《同工酶实验》PPT课件
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4第四章同工酶
缺陷:
电泳法分离的不一定是同工酶，酶带的数目也不一定代 表同工酶的数目。 原因有二:
某些同工酶可与电泳介质中的带电物质结合，改变其分子 大小及电荷，从而改变泳速。例如LDH可与血清中的IgA 或IgG结合形成相对分子量从3×103～1 000×103,等电点 从pH6.3～7.2的各条带。这些条带都不是同工酶本身，实 际上可能只是一种同工酶而已。
第一节 同工酶的结构基础
一、同工酶一级结构差异 二、构象变化造成同工酶的差异 三、同工酶亚基的杂交
第二节 同工酶与基因
一、单基因决定的同工酶 二、多基因决定的同工酶 三、修饰同工酶
一、几种常用分离和测定同工酶的方法 二、同工酶类型的鉴别
第三节 同工酶的分离、纯化及鉴定
第四节 同工酶的应用
一、同工酶与临床诊断 二、遗传与进化中的同工酶 三、同工酶与代谢调节 四、癌瘤状态下同工酶改变的生物学意义
i=
(3+2-1)! 2!(3-1)!
= 6(种)
三、修饰同工酶
是指多肽链合成后，发生结构上改变形成的同工酶。 日本学者证明，一种水稻的酯酶同工酶的谱带A1是受一 个显性基因控制的。对有A1谱带的品种与无A1谱带的品 种进行杂交，后代总数836个F2植株中，629个出线A1谱 带，207个无A1谱带。符合典型的孟德尔遗传规律。
第一节 同工酶的结构基础
同工酶能催化相同的反应，是因为其活性中心的结构有类 同之处，而物理特性、催化性质以及免疫特性的区别，则 是由于分子组成和结构上有一定差异。 一、同工酶一级结构差异 同工酶一级结构上的差异大至分三种情况: 1.分子量不同，氨基酸组成相差悬殊 同工酶名称 存在部位 种类 分子量 半乳糖苷转 细胞膜上 Ⅰ 移酶同工酶 Ⅱ 54 000 76 000 组成及性质差异 氨基酸、含糖量 电泳行为、底物 特异性、动力学 参数
医学检验·检查项目：血清酸性磷酸酶同工酶_课件模板
医学检验·各论：血清酸性磷酸酶同工酶 >>>
临床意义： 巨细胞性贫血、镰论：血清酸性磷酸酶同工酶 >>>
正常值： ACP1(－)、ACP2(－)、ACP3(＋)、
ACP3b(－)、ACP4(－)、ACP5(＋)、ACP3 ＞ACP5、RBC-ACP(－)。
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相关疾病：
慢性细菌性前列腺炎、良性前列腺增生、 前列腺癌、前列腺囊肿、前列腺脓肿、原 发性血小板增多症、小儿血小板无力症、 小儿血管瘤血小板减少综合征、小儿血栓 性血小板减少性紫癜、前列腺炎。
谢谢！
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临床意义：
(1)ACP2升高：慢性粒细胞性白血病、 前列腺病。 (2)ACP3升高：淋巴细胞性白 血病、血小板增多症、血小板减少症(血 小板破坏增高所致)。 (3)ACP3b升高：急 慢性粒细胞性白血病。 (4)ACP4升高：单 核细胞性白血病。 (5)ACP5升高：巨细胞 性白血病、溶血性贫血、
医学检验·各论 血清酸性磷酸酶同工
酶 内容课件模板
医学检验·各论：血清酸性磷酸酶同工酶 >>>
简介：
酸性磷酸酶(ACP)有20种同工酶，临 床测定的同工酶大致为两大类，一为前列 腺酸性磷酸酶(PAP)，是体内活性最高的 一种酸性磷酸酶同工酶，另一类为非前列 腺酸性磷酸酶。测定前列腺酸性磷酸酶的 方法较多，有化学法、放免法、免疫沉淀 法、对流免疫电泳和电泳法等，非前列腺 酸性磷酸酶一般仍用化学法。
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相关检查：
碱性磷酸酶(ALP,AKP)、前列腺液常规、 前列腺B超检查、前列腺、精囊腺的超声 检查、血常规（三分类）、血常规（五分 类）。
医学检验·检查项目：血清肌酸激酶同工酶_课件模板
临床意义：
升高：急性心肌梗死(CK-MB＞0.03， 可达0.12～0.38)、甲状腺功能减低症、 脑血管疾病、肺部疾病、慢性醇中毒、手 术后恢复期肌肉痉挛、心脏复苏后、休克、 破伤风、骨骼肌损伤等同工酶分析只发现 有CK-MM型，无CK-MB型、也检不出CK-BB 型。药物注射(氯丙嗪、苯巴比妥
医学检验·各论：血清肌酸激酶同工酶 >>>
医学检验·各论：血清肌酸激酶同工酶 >>>
相关检查： α-羟丁酸脱氢酶、肌酸激酶、血清肌酸 激酶同工酶（CKI）、心电图、心肌酶谱、 心梗三项。
医学检验·各论：血清肌酸激酶同工酶 >>>征、肌肉挛缩、肌肉挫伤。
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医学检验·各论 血清肌酸激酶同工酶
内容课件模板
医学检验·各论：血清肌酸激酶同工酶 >>>
简介：
肌酸激酶由三种同工酶的不同组合构 成，即CK-MM、CK-MB、CK-BB。血液中CKMB明显升高提示心肌梗死，它比肌酸激酶 总活性测定更能判断心肌损伤，并具有更 高的特异性和敏感性。
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临床意义： 青霉素、利血平、苯妥英钠、肾上腺素、 多粘菌素B)肌肉损伤可检出CK-MM型。
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正常值：
(1)电泳法： CK-MB＜0.05 (CK-MB＜ 5%) CK-MM＞0.94～0.96 (CK-MM＞94%～ 96%) CK-BB无或痕量 (CK-BB无或痕量) (2)酶速率法(37℃) CK-MB：0～18U/L CK-MM：0～18U/L CK-BB：0U/L。
