金黄色葡萄球菌的检查

金黄色葡萄球菌检测方法Revised as of 23 November 2020金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。

采用快速测试片检测具有显着的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。

技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。

技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。

此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。

但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。

使目视效果下降，导致计数偏低。

2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。

抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。

金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。

在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。

目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。

免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。

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定性方法
2003版
结 果 判 定
划线Baird-Parker平板：
§菌落直径为2mm～3mm ； §颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外 层有一透明圈； §用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非 脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈；
§长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产 生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥；
方法的注意事项
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使用前，如Baird－Parker平板表面有水珠，可放 在25℃～50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的 水珠消失。 如样液不易吸收，可将平板放在36℃±1℃孵育 1 h；等样液吸收后反转平皿， 再培养。
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Baird-Parker法
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计算
统一了样品的处理程序 增加了计数要求 选择20—200cfu菌数的平板
ml 无 加 10 10ml 菌水溶解
于37°C 下进行孵育 24小时
Baird Parker 琼脂 + RPF 与平板表面计数法的比較
g样品 + 225 ml 稀释液 25 25g 225ml
第一天
第二天
BPA+RPF BPA
阅读結果 ) (无需确认 无需确认)
挑可疑菌落 酶试验 进行凝固 行凝固酶试验
第三天
确认结果
MPN法
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依据
AOAC 987.09 FDA BAM 2001 德国 DIN EN ISO 6888-3:2003 SN0172-92标准 台湾检验方法 欧美国的一些产品的卫生标准要求
图 1 Baird －Parker 平板法检验程序 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌Baird Baird－ Parker平板法检验程序

金黄色葡萄球菌的检查同学们，这一节我们一起来学习一下第四章微生物限度检查法中的金黄色葡萄球菌的检查。

金黄色葡萄球菌为葡萄球菌属中的一种。

本菌在自然界分布甚广，空气、土壤、水和日常用具，人的皮肤。

看，这就是金黄色葡萄球菌，它是一种革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。

该菌是葡萄球菌中致病力最强的一种，可经皮肤、粘膜侵入人体引起化脓性病变等局部及全身化脓性炎症，严重时可导致败血症。

所以，国家规定外用药品和一般滴眼剂、眼膏剂、软膏剂等规定不得检出金黄色葡萄球菌，检验金黄色葡萄球菌有重要意义。

金黄色葡萄球菌的操作流程如图所示，与之前讲述过的其他控制菌的检查一样：在完成培养基的配制和供试品的处理后，用营养肉汤于30～35℃增菌培养18～24小时，必要时可延至48小时。

增菌培养的目的使被检药物中的被检菌增殖，避免出现漏检。

接着，进行分离纯化，其目的是使被检菌从混合菌中分离出来。

以接种环沾取以接种环沾取1～2环培养液，划线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂平板上，置30～35℃培养24～72小时。

当阳性对照平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，或有菌落生长但不同于表中所列特征，可判为未检出金黄色葡萄球菌。

若供试品分离平板生长的菌落与表中所列特征相似疑似时，应选取2～3个以上菌落，分别接种于营养琼脂斜面上，于30～35℃培养18～24小时，取其培养物做以下检查。

1. 革兰染色镜检革兰染色镜检观察显微镜下的细菌结构是否符合金黄色葡萄球菌的形态特征：金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌，无芽孢，无荚膜。

排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列，菌体较小。

2. 血浆凝固酶试验金黄色葡萄球菌能产生血浆凝固酶，能将血浆里的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，使血浆凝固。

检查时，轻轻将试管倾斜（动作勿大），仔细观察，阴性对照管血浆应流动自如，阳性对照管血浆应凝固状，若试验管液血浆凝固为血浆凝固酶试验阳性；否则为阴性。

金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。

采用快速测试片检测具有显着的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。

技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。

技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。

此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。

但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。

使目视效果下降，导致计数偏低。

2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。

抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。

金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。

在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。

目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。

免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。

实验六金黄色葡萄球菌检验（第二篇）1 目的1.1 了解金黄色葡萄球菌检验原理1.2 掌握金黄色葡萄球菌鉴定要点和检验方法2 原理葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。

金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。

可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。

如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。

金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。

这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。

3 材料3.1 样品奶、肉、蛋、鱼制品和饮料等。

3.2 菌种金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）3.3 培养基与试剂7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-parker氏培养基、无菌盐水、兔血浆、革兰氏染色液。

