第6章分子生物学研究法(下)

分子生物学研究引言分子生物学是现代生物学的一个重要分支，主要关注生物体内的分子机制。

通过研究核酸、蛋白质等大分子的结构和功能，科学家们能够揭示生命的奥秘。

本文将简要介绍分子生物学的研究内容、方法以及一些重要的研究成果。

研究内容1. 核酸研究核酸包括DNA和RNA，是遗传信息的载体。

分子生物学的重要任务之一就是研究核酸的结构与功能。

例如，DNA双螺旋结构的发现为理解遗传信息的存储和传递奠定了基础。

此外，RNA在基因表达调控中的作用也是研究的重点之一。

2. 蛋白质研究蛋白质是生命活动的主要执行者。

分子生物学研究蛋白质的合成、折叠、功能及其与其他分子的相互作用。

通过了解蛋白质的功能，可以更好地理解细胞的生理过程。

3. 酶学研究酶是一类具有催化作用的蛋白质，能加速生物化学反应。

分子生物学研究酶的结构、催化机制及应用，如在医药和工业上的应用。

4. 信号传导研究细胞通过复杂的信号传导网络进行通信。

分子生物学研究这些信号通路的组成、调控及功能，以揭示细胞间的信息交流机制。

研究方法1. 分子克隆技术分子克隆技术是分子生物学的基本工具，用于获取、扩增和改造特定基因。

常用的方法包括PCR（聚合酶链式反应）和质粒构建。

2. 基因编辑技术CRISPR-Cas9等基因编辑技术的发展，使科学家能够精确地修改基因序列，从而研究基因的功能和治疗遗传疾病。

3. 高通量测序技术高通量测序技术（如NGS）能够快速测定大量DNA或RNA序列，极大地推动了基因组学和转录组学的发展。

4. 结构生物学方法X射线晶体学、核磁共振（NMR）和冷冻电镜（Cryo-EM）等技术用于解析蛋白质和其他生物大分子的三维结构，为理解其功能提供重要信息。

重要研究成果1. DNA双螺旋结构的发现沃森和克里克于1953年提出DNA双螺旋结构模型，这一发现奠定了现代分子生物学的基础。

2. RNA世界假说RNA世界假说认为早期生命形式主要以RNA为基础，RNA既是遗传物质又具有催化功能，为理解生命起源提供了新的视角。

分子生物学研究法-基因功能研究技术第六章分子生物学研究法（下）基因功能研究技术随着越来越多的基因组序列相继被测定，人类对生物本质的认识已经发生了重大变化。

但是，海量序列信息也向我们提出了新的挑战。

如何开发利用这些序列信息，如何通过生物化学、分子生物学等方法研究基因的功能，从而进一步了解生物体内各种生理过程，了解生物体生长发育的调节机制，了解疾病的发生、发展规律，给出控制、减缓甚至完全消除人类遗传疾病，是新时期生物学家所面临的主要问题。

转录组测序技术、原位杂交技术、基因芯片技术为研究单个或多个基因在生物体某些特定发育阶段或在不同环境条件下的表达模式提供了强有力的手段。

用基因定点突变（site-directed mutagenesis）技术、基因敲除技术、RNAi技术可以全部或部分抑制基因的表达，通过观察靶基因缺失后生物体的表型变化研究基因功能。

酵母单杂交、双杂交技术，四分体技术等都是研究蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用等的重要手段。

随着分子生物学技术的发展，研究者可以在活细胞内和细胞外研究蛋白质之间的相互作用，为认识信号转导通路、蛋白质翻译后修饰加工等提供了丰富的技术支持。

本章将主要介绍研究基因功能的各种分子生物学技术和方法。

6. 1 基因表达研究技术6. 1. 1转录组测序6.1.1 转录组分析和RNA-Seq转录组（transcriptome），广义上指在某一特定生理条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所有RNA的总和，包括信使RNA（mRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）及非编码RNA（non-coding RNA或sRNA）；狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。

基因组－转录组－蛋白质组（genome－transcriptome －proteome）是中心法则在组学框架下的主要表现形式。

通过特定生理条件下细胞内的mRNA丰度来描述基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度是目前基因表达研究的基本思路。