升高：急性心肌梗死(CK-MB＞0.03， 可达0.12～0.38)、甲状腺功能减低症、 脑血管疾病、肺部疾病、慢性醇中毒、手 术后恢复期肌肉痉挛、心脏复苏后、休克、 破伤风、骨骼肌损伤等同工酶分析只发现 有CK-MM型，无CK-MB型、也检不出CK-BB 型。药物注射(氯丙嗪、苯巴比妥
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相关检查： α-羟丁酸脱氢酶、肌酸激酶、血清肌酸 激酶同工酶（CKI）、心电图、心肌酶谱、 心梗三项。
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医学检验·各论 血清肌酸激酶同工酶
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简介：
肌酸激酶由三种同工酶的不同组合构 成，即CK-MM、CK-MB、CK-BB。血液中CKMB明显升高提示心肌梗死，它比肌酸激酶 总活性测定更能判断心肌损伤，并具有更 高的特异性和敏感性。
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临床意义： 青霉素、利血平、苯妥英钠、肾上腺素、 多粘菌素B)肌肉损伤可检出CK-MM型。
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正常值：
(1)电泳法： CK-MB＜0.05 (CK-MB＜ 5%) CK-MM＞0.94～0.96 (CK-MM＞94%～ 96%) CK-BB无或痕量 (CK-BB无或痕量) (2)酶速率法(37℃) CK-MB：0～18U/L CK-MM：0～18U/L CK-BB：0U/L。
实验十-同工酶分析
实验四同工酶分析同工酶概述酶是以蛋白质为主要成分的生物催化剂。
在生物体内，有一些酶催化相同的反应，但其结构不同。
它们对底物的浓度、pH、温度等的最适要求不同，酶活力的调控反应及其所在的细胞分布也不一样。
把催化相同反应而结构和理化性质不同的酶的分子类型称为同工酶（isozyme）。
同工酶概念的提出，揭示了不同生物、同一生物不同器官和不同组织起源的酶可作用于同一底物，催化相同的反应，但在其他性质方面可以不尽相同。
大量研究表明，同工酶在生物界是广泛存在的。
在动植物和微生物体中、同一物种的不同个体、同一个体的不同器官、组织和细胞、同一细胞的不同部位、生长发育的不同阶段、不同的代谢条件下，都有不同的同工酶分布。
现在已发现的酶中，有一半以上的酶已经发现有同工酶存在。
可以进行同工酶分析的酶已有100多种。
不同同工酶可以根据电泳迁移率予以区别和编号，以向阳极方向泳动最快的编为同工酶1。
从分子结构上看，同工酶的形成有以下学说或原因：（一）亚单位结构学说亚单位结构学说是研究同工酶理论并对作用机理阐述的较为透彻的学说之一。
该学说认为同工酶是由不同亚基按不同方式结合而成的。
这个学说有广泛的实验证据。
如已经证明乳酸脱氢酶（LDH）是由A、B两个亚基，按不同比例结合成的四聚体，所以有5种同工酶：LDH1（A4）、LDH2（A3B1）、LDH3（A2B2）、LDH4（A1B3）、LDH5（B4）。
（二）不同基因编码由不同的基因或等位基因编码会形成一级结构完全不同或有个别氨基酸残基不同的多肽链。
因而产生同工酶。
由不同基因引起的同工酶存在于同一物种的所有个体中，而由等位基因引起的同工酶以一定比率存在于同一族中。
（三）单一亚单位聚合程度不同有些同工酶的亚单位是完全相同的，如胆碱脂酶（ChE），但不同的酶分子中，亚基数目不同，这就形成分子量不同的5种同工酶。
经研究发现，目前发现的100多种同工酶，其组成比例不同，但以单体（26%）、二聚体（52%）、四聚体（20%）较多，三聚体极少。
同工酶
连续监测法（动力学法或速率法） 2、连续监测法（动力学法或速率法） 连续测定（每15s-20min监测一次）酶反应过程 连续测定（ 15s 20min监测一次） 监测一次 中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求 出酶反应初速度的方法。 出酶反应初速度的方法。 特点：结果准确； 特点：结果准确； 无需终止反应； 无需终止反应； 仪器必须有保温装置； 仪器必须有保温装置； 产物或底物应是可直接测定的化合物。 产物或底物应是可直接测定的化合物。
诊断酶学的作用： 诊断酶学的作用：
各种疾病的诊断、 各种疾病的诊断、预后和随访观察
血清酶的选择原则： 血清酶的选择原则：
可靠、 可靠、可行的测定方法 特异性、 灵敏度高——明确诊断和早期诊 特异性 、 灵敏度高 明确诊断和早期诊 断
临床常用血清酶、 第八节 临床常用血清酶、同工酶及 亚型
Ⅰ.肝细胞损伤的酶类 肝细胞损伤的酶类
电 泳 法
（—）
（ +）
例如，LDH同工酶 例如，LDH同工酶
都比LDH LDH2、LDH3、LDH4、LDH5都比LDH1有较多的碱 性氨基酸， pH8.6的巴比妥缓冲液中 的巴比妥缓冲液中LDH 性氨基酸，在pH8.6的巴比妥缓冲液中LDH1带 有更多的负电荷，因而向阳性泳动最快。 有更多的负电荷，因而向阳性泳动最快。
谷氨酸脱氢酶（GLDH） 2. 谷氨酸脱氢酶（GLDH） 分布： 分布：肝细胞含量最丰富 临床意义：肝小叶中央区坏死指标（ 临床意义：肝小叶中央区坏死指标（四氯 化碳中毒，转氨酶/ 化碳中毒，转氨酶/GLDH ） 酒精性肝损伤诊断
Induced-fit hypothesis was proposed in 1959 by Daniel Koshland.