3.4 其它显微镜、温箱、离心机、无菌吸管、无菌试管、无菌平皿、均质器、载玻片、L型涂布棒、酒精灯、接种环等。

4 流程5 步骤5.1 一般培养称取25g固体样品，加入225mL无菌生理盐水，制成混悬液(液体样品可不稀释)。

吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50mL培养基内，同时挑取混悬液或液体样品直接在血平板和Baird-Parker平板划线分离。

同时将对照菌种在上述两种平板上作划线分离接种。

置36±1℃温箱培养24h。

5.2 分纯培养将上述血平板和Baird-Parker平板上挑取可疑菌落,先观察对照的菌落特征,再观察被检样品的菌落.,并挑取可疑菌落在血平板上进行分离纯化。

若无菌落生长，可用也增菌培养物在上上述平板上划线分离，在36±1℃温箱培养24h后再分离纯化，挑取可疑菌落及对照菌种进行革兰氏染色及血浆凝固酶试验。

金黄色葡萄球菌的测定1 卫生学意义金黄色葡萄球菌定性检验（增菌培养法）：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。

2 检验方法2.1 术语与定义金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为一种革兰氏染色阳性球形细菌。

显微镜下排列成葡萄串状，金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜。

是常见的引起食物中毒的致病菌。

常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜。

2.2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：（1）恒温培养箱：36℃±1℃。

（2）冰箱：2℃～5℃。

（3）恒温水浴箱：37℃～65℃。

（4）天平：感量0.1g。

（5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

（6）无菌锥形瓶：容量100mL、500mL。

（7）无菌培养皿：直径90mm。

（8）pH计或pH比色管或精密pH试纸。

2.3 培养基和试剂（1）7.5%氯化钠肉汤1）成分：蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0g；氯化钠：75g；蒸馏水：1000mL；pH：7.4；2）制法：将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。

（2）B－P琼脂平板1）成分：胰蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0 g；酵母膏：1.0g；丙酮酸钠：10.0g；甘氨酸：12.0g；氯化锂（LiCl·6H2O）：5.0g；琼脂：20.0g；蒸馏水：950mL；pH：7.0±0.22）增菌剂的配法：30%卵黄盐水50mL与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL 混合，保存于冰箱内。

3）制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH。

分装每瓶95mL，121℃高压灭菌15min。

临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL摇匀后倾注平板。

培养基应是致密不透明的。

使用前在冰箱储存不得超过48h。

金黄色葡萄球菌检验原理
金黄色葡萄球菌检验的原理是通过培养和鉴定来确定细菌是否为金黄色葡萄球菌。

具体步骤如下：
1. 培养：将样本在含有富含营养物质的培养基上进行培养。

金黄色葡萄球菌在常见的琼脂培养基上能够快速生长并形成典型的黄色菌落。

2. 鉴定：通过一系列的生化反应和特征性实验来确认细菌的身份。

金黄色葡萄球菌一般具有以下特征：
- 革兰氏染色：呈阳性，即菌体呈紫色。

- 非运动性：无鞭毛或鞭毛不活跃。

- 产生黄色色素：金黄色葡萄球菌能够产生一种特殊的黄色色素，使得菌落呈现金黄色。

3. 确认：通过进一步的检测，如凝胶酶试验和DNA鉴定等，来进一步确认菌株是否为金黄色葡萄球菌。

金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌，可以引起多种感染，如皮肤感染、呼吸道感染和食物中毒等。

通过对其进行准确快速的检验可以帮助医生进行针对性治疗和控制传播。

金黄色葡萄球菌检验技术介绍及分析金黄色葡萄球菌是一种常见的细菌，它是引起人体多种感染的病原菌之一。

金黄色葡萄球菌检验技术是通过分离、培养和鉴定来检测和确定金黄色葡萄球菌的存在与类型。

以下是金黄色葡萄球菌检验技术的介绍及分析。

金黄色葡萄球菌的分离是检验的第一步。

样品通常是从患者的伤口、分泌物或体液中获取的，也可以从环境中收集。

分离可以通过将样品涂抹到适当的察尔染色的琼脂平板上，然后进行培养和鉴定来完成。

金黄色葡萄球菌会在琼脂平板上形成金黄色的菌落。

培养是金黄色葡萄球菌检验的关键步骤。

常用的培养基包括牛肉蛋白胨琼脂、亚洲互联网的Tag：脑心制剂琼脂、亚洲互联网的Tag：镜光菌属琼脂等。

金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性球菌，它可以在各种营养富集培养基中生长，但最好使用富含血液、蛋白质和碳水化合物的培养基。

