第18章 色谱分离原理

多肽分离图
自动化
分离分析新技术
✓毛细管电泳 ✓全二维气相色谱 ✓液相色谱－气相色谱联用 ✓液相色谱－液相色谱联用 ✓色谱－质谱联用* ✓样品处理技术
色谱法的定义与分类
色谱法是一种物理化学分析方法，它利用 混合物中各物质在两相（固定相和流动相） 间的分配系数的差别，当两相作相对运动 时，各物质随流动相运动，并在两相间进 行多次分配，从而使个组分得到分离。
塔板理论的成功与不足
不足：
–无法回答的问题
1.实验参数如填料的大小、分子结构、温度等对色谱 峰形以及塔板数和塔板高度的影响
2.理论塔板高度与流速有关
速率理论 (van Deemter)
➢色谱峰展宽的因素 ➢速率理论方程 ➢其它因素
速达到平衡。H称为理论塔板高度。 ✓ 流动相进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进
入的流动相体积为一个塔板体积。 ✓ 所有组分开始时存在于第0号塔板上，且试样的纵向扩散
可忽略。 ✓ 分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量
无关。
流出曲线方程
• 当塔板数 n >50, 色谱流出曲线趋于正态分布
chromatography) ✓排阻色谱 (size exclusion chromatography) ✓亲和色谱 (affinity chromatography)
按色谱操作方式不同分类
✓迎头色谱 (frontal chromatography) ✓顶替色谱 (displacement
chromatography) ✓洗脱色谱 (elution chromatography)
按流动相的物理状态分类
✓气相色谱
– 气固色谱 – 气液色谱
✓液相色谱
– 液液色谱 – 液固色谱
✓超临界流体色谱
பைடு நூலகம்
按分离机理分类
✓分配色谱 (partition chromatography) ✓吸附色谱 (adsorption chromatography) ✓离子交换色谱(ion exchange
《仪器分析》
➢王 红 –光分析 –其它
➢冯钰锜 –色谱分析 –电分析
课程报告
题目：“我想象中的一种未来仪器分析方法 ”
要求：文体不限；100％ 100分 时限：期末考试前
参考书目
• 《仪器分析》武汉大学化学系 2001 • 《仪器分析》赵藻藩等 高教出版社 1996 • 《仪器分析教程》 北京大学出版社 • 《仪器分析》（第三版）朱明华 高教出版社 • 《仪器分析原理》方惠群等 南京大学出版社。 • 相关仪器分析方法的专著
• 1903年 Tswett （茨维特）
Tswett (1872–1919).
In this building of Warsaw University, Mikhail Semenovich Tswett invented the chromatographic technique. There is a memorial plaque on the wall of the building.
第18章 色谱法导论
18-1 概述 18-2 色谱基本术语 18-3 色谱法基本理论 18-4 分离度 18-5 定性和定量分析
本章学习要点
➢色谱基本术语 ➢三大关系式：
– 保留方程 – 速率理论方程 – 基本分离方程
➢色谱定量方法
本章作业
1. 请解释保留时间和调整保留含义。 2. 衡量色谱柱柱效能的指标是什么?衡量色
R nm nm ns
流动相平均流速u和溶质谱带移动速度ux
u L tM
ux
L tR
四、溶质保留方程
ux R u
L nm L
tR
nm ns tM
1 1 1
tR
1 ns tM
nm
k tR tM t'R
tM
tM
•k
溶质保留方程
t
四、溶质保留方程
• 分离因子 = t’R2 / t’R1 = k2 / k1
色谱法的发展
✓ 1931年 Kuhn 等用氧化铝和碳酸钙分离了α-,β,γ-胡萝卜素等60多种植物色素
✓ 1941年 Martin 和 Synge建立了液液分配色谱法 并提出气相色谱的设想
✓ 1952年 Martin等发明了气液色谱法 ✓ 1952年 Martin 和 Synge 获得诺贝尔化学奖
色谱流出曲线
半峰宽 基线宽度
标准偏差
半峰宽度、基线宽度 与标准偏差的关系
Y1/ 2 2.354 Y 4
18-3 色谱法基本理论
➢色谱分离过程 ➢塔板理论 ➢速率理论
色谱分离过程
改进分离的两种途径
塔板理论(Martin & Synge)
✓ 色谱柱是由一系列连续的、相等的水平理论塔板组成 ✓ 在每一块塔板(高度H)中溶质可以在流动相与固定相中迅
超高效液相色谱（UPLC）
The sample was run using constant-flow pumps at 52 000 psi on a 38cm long capillary packed with 1.0 µm C18 particles.