分子生物学课程教学大纲课程名称：分子生物学（Molecular Biology）课程编号：1313072215课程类别：专业课总学时数：68 课内实验时数：18学分：3.5开课单位：生命科学学院生物技术教研室适用专业：生物技术适用对象：本科（四年）一、课程的性质、类型、目的和任务分子生物学为高等学校生物技术专业学生必修的一门专业基础课，是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，主要研究核酸、蛋白质等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。

通过分子生物学的教学，应使学生了解分子生物学的发展历史以及最新研究成果；熟练掌握DNA的结构与功能、RNA在蛋白质合成中的功能、蛋白质的结构与功能、遗传密码及基因表达调控的本质；了解现代分子生物学基本研究方法，并能运用分子生物学的理论知识分析、研究和解决问题，为进一步学习有关专业课程及从事基因工程领域的研究工作奠定基础。

二、本课程与其它课程的联系与分工从学科角度来讲，分子生物学涵盖面非常广，与生物学、生物化学和细胞生物学、遗传学等生命科学课程有交叉，《生物化学》是先修课程。

三、教学内容及教学基本要求[1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”；△表示自学内容；○表示略讲内容；第一章绪论第一节引言创世说与进化论[1]；细胞学说[2]；经典的生物化学和遗传学[3]；DNA的发现[2]第二节分子生物学简史[1]第三节分子生物学研究的主要内容分子生物学的含义[3]；DNA重组技术、基因工程技术概念[3]；分子生物学研究的主要内容[3]第四节展望分子生物学的一些分支学科[1]；分子生物学发展的趋势[1]重点：分子生物学的含义和研究内容难点：分子生物学的研究内容教学手段：多媒体教学教学方法：讲授法作业：1．简述阵德尔、摩尔根和沃森等人对分子生物学发展的主要贡献。

一．名词解释IP（免疫沉淀、免疫印迹）：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

这个实验是用特异性抗体结合细胞裂解液中的目的蛋白，洗涤后解离特异性抗体和目的蛋白质，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），最后用Western blot分析目的蛋白质。

这种方法可以分析溶液中的、细胞内的、结合在细胞膜上的蛋白质或者受体，但只能是定性或者半定量的实验。

NLS（核定位序列）：核定位信号是另一种形式的信号肽, 可位于多肽序列的任何部分。

一般含有4～8个氨基酸, 且没有专一性, 作用是帮助亲核蛋白进入细胞核。

可分为单一型NLS和双分型NLS。

单一型NLS，由一段连续的碱性氨基酸序列排列而成（RKKKRKV），双分型NLS，有两段碱性氨基酸被中间10~12GE 非特异性氨基酸所分割而形成，（KRPAA TKKAGQAKKKKLDK）。

SUMO（small ubiquitin-related modifier）：是一种小的泛素相关修饰蛋白，它与泛素在序列上虽只有18%相同，但在二级结构和三级结构上有惊人的相似。

SUMO家族成员都有独特的N端氨基酸序列和C端外延序列。

SUMO 化（sumoylation）的功能与泛素化（ubiquitination）不同，它并不是蛋白降解，反而加强它们的稳定性或调解它们在细胞内的定位和分布，甚至与凋亡相关。

二．问答题1.什么是近交系小鼠，它们有什么特征？有哪些常见的近交系小鼠？答：近交系小鼠：是经连续20代（或以上）的全同胞兄妹交配（或亲代与子代交配）培育而成的小鼠，品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。

特性：①基因位点的纯合性（Homozygosity）近交系小鼠中任何一个基因位点上纯合子的概率高达99％，因而也能繁殖出完全一致的纯合子后代。

②遗传组成的同源性（Isogenicity）品系内所有动物个体都可追溯到一对共同祖先，个体在遗传上是同源的，基因型完全一致。

分子生物学考点整理符广勇朱兰第一章．绪论一、分子生物学概念分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子结构与功能相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界奥秘、由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。