培养的时间通常为24小时，金黄色葡萄球菌菌落会呈现金黄色且凸起。

鉴定是确认金黄色葡萄球菌的类型的步骤。

鉴定方法包括形态学观察、生化试验和分子生物学方法。

形态学观察是通过显微镜观察菌落和细胞形态来判断。

金黄色葡萄球菌是圆形或椭圆形的，常呈簇状分布。

生化试验可以通过检测金黄色葡萄球菌对特定底物的代谢能力来进行鉴定。

一些常用的测试包括氧化酶试验、半乳糖发酵试验等。

分子生物学方法可以通过检测特定基因或DNA序列来鉴定金黄色葡萄球菌。

金黄色葡萄球菌检验技术的分析主要集中在以下几个方面。

金黄色葡萄球菌的检验可以帮助医生确定感染的病原菌，从而指导合理的治疗方案。

金黄色葡萄球菌是耐药菌中的重要成员，对多种抗生素具有耐药性，因此及早检测和鉴定金黄色葡萄球菌可以避免无效的药物治疗。

金黄色葡萄球菌还可以引起食物中毒和医院相关感染等，检验技术的应用可以有助于减少相关疾病的发生。

金黄色葡萄球菌的检验(定性检测)一．金黄色葡萄球菌的生物学特性金黄色葡萄球菌革兰氏阳性球菌，直径为0.8-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群；无芽孢，无鞭毛、无荚膜、不运动；兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；大多数菌株产生类胡萝卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，故称金黄色葡萄球菌，营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃，最适生长pH 7.4。

普通平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。

血平板菌落周围形成透明的溶血环。

主要存在于主要为淀粉类(如剩饭、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及鱼、肉、蛋类等。

二、培养基7.5%的氯化钠（三角瓶135mL）；BP平板培养基；血平板培养基；BHI肉浸液肉汤培养基（试管5个）。

三、金黄色葡萄球菌的定性检测主要包含四个步骤：样品处理；增殖培养；平板分离培养；鉴定（染色镜检和血浆凝固酶实验）。

1.样品的处理和增殖培养：样品为冷冻鱼丸，每组称量15g，放于研钵中，用研磨棒捣碎，放于135mL 7.5%的氯化钠肉汤中进行增菌培养，36℃±1℃培养18h～24h后，可观察到金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。

