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农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法制备转化用的农杆菌菌液准备：1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。
2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。
1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。
3．步骤：共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。
28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。
用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。
转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。
4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
（注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。
2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。
3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。
4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。
5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。
花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥（2）拟南芥种植取Columbia生态型的拟南芥种子，在EP管中用70%的酒精消毒2-3min，10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5-6次，用0.1%的Top agar混匀，平铺在1/2 MS 培养基上，4℃保湿黑暗条件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、18℃、RH为70%条件下培养。
拟南芥的遗传转化作者：刘晓丽魏楠来源：《河南农业·教育版》2019年第09期摘要：通过构建重组表达载体，转化农杆菌制作浸染液，实现农杆菌介导法进行目的基因的拟南芥遗传转化，将目的基因转入到野生型拟南芥中。
通过筛选和鉴定后，得到阳性的转基因植株，最终得到纯合T3代转基因株系。
后续可以通过对纯合转基因株系和野生型拟南芥进行比较鉴定，即可推断目的基因在拟南芥中的功能。
关键词：拟南芥;遗传转化;实验一、实验材料（一）试验材料转基因所需的菌株：农杆菌EHA105;转基因所需的模式植物：野生型拟南芥;转基因所需的植物表达载体：pCAMBIA3301。
（二）试验试剂本实验所需试剂主要有：Mu-rashige Skoog（MS）培养基：M519（Phyto Technology Laboratories，LLC）;YEB、YEP液体培养基;YEP固体培养基;抗生素氯霉素（chlorampheni-col，Chl）、卡那霉素（kanamycin，Kan）;草铵膦（phosphinothricin，PPT）;v/v（1：5）的次氯酸钠溶液;琼脂;蔗糖;表面活性剂silwetL-77等。
二、实验方法（一）超表达载体的构建采用质粒小提试剂盒提取扩增、测序结果均正确无误的pGM-T-目的基因的质粒，具体步骤如下：第一，取2ml过夜培养的含目的基因的大肠杆菌Trans 5a转化菌液，12，000rpm离心I min，吸除上清;第二，向留有菌体沉淀的离心管中加入150ul溶液P1（已加入RNase A和0.5%的TIANRed），使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀;第三，向离心管中加入150ul溶液P2，温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解;第四，向离心管中加入350ul溶液P5，立即快速地上下颠倒12-20次，充分混匀，将出现絮状沉淀，然后，12，000rpm离心2min;第五，将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。