2021届高中生物竞赛实验辅导课件07酶学分析技术(C同工酶测定等)
（一）标本 （二）测定条件
底物浓度、酶浓度、温度、酸碱度、辅助因子、激 活剂和抑制剂
（三）按照最适pH不同进行鉴定
同工酶分子氨基酸组成不同，最适pH也不同。如果 同工酶最适pH之间的差别足够大，可以通过调节缓冲 溶液的pH值加以鉴定。
（四）按照免疫学特性不同进行分离鉴定 （五）按照耐热程度不同进行鉴定 （六）选择性抑制法
第四节 酶学分析在临床诊断上的应用 血浆酶的来源 酶的区域化分布 酶活性测定在临床诊断中的应用 同工酶的诊断价值
2021届
高中生物竞赛实验辅导课件
生物化学实验
（基础篇）
第三节 同工酶测定
同工酶的定义 同工酶产生的机理 同工酶的测定方法
同工酶的定义
是催化功能相同，但是分子组成及理化性质不同 的一组酶，是在同一种属中由不同基因位点或等位 基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂多体。
一、同工酶产生的机理
（一）由不同基因位点编码 （二）由等位基因编码应用
（一）在肝脏疾病诊断中的应用 （二）在急性心肌梗死诊断中的应用 （三）在急性胰腺炎诊断中的应用 （四）在骨骼疾病诊断中的应用 （五）在肌肉疾病诊断中的应用 （六）在前列腺疾病诊断中的应用 （七）在肿瘤诊断中的应用
四、同工酶的诊断价值
第五节 酶活性测定最适条件的选择
单胺氧化酶
MAO
天门冬氨酸氨基转移酶
AST
肌酸激酶
CK
乳酸脱氢酶
LDH
碱性磷酸酶
ALP
酸性磷酸酶
ACP
淀粉酶
AMS
脂肪酶
LPS
肝 肝 肝 肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心 肝、胆、肾、小肠 肝、胆道 肝、肾、脑 心、肝、骨骼肌 骨骼肌、心、脑 心、肾、骨骼肌、肝、肺 小肠、胎盘、肝、肾 前列腺、红细胞、血小板 胰、唾液腺 胰
底物浓度、酶浓度、温度、酸碱度、辅助因子、激 活剂和抑制剂
（三）按照最适pH不同进行鉴定
同工酶分子氨基酸组成不同，最适pH也不同。如果 同工酶最适pH之间的差别足够大，可以通过调节缓冲 溶液的pH值加以鉴定。
（四）按照免疫学特性不同进行分离鉴定 （五）按照耐热程度不同进行鉴定 （六）选择性抑制法
第四节 酶学分析在临床诊断上的应用 血浆酶的来源 酶的区域化分布 酶活性测定在临床诊断中的应用 同工酶的诊断价值
2021届
高中生物竞赛实验辅导课件
生物化学实验
（基础篇）
第三节 同工酶测定
同工酶的定义 同工酶产生的机理 同工酶的测定方法
同工酶的定义
是催化功能相同，但是分子组成及理化性质不同 的一组酶，是在同一种属中由不同基因位点或等位 基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂多体。
一、同工酶产生的机理
（一）由不同基因位点编码 （二）由等位基因编码应用
（一）在肝脏疾病诊断中的应用 （二）在急性心肌梗死诊断中的应用 （三）在急性胰腺炎诊断中的应用 （四）在骨骼疾病诊断中的应用 （五）在肌肉疾病诊断中的应用 （六）在前列腺疾病诊断中的应用 （七）在肿瘤诊断中的应用
四、同工酶的诊断价值
第五节 酶活性测定最适条件的选择
单胺氧化酶
MAO
天门冬氨酸氨基转移酶
AST
肌酸激酶
CK
乳酸脱氢酶
LDH
碱性磷酸酶
ALP
酸性磷酸酶
ACP
淀粉酶
AMS
脂肪酶
LPS
肝 肝 肝 肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心 肝、胆、肾、小肠 肝、胆道 肝、肾、脑 心、肝、骨骼肌 骨骼肌、心、脑 心、肾、骨骼肌、肝、肺 小肠、胎盘、肝、肾 前列腺、红细胞、血小板 胰、唾液腺 胰
植物同工酶分析技术-幻灯片(1)
过氧化氢酶
过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、 光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不 断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为 过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化 程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧 化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育 种中的重要作用也正在受到重视。
电泳 缓冲液
加在槽中的样品
夹在两块玻璃 板之间的凝胶
电泳 缓冲液
电 泳 示 意 图
电源
分子量大 分子量小
6、染色 将完整的胶块置于染色器皿中，加 入染色液，浸泡整块凝胶，室温下染色 20—30min，呈现酶带后取出胶块，用水 漂洗以终止染色。
7、对带型清楚的胶应做摄影记录或做扫描 测定，胶晾干后做永久保存。
速度越慢，反之越快； 5、电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快； 6、离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快； 7、电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动； 8、支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。
