O2-）反应生成具有强荧光的2'-羟基乙基-2,7'-二羟基荧光素。

荧光信号的强度与超氧阴离子浓度呈正相关关系。

类似地，DCFDA、HE、HPF等也是一些常用的间接法荧光染料。

在使用ROS荧光方法进行检测时，需要注意一些实验操作的细节。

ROS使用说明书活性氧检测试剂盒使用说明书活性氧检测试剂盒操作步骤：一、试剂准备：1. dcfh-da可稀释于培养基或缓冲液中。

血清或培养基颜色并不影响dcfh-da及细胞内荧光产生，但可能会影响荧光显微镜观察，干扰荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪荧光测定。

可将dcfh-da稀释于无酚红培养基或适宜的缓冲液如pbs中。

这依赖于使用何种荧光设备进行测定。

2. 加入dcfh-da的时机或孵育时间，以最终能顺利检测细胞内活性氧为目的。

药物处理时间较短(<2小时)或预计ros效应较弱，可先加或同时加入dcfh-da。

反之，treat 刺激时间较长(>6 小时)或预计产生ros效应较强，可后加dcfh-da。

3. 活性氧供体含高纯度12 mm h2o2。

加入细胞后其本身即是一种活性氧，而且在代谢过程中可产生其它类型的活性氧，均可使dcfh-da氧化为dcf呈现强绿色荧光。

因而，用户可使用该试剂作为测试实验系统或仪器的阳性试剂，以初步观察细胞活性氧所产生的荧光的一般特征，并且也可以将该实际作为实验的一个阳性对照。

推荐该试剂的细胞工作浓度为20~100 μm或更低浓度，但超过200μm将产生细胞毒。

如果用户熟悉ros荧光或实验没有必要采用阳性对照，可以不加该试剂。

二、加入荧光探针：1. 加入dcfh-da于培养基，推荐初始工作浓度为10 μm。

对不同的细胞和处理，dcfh-da工作浓度可为100 nm~20 μm，需进行预实验确定合适的浓度。

总体稀释倍数应在1:500~1000以上以避免dmso对细胞的影响。

以dmso作为溶剂对照。

2. 37 oc孵育细胞30min~至几个小时，通常30-60min 即可。

孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、dcfh-da浓度有关。

3. pbs洗涤细胞2次。

三、活性氧检测试剂盒荧光检测采用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜图像检测照相，绿色荧光强度代表活性氧水平。

也可进行微板荧光分析仪(multiwell fluorescence plate reader)实时或每10分钟分时逐点检测荧光强弱。

ros探针 DCFDH说明书荧光显微镜
1、打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到亮点。

2、透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。

落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。

3、用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。

4、放置标本片，调焦后即可观察。

使用中应注意：末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊油镜；高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。

观察在示教台上的荧光显微镜下用蓝紫光滤光片，细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色)。

氧自由基荧光染料氧自由基（ROS）是一类高度活跃的氧化物，可以在细胞内产生并参与多种生物学过程。

然而，过多的ROS会导致细胞损伤并促进多种疾病的发生。

因此，对ROS的检测和定量分析对于研究和诊断疾病具有重要意义。

而氧自由基荧光染料作为一种可靠而有效的检测工具，得到了广泛应用。

氧自由基荧光染料是一种可以与ROS相互作用并发生荧光发射的化学染料。

它们通常包括一个特定的结构单元，可以与ROS发生反应，并通过荧光发射来指示ROS的存在和活性水平。

基于氧自由基荧光染料的荧光测量具有高选择性、高灵敏度和实时性的特点，因此被广泛用于生物医学研究、药物筛选和临床诊断中。

氧自由基荧光染料根据其结构和机制的不同，可分为两类：直接检测型和间接检测型。

直接检测型的氧自由基染料包括二羧酸二苯基二蒽酐（DCFH-DA）、二羧酸荧光（DHE）等。

这些染料可以直接与ROS发生反应并发出荧光信号。

其中，DCFH-DA是其中应用最广泛的染料之一，它可以自由进入细胞，并被细胞内的ROS氧化成荧光发射物DCF。

DCF的荧光强度与ROS的水平成正比，因此可以通过测量DCF的荧光强度来定量检测ROS水平。

间接检测型的氧自由基染料主要是通过与ROS反应生成特定的荧光探针，来间接指示ROS的存在和水平。

这类染料包括柠檬酸二酯、硝基苯、酮酰胺等。

常见的染料是柠檬酸二酯类，其中的最典型代表是二氧化碳染料DCFH-DA。

在体内，这些染料会被细胞内的酯酶分解成对应的ROS敏感染料，荧光信号与ROS浓度成正比。

氧自由基荧光染料的应用已经非常广泛。

在生物医学研究中，研究人员可以利用氧自由基荧光染料来研究ROS与细胞凋亡、细胞增殖、炎症反应等生物学过程的关系。

在药物筛选中，氧自由基荧光染料可用于评估化合物对ROS的清除能力，从而寻找具有抗氧化和抗炎作用的候选化合物。

此外，氧自由基荧光染料还可用于临床诊断，如检测血液中的ROS水平，辅助疾病的诊断和治疗。

总之，氧自由基荧光染料作为一种重要的检测工具，为氧自由基的研究和应用提供了新的途径。