农杆菌蘸花转化拟南芥法1、将低温保存的带有表达载体的农杆菌菌株，分别在对应抗性平板上划线，挑取单菌落接种于5ml的已加入对应抗生素的液体LB培养基中，28℃下250rpm振荡培养18-24h；2、然后相同条件下按照1:100接种扩大培养，总菌液体积为200ml，直到OD600值在0.8-1.0范围内；3、离心沉淀并去上清液，用等体积的5%的蔗糖溶液重悬菌体，在菌液中加入0.02%-0.04%的SilwetL-77混匀；4、将拟南芥的花序在菌液中蘸取0.5-1min即可(在转化前要先将拟南芥的角果剪掉);5、然后将拟南芥苗放置于黑暗，湿润的条件下16h，一周后，重复侵染一次；6、收种后种植后代，向12d的幼苗上喷洒54mg/ml除草剂或在将种子播种于抗性MS平板上以筛选阳性植株。
拟南芥播种1、将拟南芥种子用50%的84消毒液表面消毒6-8 min，继而用无菌水漂洗3次;2、在0.1%琼脂糖中悬浮，然后播种在抗性的MS培养基上，4ºC低温避光处理2天后，转入光照培养室生长。
3、幼苗7d左右便可筛到阳性植株，并移栽到含有蛭石的营养土中继续生长（蛭石：营养土=1：3）。
植株种植的培养箱维持22℃恒温和16h光照/8h黑暗培养的循环培养条件。
注：几种常用抗生素的工作液浓度Kanamycin 50μg/mlGentamicin 50μg/mlRifampicin 25-50μg/mlHygromycin 50μg/mlBarstar 25-50μg/ml注：MS培养基配方（1L）MS盐 4.4gMES 0.5g蔗糖10g调PH至5.8-6.0加Agar 10g(在抗性MS培养基上筛选阳性转基因植株时可不加蔗糖防止长菌)42. Schägger H, von Jagow G (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.AnalBiochem166:368–379.。
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥一、实验目的1.了解浸花法(floral tip)转化的机理；2.掌握拟南芥浸花法(floral tip)转化的技术二、实验原理拟南芥的花序大量产生时，将其在含有转化辅助剂silwet和蔗糖的农杆菌溶液中浸泡20秒，3-4周后对转化植株收种子。
在含有合适抗生素的平板上对种子进行筛选，能够健康生长的幼苗为转基因植株。
三、实验材料及仪器材料：生殖期的拟南芥植株，含目的基因质粒的农杆菌(PCAMIBIA 3301-ZEP)，无菌滤纸仪器设备：超净工作台，恒温摇床，培养箱，台式高速离心机，涡旋仪，抽滤器，高压灭菌锅，电子天平，酸度计，培养室用具：微量移液器，金属药匙，牙科手术钩或细菌涂布器，100 ml无菌三角瓶，直径9 cm 培养，200 ml及1ml tip枪头，枪形镊四、实验步骤1)当野生型株系的拟南芥植株生长了个月左右。
将其主薹剪掉，待其次生薹长出，浸染前剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花；2)将农杆菌菌液扩大培养接入到250 ml含有50 μg/ml的Kan和Rif的YEP的液体培养基中:3)将装有250 ml YEP液体培养基的500 ml三角瓶置于28℃ 200 rpm下振荡培养24 h;4)分批次将250 ml YEP液体培养基装在50 ml离心管中多次离心，每次7500 rpm离心5 min,直到把所有的农杆菌都聚集在管底；5)用5%的蔗糖溶液。
其中加了0.02%-0.05% (VV)的silwet L-77来重新悬浮聚集在管底的农杆菌，直到把浓度稀释到OD600为1.5左右即可；6)把蔗糖溶液重悬的农杆菌菌液放入50 ml 离心管中，将花盆倒转过来，将花序浸入农杆菌中20 s，轻轻转动和晃动植物，保证腋芽生长的花都能浸到液体溶液中，取出后能看见植物上有一层水膜，轻轻晃动植物3-5 s抖掉过多的液体(花在液体中浸泡时间过长有所伤害)。
7)浸染过得植株放置在塑料盆中并用一个高的遮光的袋子遮住植株以保持其湿度,并将盆置于弱光或黑暗的条件下一天；8）将其遮光袋拿去，移到智能气候室培养，并定期补浇营养液，直到角果成熟收获种。