二、重组DNA技术又称基因技术，是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。

三、基因表达的调控基因表达的调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑三个方面。

四、转录因子转录因子是能与基因5`端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。

第二章．染色体与DNA一、染色体上的蛋白质染色体上的蛋白质主要包括组蛋白和非组蛋白。

根据凝胶电泳性质可以把组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3、H4。

这些组蛋白都含有大量的赖氨酸和精氨酸。

二、组蛋白的特性1．进化上的极端保守性不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的，特别是H3、H4。

2.无组织特异性到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白这两个例外。

3．肽链上氨基酸分布的不对称性碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。

4.组蛋白的修饰作用包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化及ADP核糖基化。

5.富含赖氨酸的组蛋白H5三、HMG蛋白叫高迁移率蛋白四、真核细胞DNA序列的分类1.不重复序列2.中度重复序列3.高度重复序列重复序列的意义：若某一重复序列出现错误，对基因的影响不大，稳定性较高；在短时间内可同时产生大量的基因产物。

重复序列的应用:应用于分子标记的作用：卫星DNA（便于分子标记）和微卫星DNA五、真核生物基因组与原核生物基因组的区别1.真核基因组庞大，原核生物基因组小2.真核基因组存在大量的重复序列，原核基因组没有重复序列3.真核基因组大部分是非编码序列，原核基因组大多是编码序列4.真核基因组的转录产物为单顺反子，原核基因组转录产物多为多顺反子5.真核基因是断裂基因，有内含子结构，原核基因为连续基因，几乎没有内含子结构6.真核基因组存在大量的顺式作用原元件，包括启动子、增强子和沉默子等，原核基因组基本没有增强子和沉默子7.真核基因组存在大量的DNA多态性，原核基因组很少有8.真核基因组具有端粒结构，原核基因组没有端粒结构六、重叠基因（Overlapping gene）指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上的基因的组成部分。