聚丙烯酰体的一种区带电泳。这 种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉 双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和 Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。引发产生自由基 的方法有两种：（1）化学法：引发剂是过硫酸铵(AP)， 催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED）， 它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰 胺单体形成单体长链。化学聚合形成的凝胶孔径较小， 且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合法：光聚 合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔 径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。
同工酶测定
保护酶（SOD、POD、CAT、APX）同工酶分析酶液提取：称取1g样品鲜叶，在冰浴条件下加酶提取液（0.1 mol·L-1 Tris-HCl 缓冲液pH8.0（每100ml内含半胱氨酸0.073g、抗坏血酸0.105g、EDTANa20.075g、甘油10ml、1mol·L-1HCl 5.84ml）2ml，研磨至匀浆，然后在低温冷冻离心机中4℃、13000r·min-1离心20min，上清液极为酶提取液。
电泳（邹琦，2000）：采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行同工酶分析，分离胶浓度POD、CAT为7.5%，SOD、APX为10%，浓缩胶浓度为3%（配方如表1）。
电泳时采用稳流控制，SOD、POD、CAT电泳浓缩胶为15mA/板，分离胶20mA/板；APX电泳浓缩胶、分离胶均为30mA/板，电泳缓冲液中加入2mmol·L-1抗坏血酸，上样前预电10min。
电泳至溴酸蓝标志到达凝胶前沿为止。
酶谱染色：根据酶反应的专一性，采用不同的染色方法，进行同工酶酶谱分析。
SOD同工酶的染色方法：采用四氮唑蓝（NBT）法（胡能书，1985）染色。
电泳完毕后，取下胶片，用无离子水冲洗干净，然后依次浸入下述染色液中：（1）把电泳完毕后的胶片放在A液（2.45mmol·L-1 NBT溶液）中于黑暗下浸20min；（2）在B液（含有28μmol·L-1核黄素、2.8mmol·L-1四甲基乙二胺的36mmol·L-1 pH7.8 磷酸缓冲液）中于黑暗下浸15min；（3）在C液（含10mmol·L-1 EDTA的0.05mol·L-1 pH7.8 磷酸缓冲液）中浸泡并于40W日光灯下照光至出现清晰透明的SOD同工酶谱带。
染色后的胶片洗掉浮色后，可保存在7%的醋酸溶液中，供分析、照相、亦可制成干板永久保存。
表1聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板配置方法Table 1 Gel and dyeing solution compounds药剂分离胶10% 分离胶7.5% 浓缩胶3%30%Acr 9.75 ml 7.3 ml 1 ml1%Bis 7.50 ml 5.6 ml 1 ml 分离胶缓冲液 3.75 ml 3.75 ml浓缩胶缓冲液 2.5 ml 蒸馏水8.80 ml 13.15 ml 5.43 mlPOD 同工酶电泳染色：采用联苯胺溶液染色法（邹琦，2000）。
实验四 同工酶分析
14
四、实验步骤
• 凝胶制备：
聚丙烯酰胺凝胶配方
成分
含量
N液（29.2%Acr-0.8%Bis） 5mL
L液（Tris）
5mL
蒸馏水
10mL
TEMED
20μL
10% AP
100μL
作用
交联剂 缓冲液
加速剂
催化剂
4℃储存，用量可 适量调整
现用现配，用量 可适量调整
15
四、实验步骤
• 样品制备：
称 取 0.5g 植 物 幼 苗 ， 放 入 研 钵 内 ， 加 入 1mL样品提取液（pH8.0），于冰浴中研成匀 浆，全部转入1.5mL离心管中，10000r/min离 心 10min ， 吸 取 100μL 上 清 液 至 新 离 心 管 中 ， 加入等量的上样缓冲液，混匀，即为样品液。
➢ 浓缩效应：凝胶为不连续系统（凝胶层、pH、电位梯 度均不连续），从而使样品浓缩在一个极窄的起始区带 ，即所谓浓缩效应，提高了条带分辩率。（只有不连续 凝胶具有此效应）
10
11
二、实验原理
➢ 过氧化物同工酶及活性染色
（1）同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身 的分子结构及其理化性质不同的一组酶。同功酶是机体调节 酶活性的一种方式，在各种生物体中广泛存在。
19
五、实验结果与分析
1 2
需要说明：
1、同工酶的数量。
3
2、同工酶的分子量大小。
4
3、同工酶的含量大小。
20
六、思考题
1、简述过氧化物同工酶丙烯酰胺电泳的原理。 2、请说明本实验过程中的注意事项。 3、简述丙烯酰胺电泳的操作要点。 4、上样缓冲液中蔗糖和溴酚蓝的作用是什么？
四、实验步骤
• 凝胶制备：
聚丙烯酰胺凝胶配方
成分
含量
N液（29.2%Acr-0.8%Bis） 5mL
L液（Tris）
5mL
蒸馏水
10mL
TEMED
20μL
10% AP
100μL
作用
交联剂 缓冲液
加速剂
催化剂
4℃储存，用量可 适量调整
现用现配，用量 可适量调整
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四、实验步骤