拟南芥转化—浸花法实验步骤：关键记录：a浸染的最好阶段是一个花盆里有20-30个花絮以及一些成熟的果夹，这些果夹浸染之前需要剪掉。
b/颠倒植株将植株浸入农杆菌细胞悬浮液10s。
c.塑料膜包裹保持黑暗高湿度16-24h。
一周后可再次侵入农杆菌细胞悬浮液浸染。
d.移去塑料膜，让植株在温室中生长一个月。
e.干燥成熟的果夹用小袋套住。
f.筛选主要转基因植株在筛选培养基上。
说明：如果转化实验要延迟或者构建没有准备好又或者想要植株有很多的花序，可以剪掉植株第一次的抽苔，使其长出更多的分支和花序，在剪去第一个抽苔的6-8天后，开始农杆菌悬浮液浸染。
如果希望增强营养来支持转化的细胞，同时又减少野生型种子（即增加转化效率）以及减少筛选主要转基因植株期间真菌病害。
去掉用于转化植株上的果夹。
具体步骤：1.已转化的农杆菌在含抗生素筛选培养基上长出单克隆，对鉴定后确定转化成功的单克隆于5ml液体YEP培养基（含抗生素）28℃活化培养16h。
2.取适量（1:50）活化培养的菌液于50ml液体YEP培养基（含抗生素）中28℃扩大培养6h。
注意：在此要鉴定是否为正确的转化农杆菌，酶切、PCR均可。
确认后，为了下次转化浸染，可以在这一步将农杆菌甘油管-70℃保存或者将菌液密封保存于4℃,高达1个月。
3.将20ml农杆菌细胞悬浮液于4000g、10min室温离心，加入1倍体积的10mM MgCl2,5%蔗糖溶液（即100ml H2O中加MgCl2·6H2O 0.202g，蔗糖 5g）。
浸染前加表面活性剂使其终浓度为0.02%（20ml加4uL）。
混匀，转移至50ml离心管。
注意：表面活性剂浓度过高有毒害。
为了产生含两种独立载体的转化植株，我们要用两种农杆菌细胞，各含有一种载体，分别加入30mL 10mM MgCl2,5%蔗糖溶液，浸染前加入适量表面活性剂，将它们混合在一个大烧杯里。
在双转化试验中我们至少要用48株植株。
间隔7天进行第二次浸染植株。
拟南芥的花浸渍转化方案
拟南芥的花浸渍转化是利用其遗传特性实现不同的目的的一项技术。
通常来说，拟南芥的花浸渍转化方案分成三个步骤：1）花粉培养 2）植物体系建立 3）转基因表达系统构建。
首先，在进行拟南芥花浸渍转化方案时，花粉培养是必不可少的一个步骤。
在该步骤中，
一般利用磷酸三钠、核酸抗凝剂、复合氮肥和碳源构建适宜的花粉培养基，利用此基础培养拟
南芥花粉以便获得正常受精细胞。
其次，完成花粉培养和受精细胞形成后，将进行植物体系的建立。
在此步骤中，需要构筑
一个适宜的植物大培养体系，一般以磷酸铵、硝酸钾、硫酸钙和无机氮构建营养基，并加入2％的半乳糖等激素以利于受精细胞的胚胎发育，建立起适宜的植物体系。
最后，构建转基因表达系统，这是拟南芥花浸渍转化中最重要也是最复杂的一步。
常用的
基因载体可以分为普通的DNA质粒和Agrobacterium质粒载体，其中保护基因所需的抗生素
标记也不相同，它们分别是：对于普通的DNA质粒，采用Kanamycin标记；而对于Agrobacterium质粒载体，采用Bastinomycin标记。
在此步骤中，我们还需要将培养好的转
基因拟南芥细胞接种到拟南芥的植株上，以便获得转基因拟南芥以及转基因表达分析。
总之，拟南芥的花浸渍转化方案具有较强的通用性，可以用于实现拟南芥的转基因技术。
此外，拟南芥的花浸渍转化方案分为三个步骤：花粉培养，植物体系建立和转基因表达系统的
构建。
与传统的转基因技术相比，拟南芥的花浸渍转化方案具有更快的获得转基因拟南芥的速度，同时也具有更高的成功率，可以为科研活动提供更高的效率和更好的效果。
拟南芥的遗传转化（花序浸泡法）
1.培养基
YEP培养基：蛋白胨10g/L 酵母提取物10g/L
NaCl 5g/L 固体琼脂粉15g/L
2.拟南芥材料
培养拟南芥直到它们开始抽苔并产生花序（为了让植株产生更多不成熟的花序，需要推迟转化实验，将抽出的第一个苔剪去，以便于莲花座上腋芽分化出的第二花序的增值）。
3.拟南芥的遗传转化
1)含有目的基因的双元载体转化农杆菌，并接种当菌斑到5ml含有
适当抗生素的YEP液体培养基中，28℃培养2天。
2)再将这一培养基内注入500ml带有适当抗生素的YEP液体培养
基，并在28℃条件下培养16-24小时，使用生长达到稳定期的细胞（OD=1.0-1.6）
3)室温下4000rpm离心10分钟，收集农杆菌细胞，然后加入新制的
5%蔗糖，轻轻悬浮细胞，使OD =0.6-0.8
加入Silwet L-77至浓度0.05%，立刻混匀。
将农杆菌悬浮细胞转移到大的平皿中，用于侵染。
