动物及其制品中细菌耐药性的测定not;—纸片扩散法编制说明

1. 掌握纸片扩散法（Kirby-Bauer法）的原理、操作方法和结果判读。

2. 了解纸片扩散法在抗菌药物敏感试验中的临床意义。

二、实验原理纸片扩散法是一种常用的抗菌药物敏感试验方法，其原理为：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后，不断地向纸片周围扩散，形成递减浓度梯度。

在纸片周围抑菌浓度范围内，待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。

抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。

三、实验材料1. 标本：大肠埃希菌（18～24小时非选择性培养基上纯培养物）。

2. 试剂：营养肉汤或无菌生理盐水、直径为9cm水解酪蛋白（M-H）琼脂平板、药敏纸片（氨苄西林、头孢唑啉、庆大霉素、头孢曲松、环丙沙星、亚胺培南）等。

3. 器材：35℃培养箱、0.5麦氏比浊管或比浊仪、酒精灯、接种环、镊子、无菌棉拭子、毫米尺或游标卡尺等。

四、实验方法1. 菌液制备：用接种环或无菌棉拭子蘸取大肠埃希菌单个菌落，接种到有营养肉汤或0.9%无菌生理盐水的试管中，制成菌悬液，校正浊度为0.5麦氏浊度。

2. 接种平板：调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。

用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部。

3. 贴药敏纸片：用无菌镊子或纸片分配器将药敏纸片平贴于M-H琼脂平板表面，轻压。

直径9cm的平板可贴6张纸片，每张药敏纸片之间的距离24mm，距平板边缘15mm，纸片贴牢后不要移动。

4. 培养平板：将贴好药敏纸片的M-H琼脂平板置室温干燥3～5min，倒置放入35℃培养箱中培养16～24h。

5. 结果观察与记录：观察平板上抑菌圈的大小，并记录数据。

1. 氨苄西林：抑菌圈直径为18mm。

2. 头孢唑啉：抑菌圈直径为22mm。

3. 庆大霉素：抑菌圈直径为25mm。

纸片扩散试验的原理和过程纸片扩散试验是一种常用的微生物灭菌效果评价方法，用于评估抗菌剂或消毒剂对细菌的杀灭作用。

它通过测量试验物质对细菌的抑制或杀灭效果，可以判断抗菌剂的有效性。

1. 实验原理：纸片扩散试验基于Kirby-Bauer法，利用试验物质通过纸片扩散，与培养基中的细菌接触，观察抑菌、杀菌或促进菌落生长的效果，从而评估抗菌剂的抗菌效果。

2. 实验过程：- 准备工作：- 准备试验物质：需要测试的抗菌剂或消毒剂。

- 准备培养基：适合所要测试细菌的培养基。

- 制备纸片：用纸片切割成规定大小，通常为6mm直径的圆片。

- 培养细菌：选择所需的细菌株，通过预培养使其处于对数生长期。

- 操作步骤：- 第一步，将培养基倒入培养皿中，使其均匀平铺在培养皿底部。

- 第二步，用针头取一圈培养菌液，沿着培养皿的边缘均匀涂抹。

- 第三步，将试验纸片浸泡在抗菌剂溶液中，使其吸满试验物质。

- 第四步，将纸片放置在培养皿上，轻轻按压，使纸片与培养基充分接触。

- 第五步，将培养皿盖上盖子，反转，将其放置在恒温箱中培养。

- 结果观察：- 培养时间结束后，观察培养皿内是否出现抑菌圈或促进菌落生长的现象。

- 抑菌圈直径越大，表示抗菌剂对细菌的抑制作用越强。

- 通过抗菌圈的直径，可根据标准抗生素灭菌试验的结果判定细菌对于不同抗生素的产生耐药性。

- 对于消毒剂，观察培养皿上是否有菌落生长，如果有，则说明消毒剂没有起到抑制细菌生长的作用。

3. 结果解释：纸片扩散试验的结果通过抗菌圈的直径来评估试验物质对细菌的抑制效果。

根据不同的抗生素或消毒剂对不同菌种的最低抑菌浓度（MIC），可以判断抗菌剂的强度以及菌株对其的耐药性水平。

4. 注意事项：- 纸片扩散试验只是一种初步评价抗菌剂或消毒剂效果的方法，结果可能受到多种因素的影响，如扩散速度、温度、湿度等。

- 该方法主要适用于评估新抗菌剂的抗菌活性，对于临床已经使用的抗菌剂可能不适用，因为细菌株可能已经产生了相应的耐药性。

抗生素敏感实验——纸片扩散原理：纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。

在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。

不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小原理通俗说法：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测定菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分，溶解后便不断的向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。