• 样品制备：
称 取 0.5g 植 物 幼 苗 ， 放 入 研 钵 内 ， 加 入 1mL样品提取液（pH8.0），于冰浴中研成匀 浆，全部转入1.5mL离心管中，10000r/min离 心 10min ， 吸 取 100μL 上 清 液 至 新 离 心 管 中 ， 加入等量的上样缓冲液，混匀，即为样品液。
➢ 浓缩效应：凝胶为不连续系统（凝胶层、pH、电位梯 度均不连续），从而使样品浓缩在一个极窄的起始区带 ，即所谓浓缩效应，提高了条带分辩率。（只有不连续 凝胶具有此效应）
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二、实验原理
➢ 过氧化物同工酶及活性染色
（1）同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身 的分子结构及其理化性质不同的一组酶。同功酶是机体调节 酶活性的一种方式，在各种生物体中广泛存在。
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五、实验结果与分析
1 2
需要说明：
1、同工酶的数量。
3
2、同工酶的分子量大小。
4
3、同工酶的含量大小。
20
六、思考题
1、简述过氧化物同工酶丙烯酰胺电泳的原理。 2、请说明本实验过程中的注意事项。 3、简述丙烯酰胺电泳的操作要点。 4、上样缓冲液中蔗糖和溴酚蓝的作用是什么？
血清LDH同工酶测定课件
LDH同工酶的种类与分布
LDH同工酶有五种，分别为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4和LDH5，它们在人体 内的分布具有差异性。
LDH1主要分布在心肌、红细胞和肾脏，LDH2主要分布在血小板和白细胞， LDH3主要分布在肺、脾和淋巴结，LDH4和LDH5则广泛分布于人体各个组织。
LDH同工酶的生物学功能
质量控制记录
记录实验过程中的质量控制情况， 以便进行追溯和改进。
06 血清LDH同工酶 测定的发展趋势 与展望
新技术与新方法的应用
自动化技术
利用自动化仪器和设备，实现血清LDH同工酶测 定的快速、准确和高效。
免疫学方法
利用抗体技术，提高血清LDH同工酶测定的特异 性和灵敏度。
分子生物学技术
利用基因测序和蛋白质组学技术，深入了解血清 LDH同工酶的分子结构和功能。
THANKS
感谢观看
01
LDH同工酶参与糖酵解和糖异生 过程，其中LDH1和LDH2催化乳 酸与丙酮酸之间的氧化还原反应，
02 而LDH3、LDH4和LDH5则参与
其他代谢过程。
LDH同工酶还参与细胞凋亡和坏 死等细胞死亡过程，以及免疫应 答和肿瘤发生等生物学过程。
LDH同工酶的代谢特点
LDH同工酶的代谢特点与它们的分布和生物学功能密切相关。 例如，LDH1和LDH2主要参与糖酵解和糖异生过程，其代谢 特点是快速周转和高效能量转换；而LDH3、LDH4和LDH5 则具有较慢的周转速度和较低的能量转换效率。
临床意义与价值
临床意义
血清LDH同工酶测定对于鉴别诊断心 肌梗死与其他原因引起的胸痛、评估 肝病的严重程度、监测恶性肿瘤的病 情发展等方面具有重要价值。
价值
血清LDH同工酶测定不仅有助于疾病 的早期发现和诊断，还能为临床医生 制定治疗方案提供依据，提高疾病的 治疗效果和患者的生存率。
基础生物化学实验课件PPT-植物叶片过氧化物同工酶的PAGE分析
化学名称 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 过硫酸铵 四甲基乙二胺 三羟甲基氨基甲烷 十二烷基硫酸钠
作用 单体 交联剂 催化剂 加速剂 缓冲配对离子 变性剂
2. 原理
2.1 生物大分子性质 生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在
溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分 子的相互作用。在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移， 迁移方向取决与它们带电的符号。 纸电泳、琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳
7.5%分离胶和2.5%浓缩胶的配方
试剂用量（ml) 分离胶缓冲液(PH8.8)
30%分离胶贮液 浓缩胶缓冲液(PH6.7)
10%浓缩胶贮液 ddH2O
0.14% 过硫酸胺（AP）
TEMED
7.5%分离胶 1.5 3.0
1.5 6.0 0.004
2.5%浓缩胶
0.5 1.0 0.5 2.0 0.002
(1)凝胶性能与总浓度及交联度的关系：
T%（Acr和Bis总浓度）= (a+b)/m× 100 C% (交联剂百分比) = b/(a+b) × 100 其中，a= Acr克数，b= Bis克数，m=缓冲液体积（ml） 欲制备完全透明而又有弹性的凝胶， 应控制a/b=30左右。 经验公式: C = 6.5 － 0.3 T
聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacryamide
gel electrophoresis PAGE)
分离植物过氧化物酶同工酶
1. 目的要求
(1)了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。 (2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。 (3)了解同工酶研究在理论和实践中的重要意义。
PAGE实验中用到的试剂：