2.血平板划线培养：将样品增菌培养物，用接种环取一环划线接种于血平板上，36℃±1℃培养18h～24h。

（每组2个血平板接种增殖样品，1个平板划线接种金黄色葡萄球菌，每组共3个血平板）。

金黄色葡萄球菌在血平板上的菌落特征：菌落较大，圆形，光滑突起，湿润，金黄色（有时为白色），菌落周围为完全透明溶血圈。

3.BP平板划线培养：将样品增菌培养物，用接种环取一环划线接种于BP平板上，36℃±1℃培养18h～24h。

（每组2个BP平板接种增殖样品，1个平板划线接种金黄色葡萄球菌，每组共3个BP平板）。

金黄色葡萄球菌在BP平板上的菌落特征：菌落直径2-3mm，颜色从灰色到黑色，边缘为淡色，周围有一浑浊带，其外层有一透明圈，用接种针触碰有奶油树脂的硬度。

金黄色葡萄球菌的肠毒素
金黄色葡萄球菌肠毒素：是金黄色葡萄球菌一 种重要的致病物质。本菌引起的食物中毒是因 为食品污染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大 量肠毒素而导致的。
近年报导表明，50%以上的金黄色葡萄球菌菌株 在实验室条件下可产生肠毒素，并且1个菌株能 产生两种或两种以上的肠毒素。
肠毒素是一种可溶性蛋白质，由单个无分枝的 肽链组成。分子量约为3000左右。易溶于水， 难溶于有机溶剂。
分离培养基
Baird-Parker琼脂：培养基中含有卵黄亚 碲酸钾，能抑制大多数细菌的繁殖，并能 促进金黄色葡萄球菌的生长使其产生黑色 和晕圈。培养基中的丙酮酸钠和甘氨酸也 能促进金黄色葡萄球菌的生长。
金黄色葡萄球菌的菌落形态：圆形、光滑 凸起、湿润，直径约2~3mm，颜色呈灰色到 黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在 其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似 有奶油树胶的硬度，偶而可见无混浊带和 透明圈的非典型菌落。
血浆凝固酶试验
挑取Baird－Parker平板或血平板上可疑菌落 1个或以上，分别接种到5mL BHI和营养琼脂 小斜面，36℃±1℃培养18 h～24 h。
取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再 加入可疑菌落的BHI培养物0.2mL～0.3mL，振 荡摇匀，置36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半 小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将 试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积 大于原体积的一半，判定为阳性结果。
金黄色葡萄球菌的菌落形态：呈金黄色， 有时也呈白色，大而突起，圆形、不透明、 表面光滑，周围有透明的β溶血环。
血平皿上的形态
血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素， 因此在血平板上产生明显的溶血环。
典型菌落：呈金黄色，有时也为白色，大而 突起，圆形，不透明，表面光滑，菌落周围 有完全透明溶血环。

金黄色葡萄球菌的检测（GB 4789.10-2016）1 金黄色葡萄球菌1.1 金黄色葡萄球菌(1)葡萄球菌属微球菌科；(2)金黄色葡萄球菌为格兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无鞭毛、芽胞，少数有荚膜，不能运用，直径约为0.5 μm-1μm；(3)金黄色葡萄球菌科引起化脓性炎症，又称化脓性球菌；除此之外，金黄色葡萄球菌还会分泌很多毒素，是引起食源性疾病的原因之一；(4)金黄色葡萄球菌易培养，对营养要求不高，兼性厌氧；(5)金黄色葡萄球菌抵抗外届不良环境的能力很强，在80 ℃条件下加热达到30min才能使其死亡。

1.2 鉴定依据(1)格兰氏阳性；(2)能产生溶血毒素，时血平板（BP平板）出现溶血现象；(3)凝固酶，使血浆凝固。

1.3 鉴定流程25 g（25 mL）样品+225 mL 7.5%NaCl肉汤或者15%NaCl胰酪胨大豆肉汤BP平板、血平板36℃24h1、格兰氏染色2、观察溶血3、BHI肉汤和营养琼脂斜面36℃24h血浆凝固酶实验报告1、金黄色葡萄球菌产生的蛋白酶的种类？2、溶血圈为什么是透明的？2、金黄色葡萄球菌导致食源性疾病的原因？4、金黄色葡萄球菌的定量？5、BP平板和血平板的特征菌落？2 解疑2.1 金黄色葡萄球菌产生的蛋白酶的种类？蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶菌酶。

2.2 溶菌圈为什么是透明的？（1）金黄色葡萄球菌可以产生4种溶血素，α、β、γ、δ四种；（2）溶血素使得红细胞裂解，其中的血红蛋白被释放出来；（3）释放出来的血红蛋白被其分泌的蛋白酶水解。

其它菌的溶菌圈可能不是透明的，与它分泌的溶血素的种类有关，这里不多做解释。

2.3 金黄色葡萄球菌导致食源性疾病的原因？金黄色葡萄球菌因为其分泌的毒素和侵袭性酶而引起食物中毒，如杀白细胞素、肠毒素、溶血毒素、血浆凝固酶和脱氧核糖核酸酶都是其分泌的毒素和侵袭性酶。

2.4 金黄色葡萄球菌的定量？（1）污染严重的可以直接采用稀释平板计数法；（2）不严重可以采用MPN法。

金黄色葡萄球菌国家标准检验方法一、国家标准检验办法参见GB 4789.10-2010《食品平安国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》其次法和第三法。

1、Baird-Parker平板计数（其次法）本办法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。

1.1、检验流程 1.2、试验步骤 (1）样品的稀释①固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL 缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000-10000r/min均质1-2min，或置盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1：10的样品匀液。

②液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。

③用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL 稀释液的无菌试管中（注重吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打使其混合匀称，制成1：100的样品匀液。

④按③操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。

每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。

(2）样品的接种按照对样品污染情况的估量，挑选2-3个相宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在举行10倍递增稀释时，每个稀释度分离吸取1mL样品匀液以0.3mL, 0.3mL, 0.4mL接种量分离加入三块Baird-Parker平板，然后用无菌L棒涂布囫囵平板，注重不要触及平板边缘。

用法前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25-50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消逝。