注：Silwet L-77可能有毒，腰带手套保护皮肤。
4)倾斜植株，使所有的花序都浸泡在农杆菌溶液中，浸泡时间1.5-2
分钟，取出后轻轻煽动10秒，控干3-5秒，将植株横放，暗处培养16小时，再恢复光照。
5)为了提高转化效率，可以浸泡植株两次，中间相隔7天。
6)分株收种子，并在含有合适抗生素的MS培养基上萌发，筛选得
到T1转基因拟南芥。
浸花法转化拟南芥拟南芥受体材料选择：将拟南芥种植在16h/8h 光照/黑暗条件，20℃到22℃，拟南芥移栽后大约两周进入花期，如果剪去主苔，侧苔大约需要1-2周进入花期；待其刚刚开花，只形成1-2个角果时，即可用于转化，此时花蕾状态最佳。
转化前将角果及已完全开放的花蕾剪去，仅留下刚刚露白及幼嫩花蕾。
浸花法转化拟南芥①接种单个菌落于5 mL YEB培养基（利福平10 μg/mL，卡那霉素100 μg/mL）中，培养过夜；②1：100扩培到500 mL YEB的锥形瓶中，继续摇培12 hr左右至生长密度为OD600值1.0-1.2；③室温，5500 g离心15 min收集菌体；④用转化介质(0.5×MS大量元素，1×MS微量元素，1×铁盐，1×MS有机，5%的蔗糖，0.05% Silwet L-77，0.5 g/L MES，1X B5 vitamins ,0.01 mg/L 6-BA，pH 5.7)悬浮菌体密度至OD600为0.8左右；⑤将含有农杆菌的转化介质倒入100 mL烧杯中，将刚刚开花的拟南芥倒置其上，使得整个花序连同莲座基部的叶片都浸入转化介质中，（抽真空？）维持5 min；如果再次侵染，一般两次侵染之间间隔时间为6-7天比较好。
⑥取出拟南芥，将其侧卧放在干净的塑料托盘上，并用薄膜覆盖避光保湿恢复24 hr；⑦将拟南芥扶起，培养液浇透后，放在光下正常培养，转化后植株正常的开花生长，3-4周待长角果完全枯黄、欲开裂时，即可收获种子。
注：1、YEB培养基：Beef extract (牛肉浸膏) 5g/L，Yeast extract (酵母膏) 1g/L，Peptone (蛋白胨) 5g/L ，Sucrose (蔗糖) 5g/L ，MgSO4·7H2O 0. 4g/L，Agar (琼脂) 15g/L，pH 7.4（《分子克隆实验指南》校对）2、MES：2-(N-Moropholino)ethanesulfonic acid，2-(N-吗啡啉)乙磺酸，用于配制细胞培养和酶学测定生物缓冲液。
拟南芥转化1农杆菌感受态细胞的制备挑取根癌农杆菌GV3101单菌落于5 ml含100 μg/ml利福平(Rifampicin)，50 μg/ml卡那霉素(Kanmycin)和50 μg/ml庆大霉素(Genmycin)的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；取过夜培养菌液500 μl接种于 50 ml LB(含相应抗生素)液体培养基中，28℃振荡培养4-8小时(OD600为0.5-0.8)；冰浴30分钟，4,000 rpm，4℃离心10分钟，加入10 ml预冷的 20 mM CaCI2悬浮农杆菌细胞，4000 rpm，4℃离心10分钟；加入2 ml预冷的 20 mM CaCl2悬浮细胞，冰浴，分装成每管100 μl，液氮中速冻后，置-80℃保存备用。
2.质粒转化农杆菌 GV3101将构建的带有目的基因的质粒pCAMBIA-1304-plc转化 (冻融法) 根癌农杆菌GV3101，步骤如下：1) 从-80℃冰箱中取出 GV3101 感受态细胞 (100 μl)，置于冰上解冻；2) 加入 5 μl 含目的基因的质粒，轻轻混匀；冰水浴 5 min； 3) 液氮冷冻8 min； 4) 37℃水浴热激 5 min；5) 加入 900 μl LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养基后于 28℃，160 r/min 振荡培养3－5 h 复苏；6) 复苏结束后于 4000 r/min 室温离心 5 min；7) 吸去 800 μL 上清，然后重悬菌体，将菌体涂布于 LB/ (Gen + Kan + Rif) 固体平板上；8) 28℃倒置培养 2 d 直至长出阳性菌落；9) 挑取单克隆菌落，经 LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养，通过菌落 (液) PCR 验证，以确认是否成功转化。
经验证转化成功的农杆菌经即可用于后期拟南芥转化用。