分子生物学研究方法教案一、教学目标1、让学生了解分子生物学的基本概念和研究范畴。

2、使学生掌握常见的分子生物学研究方法，包括其原理、操作步骤和应用领域。

3、培养学生的实验设计能力和科学思维，能够运用所学方法解决实际问题。

二、教学重难点1、重点（1）PCR 技术的原理和应用。

（2）核酸电泳技术的原理和操作。

（3）基因克隆的基本流程。

2、难点（1）PCR 反应体系的优化和常见问题的解决。

（2）基因克隆中载体的选择和构建。

三、教学方法1、讲授法：讲解分子生物学研究方法的基本原理和关键步骤。

2、演示法：通过多媒体展示实验过程和结果，增强学生的直观感受。

3、讨论法：组织学生讨论实验设计和结果分析，培养学生的思维能力。

四、教学过程1、课程导入（1）通过介绍一些与分子生物学相关的疾病诊断、基因治疗等实际应用案例，引起学生的兴趣，引出分子生物学研究方法的重要性。

2、分子生物学研究方法概述（1）简单介绍分子生物学的定义和研究对象，如 DNA、RNA、蛋白质等生物大分子。

（2）列举常见的分子生物学研究方法，如 PCR、核酸电泳、基因克隆、DNA 测序等。

3、 PCR 技术（1）原理：讲解 PCR 技术的基本原理，即通过高温变性、低温退火和适温延伸的循环过程，实现 DNA 片段的指数扩增。

（2）反应体系：介绍 PCR 反应体系的组成成分，包括模板 DNA、引物、dNTPs、Taq DNA 聚合酶和缓冲液等，并说明各成分的作用。

（3）操作步骤：详细讲解 PCR 的操作步骤，包括模板 DNA 的制备、引物设计、反应体系的配制、PCR 扩增程序的设置等。

（4）应用：举例说明 PCR 技术在基因诊断、遗传分析、物种鉴定等方面的应用。

4、核酸电泳技术（1）原理：解释核酸电泳的原理，即根据核酸分子在电场中的迁移速率不同来分离和鉴定核酸片段。

（2）琼脂糖凝胶电泳：介绍琼脂糖凝胶电泳的操作方法，包括凝胶的制备、样品的加载、电泳条件的设置等。

分子生物学思考题绪论1.简述孟德尔、摩尔根和Wstson等人对分子生物学发展的主要贡献。

2.写出DNA、mRNA和siRNA的英文全名。

3.试述“有其父必有其子”的生物学本质。

4.早期主要有哪些实验证实DNA是遗传物质？写出这些实验的主要步骤。

5.定义重组DNA技术。

6.说出分子生物学的主要研究内容。

7.你认为本世纪初叶分子生物学将在哪些领域取得进展？第2章（染色体与DNA）1.染色体具备哪些作为遗传物质的特征？2.简述真核细胞内核小体的结构特点。

3.请列举3项实验证据来说明为什么染色质中DNA与蛋白质分子是相互作用的。

4.简述DNA的一、二、三级结构。

5.简述组蛋白都有哪些类型的修饰，其功能分别是什么？6.原核生物DNA具有哪些不同于真核生物DNA的特征？7.DNA双螺旋结构模型是有谁提出的？简述其发现的主要实验依据及其在分子生物学发展中的重要意义。

8.DNA以何种方式进行复制？如何保证DNA复制的准确性？9.简述原核生物DNA的复制特点。

10.什么是DNA的Tm值？它受哪些因素的影响？11.DNA复制时为什么前导链是连续复制，而后随链是以不连续的方式复制？请以大肠杆菌为例简述后随链复制的各个步骤。

12.真核生物DNA的复制在哪些水平上受到调控？13.细胞通过哪几种修复系统对DNA损伤进行修复？14.什么是转座子？可分为哪些种类？15.什么是SNP？SNP作为第三代遗传标记的优点。

第三章（生物信息的传递——从DNA到RNA）1.什么是编码链和模板链？2.简述RNA的种类及其生物学作用。

3.RNA的结构特点。

4.简述RNA转录的概念及其基本过程。

5.请比较复制与转录的异同点。

6.大肠杆菌的RNA聚合酶由哪些组成成分？各个亚基的作用？7.什么是闭合复合物、开链复合物及三元复合物？8.简述o因子的作用。

9.什么是Pribnow box？它的保守序列是什么？10.什么是上升突变？什么是下降突变？11.简述原核生物和真核生物mRNA的区别。

现代分子生物学第六章习题参考答案1、列举两种研究基因表达模式的方法并简述原理。

答：⑴基因表达系列分析技术：它是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。

任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频率。

⑵基因定点突变技术：通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。

3、简述基因芯片技术对分子生物学研究的意义。

答：基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交（Southern Blotting 和Northern Blotting 等）技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。

而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。

4、比较酵母双杂交技术和免疫共沉淀技术在研究蛋白质相互作用方面的优缺点。

答：⑴酵母双杂交技术优势：1、大规模筛选；2、操作简单，直观（可以用荧光做报告基因，也可以用氨基酸缺陷型平板筛选等）缺点：1、传统的酵母双杂交技术不能研究膜蛋白的相互作用，由此派生出的新技术研究膜蛋白的相互作用较困难；2、酵母双杂交技术研究的目的蛋白相互作用需在酵母细胞核内发生相互作用，那么新的问题产生了：如果酵母双杂交技术显示两个蛋白相互作用（也就是在酵母细胞核内，这两个蛋白确实相互作用），但是两个相互作用蛋白在原宿主内却位于不同细胞器（也就是他们不可能出现在同一个位置），那么假阳性就产生了，由此出现的例子很多。

⑵免疫共沉淀技术(Co-IP)优势：该技术能捕捉到发生在染色质水平上的基因表达调控的瞬时事件，如实、完整地反映DNA与蛋白质的动态结合；缺点：难以同时得到多个因子对同一序列结合的信息，或目标蛋白不是直接地与染色质结合等。

分⼦⽣物学考试复习题及答案第⼀章绪论⼀．简述分⼦⽣物学的主要内容。

1.DNA重组技术（⼜称基因⼯程）2.基因表达调控研究3.⽣物⼤分⼦的结构功能的研究——结构分⼦⽣物学4.基因组、功能基因组与⽣物信息学研究⼆．什么是遗传学的中⼼法则和反中⼼法则？遗传学中⼼法则：描述从⼀个基因到相应蛋⽩质的信息流的途径。