芯片液相色谱
ZORBAX 300SBC18 5 µm particles H.-F. Yin et al., presented at the 18th International Symposium on Microscale Separations and Analysis, HPCE, San Diego, January 2003.
• n 和 H可作为描述柱效能的指标
有效塔板数和有效塔板高度
n有效
5.54
t' Y1
R /2
2
16 t'R Y
2
H 有效
L n有效
• 同一色谱柱对不同物质的柱效能是不一样的，当 用塔板数和塔板高度表示柱效能时，必须说明对
什么物质而言
塔板理论的成功与不足
• 成功点：
–流出曲线的形状 –浓度极大点的位置 –计算和评价柱效能的指标（n, H)
A.J.P. Martin
R.L.M. Synge
色谱法的发展
✓1957年Goley开创了毛细管气相色谱 ✓1960年代末出现高效液相色谱法 ✓1980年代超临界流体色谱得到发展 ✓1980年代Jorgeson发展了高效毛细管电泳 ✓1990年代后期毛细管电色谱得到重视和发
展
液相色谱分离速度的变化
✓ 1950年代为石油工业的发展作出了贡献 ✓ 1960-1970年代成为石油化工、化学工业等部
门的分析检测手段 ✓ 目前，色谱法已成为生命科学、医药科学、环
境科学、材料科学、食品科学、法庭科学以及 航天科学等研究领域的重要手段
发展趋势
✓进一步发展高效分离技术 ✓小型化、微型化、自动化 ✓各种联用技术 ✓样品处理技术 ✓高通量
色谱法的分类
✓按固定相的使用形式 ✓按流动相的物理状态 ✓按分离机理 ✓按色谱操作方式不同 ✓按流动相和固定相的极性不同 ✓按用途不同分类
按固定相的使用形式分类
✓柱色谱 (column chromatography)
✓平板色谱 (planar chromatography)
– 纸色谱 (paper chromatography) – 薄层色谱 (thin layer chromatography)
➢发展晚于GC和HPLC ➢虽然具有一些独特用途，但大多数功能可
由GC和HPLC代替
✓毛细管电泳与毛细管电色谱
➢为基因组学研究作出了杰出贡献 ➢目前存在的主要问题：
– 分析结果偏差大 – 比HPLC大一个数量级
➢机遇：分离分析生物大分子
色谱法在工业生产和科学研究中的作用
✓ 1930-1940年代为分离复杂的生物组成发挥了 独特作用
超高效液相色谱（UPLC）
chromatogram obtained under isocratic conditions on a 43 cm long capillary column packed with 1.0 µm non-porous C18 particles (Eichrom Scientific).
– 在平衡状态下组分在固定相与流动相中的质量 之比
k = ns / nm
四、溶质保留方程
• 溶质通过色谱柱的速度或保留值的大小是 由每一瞬间该溶质在流动相中的分子分数 决定的。
• 设流动相的平均流速为 u，溶质 x 谱带在色 谱柱中的移动速度为 ux ux = Ru
四、溶质保留方程
R为溶质 x 在流动相中分子数与总分子数之比
c
c0
t tR 2
e 2 2
2
• c0 进样浓度，c为时间t时柱出口浓度
色谱流出曲线
理论塔板数与理论塔板高度
• 由塔板理论可以得到理论塔板数 n 与色谱峰半峰宽度或基 线宽度的关系
n
5.54
tR Y1/ 2
2
16
tR Y
2
HL n
• 色谱峰越窄，理论塔板数越多，理论塔板高度越小，柱效 能越高
• 分配系数 K
K Cs ns /VS Cm nm /VM
k K VS K
VM
• 称为相比*
四、溶质保留方程
• 根据保留体积与保留时间的关系 k = (VR-VM)/VM
VR = KVS+VM
温度 溶质形态
固定相性质
K
流动相性质
五、区域宽度
• 标准偏差 • 半峰宽 Y1/2 • 基线宽度 Y
谱柱选择性的指标是什么？ 3. 请写出色谱基本理论中的三个基本方程，
并指出各符号含义。 18-5，7, 9, 13, 20