（3拟南芥的转化在拟南芥抽苔4-5厘米时剪去主枝顶端，促进侧枝生长，约4-5天后进行转化，转化前要使土壤充分湿透，拟南芥苗要打药杀虫。
拟南芥转化—浸花法
实验步骤：
关键记录：
a浸染的最好阶段是一个花盆里有20-30个花絮以及一些成熟的果夹，这些果夹浸染之前需要剪掉。
b/颠倒植株将植株浸入农杆菌细胞悬浮液10s。
c.塑料膜包裹保持黑暗高湿度16-24h。
一周后可再次侵入农杆菌细胞悬浮液浸染。
d.移去塑料膜，让植株在温室中生长一个月。
e.干燥成熟的果夹用小袋套住。
f.筛选主要转基因植株在筛选培养基上。
说明：
如果转化实验要延迟或者构建没有准备好又或者想要植株有很多的花序，可以剪掉植株第一次的抽苔，使其长出更多的分支和花序，在剪去第一个抽苔的6-8天后，开始农杆菌悬浮液浸染。
如果希望增强营养来支持转化的细胞，同时又减少野生型种子（即增加转化效率）以及减少筛选主要转基因植株期间真菌病害。
去掉用于转化植株上的果夹。
具体步骤：
1.已转化的农杆菌在含抗生素筛选培养基上长出单克隆，对鉴定后确定转化成功的单克隆于5ml液体YEP培养基（含抗生素）28℃活化培养16h。
2.取适量（1:50）活化培养的菌液于50ml液体YEP培养基（含抗生素）中28℃扩大培养6h。
注意：在此要鉴定是否为正确的转化农杆菌，酶切、PCR均可。
确认后，为了下次转化浸染，可以在这一步将农杆菌甘油管-70℃保存或者将菌液密封保存于4℃,高达1个月。
3.将20ml农杆菌细胞悬浮液于4000g、10min室温离心，加入1倍体积的10mM MgCl2,5%蔗糖溶液（即100ml H2O中加MgCl2·6H2O 0.202g，蔗糖 5g）。
浸染前加表面活性剂使其终浓度为0.02%（20ml加4uL）。
混匀，转移至50ml离心管。
注意：表面活性剂浓度过高有毒害。
为了产生含两种独立载体的转化植株，我们要用两种农杆菌细胞，各含有一种载体，分别加入30mL 10mM MgCl2,5%蔗糖溶液，浸染前加入适量表面活性剂，将它们混合在一个大烧杯里。
在双转化试验中我们至少要用48株植株。
间隔7天进行第二次浸染植株。
小心：戴手套及口罩防止表面活性剂的毒害。
4.浸染时将农杆菌悬浮液倒满50mL离心管的小盖子，将拟南芥横放使花序浸入小盖子中的悬浮液10s，轻微晃动小盖，20ml农杆菌悬浮液至少有效用于转化30株拟南芥， 150个花序以上，这一步骤要保证能在植株上看到菌液。
注意：确定所有花盆都已浸染，有时很有必要浸染整个植株确保浸染更短更多的花芽。
将过多的农杆菌液移除也很重要。
否则长时间
的处于农杆菌溶液中会对植株有伤害。
另外，我们还可以使用移液枪吸取农杆菌溶液滴或者喷洒农杆菌溶液确保浸染所有花序。
对于生态型Ler-0，我们将农杆菌细胞悬浮于10mM MgCl2,5%蔗糖和0.02%表明活性剂混合液，悬浮液浸染10min。
（这与其他生态型浸染10s不同）
5.塑料膜包滚植株让浸染后的植株保持16-24h高湿度黑暗24h。
注意：不要将植株置于高温或强光照，避免烧死。
Treat the remaining Agrobacterium cell suspension with 1 volume of Clorox bleach to kill the bacteria before disposal of the suspension
6.次日去掉包裹的塑料，将浸染后的拟南芥放回温室，是它们正常生长一月，果夹掉落之前保持浇水。
待收集果夹。
注意：畸形发育和不完整成熟的种子会发生在早早结束浇水或者快速干旱的转化植株。
这会导致转化种子仅有单一的子叶而没有真叶。
TIMING
Growth of Arabidopsis plants: 2 months
Growth of agrobacteria and floral dipping transformation: 3 d
Seed set and maturation of transformed seeds: 1 month Screening of primary transformants: 10–14 d
栽培过程问题分析解决方案：
1.植株有很多花但是种子很少
很有可能由于水太多光照不足引起，除去过多水分仅仅使水分覆盖托盘即可。
增强光照及花盆间距。
2.没有转化
错误的载体，不适当的抗生素浓度造成。
确定农杆菌含有质粒，同时，确定使用合适的抗生素浓度。
3.除草剂喷洒后所有种子sowed
喷洒过晚以至于非转化发育完善可以在抗生素下生存。
可以早些喷洒除草剂。