简称 Acr Bis AP TEMED Tris SDS
医学检验·检查项目：血清肌酸激酶同工酶(CKI)_课件模板
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临床意义： 不出CK-BB型 药物注射(氯丙嗪、苯巴比 妥、青霉素、利血平 苯妥英钠、肾上腺 素、多粘菌素B)肌肉损伤可检出CK-MM型。
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正常值：
(1)电泳法：占肌酸激酶： CKMB<0.05 (CK-MB<5%)；CK-MM>0.94～0.96 (CK-MM>94%～96%)；CK-BB无或痕量 (CKBB无或痕量)。 (2)酶速率法(37℃)： CK-MB：0～18U/L；CK-MM：0～18U/L； CK-BB
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相关疾病： 性闭合伤、缺血性心肌病、癫痫、癫痫伴 发的精神障碍。
谢谢！
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临床意义：
升高：急性心肌梗死(CK-MB>0.03， 可达0.12～0.38) ，亦可见于肌营养不良， 恶性肿瘤。 甲状腺功能减低症、脑血管 疾病、肺部疾病、慢性醇中毒、手术后恢 复期肌肉痉挛、心脏复苏后 、休克、破 伤风、骨骼肌损伤等同工酶分析只发现有 CK-MM型，无DK-MB型、也检健康搜索
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正常值： ：0U/L。 (注：具体参考值请根据各实验 室而定。)。
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相关检查： α-羟丁酸脱氢酶、肌酸激酶、血清肌酸 激酶同工酶、血清肌酸激酶。
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垂直板聚丙烯酰胺 凝胶电泳分离乳酸 脱氢酶同工酶
（活性染色鉴定法）
实验目的：
• 理解同工酶的概念及遗传学意义 • 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 • 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术 • 掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色
同工酶
是指能够催化相同的化学反应，但酶分子结构、理化特性乃至免疫 学性质不同的一组酶。它们是由遗传体系决定的在不同组织中表达 的蛋白质作用相同,但分子结构、理化特性等不同。
实验流程
一、动物组织的样品的获取 二、试剂的配制、仪器的准备 三、分离胶（30分钟） 四、浓缩胶（20分钟） 五、电泳（2-3小时） 六、染色（30分钟） 七、观察结果
一、试剂：
1.凝胶储备液： A储备液： pH8.9 Tris~HCl缓冲液：1 M HCl 48ml，36.6g Tris，加 双蒸水到
本实验做的是乳酸脱氢酶（LDH）的分离鉴定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理
天然状态生物大分子进行的电泳，利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、 形状的差异，而在电场中泳动的速度和方向不同，达到分离的目的。
多数蛋白质的pH在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中进行 电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁移，称为阳极电泳；
• 取上清液至新管，吸取其中150ul样品，加100ul 甘油和10ul 溴酚蓝，混匀之后即可点样。
三、分离胶的制备
储备液
配方表 A储备液 C储备液 双蒸水 E储备液
TEMED 总体积
用量（ml）2.5
5.0
12.5 100ul
10ul
20
• TEMED最后一个加入，轻轻混匀，操作迅速。胶高度距样品凹玻璃板 下缘约1cm，用移液枪在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空 气，并使胶面平整。
1
1.电泳槽
2.梳子 3
3.制胶器
4.夹胶框 2
封胶条
4
二、样品的制备
• 取材：鲫鱼若干条，解剖取眼、鳃、肺、肝、肠、肉、卵 、 心脏，放入冰箱保存。
• 提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液Tris-Hcl(pH=7.0) 此溶液需4℃预冷，组织重量（g）与缓冲液体积（mL）之 比为１：5。用研钵研磨充分。浆液4℃离心约30分钟， 15000转／分钟。
• 水与凝固的胶面有折射率不同的界限，用滤纸吸去多余的水。
四、浓缩胶的制备
储备液
用量 （ml）
B储备 液
1.25
配方表
D储备 液
2.5
双蒸水 F储备 液
1.2
5
E储备 液
60ul
TEME D
16ul
总体积 10
• TEMED最后一个加入，轻轻混匀，操作迅速。浓缩胶液高度到凹玻璃 板下缘0.5cm左右，然后插入样品梳，注意不要产生气泡。约30分钟后， 凝胶完全。
80ml，调节pH到8.9定容到100ml。 B储备液 ： pH6.7 Tris~HCl缓冲液：1 M HCl 48ml，5.98g Tris，加双蒸水到