遗传信息贮存在DNA中，DNA被复制传给⼦代细胞，信息被拷贝或由DNA转录成RNA，然后RNA翻译成多肽。

反中⼼法则：由RNA逆转录到DNA，再由DNA转录到RNA，然后RNA翻译成多肽、蛋⽩质。

第⼆章染⾊体与DNA⼀、名词解释半保留复制：DNA复制时，以亲代DNA的每⼀条链作为模版，合成完全相同的两个双链⾃带DNA分⼦，每个⼦代DNA分⼦中都含有⼀条亲代DNA链的复制⽅式。

冈崎⽚段：在DNA复制过程中，前导链能连续合成，⽽滞后链只能是断续的合成5 3 的多个短⽚段，这些不连续的⼩⽚段称为冈崎⽚段。

复制⼦：从复制原点到终点，组成⼀个复制单位，叫复制⼦。

插⼊序列：最简单的转座⼦，不含有任何宿主基因，它们是细菌染⾊体或质粒DNA的正常组成部分。

DNA的变性和复性：变性：指DNA双链的氢键断裂，完全变成单链。

复性：指热变性的DNA缓慢冷却，单链恢复成双链。

双向复制：复制从⼀个固定的起始点开始，同时向两个⽅向等速进⾏。

引物酶：⼀种特殊的RNA聚合酶，在DNA模版上合成⼀段RNA链，这段RNA链是DNA复制起始时必需的引物。

转座⼦：存在与染⾊体DNA上可⾃主复制和位移的基本单位。

碱基切除修复：⾸先由糖苷⽔解酶识别特定受损核苷酸上的N-β糖苷键，在DNA上形成AP位点，由AP核酸内切酶把受损的核苷酸的糖苷-磷酸键切开，移去包括AP位点在内的⼩⽚段DNA，由聚合酶Ⅰ合成新⽚段，DNA连接酶最终把两者连接成新的DNA链。

DNA重组修复：即“复制后修复”。

机体细胞对在复制起始时尚未修复的DNA部位可先复制再修复。

在复制时，先跳过损伤部位，在和成链中留下⼀个缺⼝。

第6章基因功能研究技术SAGE基因表达系列分析技术•serial analysis of gene expression: SAGE是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。

•首先，一段来自于任一转录本特定区域的"标签"（Tag），即长度仅9-14 bp的核苷酸序列，就已包含足够的信息以特异性地确定该转录本。

例如：一个9碱基的序列能有49=262144种不同的排列组合，而人类基因组据估计仅编码80000种转录本，因此在理论上每一个9碱基标签就能够代表一种转录本的特征序列。

•如果将短片段标签相互连接、集中形成长的DNA分子，则对该克隆进行测序将得到大量连续的单个标签，并能以连续的数据形式进行处理，这样就可对数以千计的mRNA转录本进行批量分析。

•各转录本的表达水平可以用特定标签被测得的次数进行定量。

测序并用计算机辅助分析锚定酶AE 酶切后，与抗生物素蛋白包裹的微磁珠相连，分离3‘端酶切片段生物素分两份分别与接头相连标签酶TE 酶切锚定酶AE 酶切分离纯化双标签串联入载体连接并根据接头1,2 设计引物进行PCR末端补平Anchoring Enzyme: AE识别位点：CATGTag1Tag2Tag3Tag4Tagging Enzyme ：TE距识别位点约20碱基的位置切割DNAbiotin-oligo dT 5’AAAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTTT-5’3’mRNAcDNA biotin-oligo dTAAAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTTT-5’3’5’ds cDNA 锚定酶（AE ）Nla III 进行酶切收集3'端部分TTTTTTTTTTT-5’biotin-oligo dT 3’-XXXXXXXXXX GTAC AAAAAAAAAAA-3’5’-XXXXXXXX CATG biotin-oligo dT AAAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTTT-5’3’-GTAC 收集大量不同的cDNA 3‘端序列部分锚定酶通常为识别4碱基位点的III 类限制性内切酶，如Nla III 、Sau3A I 等。