(3）培养在通常状况下，涂布后，将平板静置l0min，如样液不易汲取，可将平板放在培养箱（(36±1)℃培养1h；等样品匀液汲取后翻转平皿，倒置于培养箱，(36±1)℃培养，45一48h。

金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。

采用快速测试片检测具有显著的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。

技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。

技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。

此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。

但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。

使目视效果下降，导致计数偏低。

2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。

抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。

金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。

在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。

目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。

免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。

按照现行的国标方法，金黄色葡萄球菌检测方法分为第一法定性检验、第二法平板计数法（适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品），以及第三法M P N 计数法（适用于金黄色葡萄球菌含量较低的食品）。

第一法定性检验过程包括样品处理、样品增菌、平板分离划线、初步鉴定、确证鉴定这5个步骤，整个流程全部完成至少需要5天时间。

第二法平板计数法包括5个步骤——样品稀释、样品接种涂布、典型菌和可疑菌计数、鉴定试验、结果计算，整个流程全部完成至少需要4天时间。

第三法M P N 计数法同样包括5个步骤，即样品稀释、样品增菌、平板分离划线、鉴定试验、查MPN 表确认结果，整个流程全部完成至少需要5天时间。

以下将对金黄色葡萄球菌的检测流程进行简单介绍，并对难点、注意事项进行梳理和讲解。

1 第一法：金黄色葡萄球菌定性1.1 样品处理固态和半固态样品：称取25g样品至盛有225mL 7.5%氯化钠肉汤中，充分混匀。

液体样品：吸取25m L 样品至盛有225m L 7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，振荡混匀。

1.2 样品增菌将上述样品匀液置于金黄色葡萄球菌检验技术介绍及分析□ 李留洋 锐德检测技术（天津）有限公司重的感染。

该菌对营养的要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧。

容易受金黄色葡萄球菌污染的食品主要为乳制品、蛋及蛋制品、各类熟肉制品，其次是含有乳类的冷冻食品等，因此对于该菌的检验也被确定为食品致病性菌种检验中的重要项目。

图1 样品处理36±1℃的恒温培养箱中培养18~24h 。

1.3 平板分离划线该步骤是整个金黄色葡萄球菌检测环节中最重要的步骤之一，因为平板划线分离的效果决定了可疑菌落的判定和选择。

平板划线选择三分法或四分法则分离效果较好，更容易出现单菌落平板。

1.4 初步鉴定分离的培养基选用B a i r d -Pa r k e r 平板（B P 平板）和血平板。

结果显示，金黄色葡萄球菌在B a i r d -Pa r k e r 平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润，菌落直径为2~3m m ，颜色呈灰黑色至黑色、有光泽，常有浅色（非白色）边缘，周围绕以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰带，当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感；有时可见到不分解脂肪的菌株——除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同；从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落，其颜色常较典型菌落略浅，且外观可能较为粗糙，质地较干燥。

式（2）
案例
T A1B1/ C1 A2B2 / C2其中Leabharlann 1.1d样品稀释液
10-1
10-2
典型菌落数
183
21
T：样品中金黄色葡萄球菌菌落数；
用于做血浆凝固
A1：第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数；
5
5
酶菌落数
A2：第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数；
B1：第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数； 血浆凝固酶阳性
二、金黄色葡萄球菌定性检测
注意事项
Baird-Parker平板： 胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏:提供碳源、氮源、硫、维生素和痕量矿物元素 丙酮酸钠:生长促进剂 亚碲酸盐:对除金黄色葡萄球菌外的其他能分解卵黄菌株有毒性，并使菌落产生黑色 卵黄:提供营养和有利于观察卵磷脂环 甘氨酸和氯化锂:对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。
36±1℃， 24~48h
圆形，光滑突起，湿润，直径23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘 常为淡色（米黄色或灰白色略带 灰色或黄色的白色），周围为一 混浊带，在其外缘常有一透明圈。 用接种针接触菌落似有黄油树胶 的粘稠感。
革兰氏染色
血浆凝固酶鉴别
金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球 菌，排列呈葡萄球状，无芽孢
血平板上其典型菌落呈金黄色，有时也为白色，大 而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈。
36℃±1 ℃
45h~48h
计数及血浆凝固酶试验
GB 4789.10-2016 金黄色葡萄球菌的检验第二法
报告
操作规程
样品稀释 同菌落总数检验
选择合适稀释度 接种涂布BP平板
三、金黄色葡萄球菌定量检测
样品处理
移1ml