80ml，调节pH到6.7定容到100ml。 C储备液： 分离胶储备液（30% Acr/Bis）：30g Acr，0.8g Bis，用双蒸水定容
到100ml，备用，4℃存放可以保存1个月。 D储备液： 浓缩胶储备液：16g Acr，4g Bis，用双蒸水定容到 100ml，备用，
3.乳酸脱氢酶染色剂的配制 1M －乳酸钠 0.5ml NAD 25mg PMS 2mg NBT 15mg 0. 2M Tris－Hcl溶液（PH8.0）2ml 去离子水定容至50ml
器材：
夹心式垂直板电泳槽，梳子，直流稳压电源（电压300-600V， 电流50-100mA），移液枪（各种量程），烧杯（100mL）， 培养皿
• 为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和甘油溶液？ 分别有何用途？
•谢谢
附：分离胶、浓缩胶配方
储备液 A储备 液
用量
2.5
（ml）
C储备 双蒸水 E储备液 TEME 总
液
(APS)
D
体积5.ຫໍສະໝຸດ 12.5 100ul 10ul 20
储备液
用量 （ml）
B储备液 1.25
D储备液 2.5
双蒸水 1.2
F储备液 5
4℃可以保存1个月。 E储备液： 10% Aps（W/V）：1g定容到10ml，-20℃保存。 F储备液： 40%蔗糖：40g蔗糖溶解到60ml双蒸水中。 TEMED
2.电泳缓冲液： Tris6.0g，28.8gGly 加双蒸水到900ml调节pH到8.3，定容到1000ml，使用 时 稀释10倍。
E储备液 TEME 总
(APS)
D体 积
60ul 16ul 1 0
感谢下 载
带孔胶
小分子
按分子 大小分离
聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型
连续系统
相同孔径的凝胶、缓冲系统，是利用蛋白质分子的主要靠 电荷和分子筛效应进行分离。
不连续系统
不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过 程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶 的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，浓缩效应，然 后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效 应，也有分子筛效应。
• 观察拍照
m：肌肉（muscle）；l：肝脏（liver）；k：肾脏 （kidney）；s：脾脏（spleen）；h：心 （heart）； e：眼睛（eye）；f：鳍（fin）；g： 鳃（gill）；b：脑（brain）
思考题：
• 根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺 凝胶垂直板电泳？哪些是关键步骤？
• 小心拔出样品梳（两端同时向外拔）。
点样
加样
样品迁 移方向
五、电 泳
• 电压和电流：电压180V， 电流流18－30mA； • 溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束。
六、染色与观察
• 揭去上面长型玻璃板，凝胶从短型玻璃板上剥离，慢慢地把 胶板冲入白瓷盘或大培养皿内，避光于37度摇床中染30min。
对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而 向阴极迁移，称为阴极电泳。
电泳 缓冲液
加在槽中的样品
夹在两块玻璃 板之间的凝胶
电泳 缓冲液
电源
分子量大 分子量小
电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。
电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。
电泳方向
混合样品 电泳
大分子
（活性染色鉴定法）
实验目的：
• 理解同工酶的概念及遗传学意义 • 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 • 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术 • 掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色
同工酶
是指能够催化相同的化学反应，但酶分子结构、理化特性乃至免疫 学性质不同的一组酶。它们是由遗传体系决定的在不同组织中表达 的蛋白质作用相同,但分子结构、理化特性等不同。
实验流程
一、动物组织的样品的获取 二、试剂的配制、仪器的准备 三、分离胶（30分钟） 四、浓缩胶（20分钟） 五、电泳（2-3小时） 六、染色（30分钟） 七、观察结果
一、试剂：
1.凝胶储备液： A储备液： pH8.9 Tris~HCl缓冲液：1 M HCl 48ml，36.6g Tris，加 双蒸水到
本实验做的是乳酸脱氢酶（LDH）的分离鉴定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理
天然状态生物大分子进行的电泳，利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、 形状的差异，而在电场中泳动的速度和方向不同，达到分离的目的。
多数蛋白质的pH在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中进行 电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁移，称为阳极电泳；
• 取上清液至新管，吸取其中150ul样品，加100ul 甘油和10ul 溴酚蓝，混匀之后即可点样。
三、分离胶的制备
储备液
配方表 A储备液 C储备液 双蒸水 E储备液
TEMED 总体积
用量（ml）2.5
5.0
12.5 100ul
10ul
20
• TEMED最后一个加入，轻轻混匀，操作迅速。胶高度距样品凹玻璃板 下缘约1cm，用移液枪在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空 气，并使胶面平整。
1
1.电泳槽
2.梳子 3
3.制胶器
4.夹胶框 2
封胶条
4
二、样品的制备
• 取材：鲫鱼若干条，解剖取眼、鳃、肺、肝、肠、肉、卵 、 心脏，放入冰箱保存。
• 提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液Tris-Hcl(pH=7.0) 此溶液需4℃预冷，组织重量（g）与缓冲液体积（mL）之 比为１：5。用研钵研磨充分。浆液4℃离心约30分钟， 15000转／分钟。
• 水与凝固的胶面有折射率不同的界限，用滤纸吸去多余的水。
四、浓缩胶的制备
储备液
用量 （ml）
B储备 液
1.25
配方表
D储备 液
2.5
双蒸水 F储备 液
1.2
5
E储备 液
60ul
TEME D
16ul
总体积 10
• TEMED最后一个加入，轻轻混匀，操作迅速。浓缩胶液高度到凹玻璃 板下缘0.5cm左右，然后插入样品梳，注意不要产生气泡。约30分钟后， 凝胶完全。
80ml，调节pH到8.9定容到100ml。 B储备液 ： pH6.7 Tris~HCl缓冲液：1 M HCl 48ml，5.98g Tris，加双蒸水到
80ml，调节pH到6.7定容到100ml。 C储备液： 分离胶储备液（30% Acr/Bis）：30g Acr，0.8g Bis，用双蒸水定容
到100ml，备用，4℃存放可以保存1个月。 D储备液： 浓缩胶储备液：16g Acr，4g Bis，用双蒸水定容到 100ml，备用，
3.乳酸脱氢酶染色剂的配制 1M －乳酸钠 0.5ml NAD 25mg PMS 2mg NBT 15mg 0. 2M Tris－Hcl溶液（PH8.0）2ml 去离子水定容至50ml
器材：
夹心式垂直板电泳槽，梳子，直流稳压电源（电压300-600V， 电流50-100mA），移液枪（各种量程），烧杯（100mL）， 培养皿
• 为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和甘油溶液？ 分别有何用途？
•谢谢
附：分离胶、浓缩胶配方
储备液 A储备 液
用量
2.5
（ml）
C储备 双蒸水 E储备液 TEME 总
液
(APS)
D
体积5.ຫໍສະໝຸດ 12.5 100ul 10ul 20
储备液
用量 （ml）
B储备液 1.25
D储备液 2.5
双蒸水 1.2
F储备液 5
4℃可以保存1个月。 E储备液： 10% Aps（W/V）：1g定容到10ml，-20℃保存。 F储备液： 40%蔗糖：40g蔗糖溶解到60ml双蒸水中。 TEMED
2.电泳缓冲液： Tris6.0g，28.8gGly 加双蒸水到900ml调节pH到8.3，定容到1000ml，使用 时 稀释10倍。
E储备液 TEME 总
(APS)
D体 积
60ul 16ul 1 0
感谢下 载
带孔胶
小分子
按分子 大小分离
聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型
连续系统
相同孔径的凝胶、缓冲系统，是利用蛋白质分子的主要靠 电荷和分子筛效应进行分离。
不连续系统
不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过 程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶 的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，浓缩效应，然 后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效 应，也有分子筛效应。
• 观察拍照
m：肌肉（muscle）；l：肝脏（liver）；k：肾脏 （kidney）；s：脾脏（spleen）；h：心 （heart）； e：眼睛（eye）；f：鳍（fin）；g： 鳃（gill）；b：脑（brain）
思考题：
• 根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺 凝胶垂直板电泳？哪些是关键步骤？
• 小心拔出样品梳（两端同时向外拔）。
点样
加样
样品迁 移方向
五、电 泳
• 电压和电流：电压180V， 电流流18－30mA； • 溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束。
六、染色与观察
• 揭去上面长型玻璃板，凝胶从短型玻璃板上剥离，慢慢地把 胶板冲入白瓷盘或大培养皿内，避光于37度摇床中染30min。
对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而 向阴极迁移，称为阴极电泳。
电泳 缓冲液
加在槽中的样品
夹在两块玻璃 板之间的凝胶
电泳 缓冲液
电源
分子量大 分子量小
电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。
电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。
电泳方向
混合样品 电泳
大分子