在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。

该抑菌圈表示药物对该种细菌的生长繁殖具有抑制作用。

通过测定抑菌圈的直径大小，可以判定药物的抑菌强弱，抑菌圈直径越大表示药物抑菌作用越强，抑菌圈直径越小表示药物抑菌作用弱，没有抑菌圈表示该药物没有抑菌作用。

并且，经稀释法测得的MIC的对数和用纸片测定相应的菌株得到的抑菌直径之间大致呈直线相关，因此将两种方法相对应地测试各种据菌株所得数据，进行统计学的相关回归分析处理，可得到一条回归线，依此可推断该菌株的MIC，两者呈负相关关系，即MIC愈小，抑菌圈直径愈大。

材料（以大肠杆菌为例）：1.药品及细菌——诺氟沙星、新霉素、硫酸链霉素、氟苯尼考、卡那霉素、泰乐菌素、生理盐水、磷酸盐缓冲液、MH营养肉汤、MH琼脂培养基、大肠杆菌。

2.器材——纸片、试管、移液器、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、1000ml烧杯、PH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器方法1.培养基的制备：2.药敏纸片的制备2.1纸片制备：选择优质新华1号滤纸，用打孔器制成直径6mm的圆形滤纸片。

每200张一管，经120℃2h灭菌后备用2.2药物稀释每张以吸入20μL药液为标准，如纸片薄，药物原液需作调整。

纸片扩散法抗菌药物敏感试验的质量控制钟伟萍【摘要】目的抗菌药物敏感试验是临床抗菌治疗的指导性实验.关系到抗菌药物治疗成败.方法多种方法中选WHO推荐使用的利于基层医院开展的纸片扩散法.结果日常常规操作中应控制好平板厚度、琼脂浓度、细菌接种量、琼脂种类及多种因素.结论在严把纸片扩散法抗菌药物敏感实验的操作过程的同时,有必要做好质量控制,确保结果准确性,服务于临床.【期刊名称】《中国卫生产业》【年(卷),期】2017(014)026【总页数】2页(P38-39)【关键词】纸片扩散法;抗菌药物敏感试验;质量控制【作者】钟伟萍【作者单位】山东省青岛大学附属威海市立第二医院,山东威海 264200【正文语种】中文【中图分类】R446.1在临床感染性疾病、菌种的耐药性、抗生素的合理应用等。

抗菌药物敏感试验是实验室不可缺少的，常用方法有Etest法、稀释法、Kirby-Bauer法以下简称（K-B 纸片扩散法）以及全自动微生物分析仪等。

纸片扩散法是WHO推进使用的微生物敏感性测定方法[1]，能在抑菌浓度范围内待测菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。

根据抑菌圈的大小可判断待测菌对测定药物的敏感程度[2]。

其特点是操作简单，测定的药物可随临床需要而调整，易检测个别特殊耐药菌株[3]，更重要是扩散法有一套完整的质量控制，结果可靠，是微生物常用方法，全自动或半自动仪器分析法是一种微量肉汤稀释法[4]。

该文将平时工作中的质量控制要点阐述如下。

一次质量控制结果错误，常被认为是一种统计上的随机变化。

①接种平皿不均匀；②抑菌环量取记录直径有误；量取工具有误差；③标准菌株保存、污染、过期等改变；④细菌接种量，在K-B纸片扩散法药敏实验菌液量规范中提出固定接种0.35 mL菌液量[5]；⑤0.5管麦氏浊度管未摇匀、已过期；⑥孵育温度、时间、放置、气体等不合格；⑦MH培养基制作、深度、厚度、购入批次批号等有关；⑧药敏纸片质量改变。

立即观察药物平板，重复试验一般能够解决，如仍失控必须恢复每日质控查找原因。

细菌耐药性检测方法1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。

也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。

（2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。

（3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。

若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶（4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。

2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。

临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。

如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。

3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA 基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因。

检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥0.5цg/ml 的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。

纸片扩散法药敏试验操作程序1.目的规范纸片扩散法（K-B法）药敏试验标准操作程序，确保药敏结果准确。

2.原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。

抑菌圈的大小反映待检菌对测定药物的敏感程度，并与该药物对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。

3.设备、材料和试剂3.1.设备、材料恒温培养箱、比浊仪、0.45%NaCl、一次性使用拭子、无菌医用棉签、游标卡尺、镊子3.2.药敏纸片药敏纸片为直径6mm、吸水量为0.02ml的商品化专用药敏纸片（OXOID）；纸片需密封贮存于-20℃冰箱内；开封后的纸片与干燥剂一起置2℃-8℃冰箱保存；每次使用前先室温平衡1-2h，以避免开启贮存容器时产生冷凝水。

3.3.培养基自配或购买的水解酪蛋白（Mueller-Hinton，M-H）培养基是CLSI推荐的兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，PH为7.2-7.4。

3.4.接种菌量比浊标准菌液浓度为1.5×108/ml，相当于0.5麦氏单位标准。

4.菌悬液制备4.1.制备接种菌液：临床标本分离的细菌或标准菌株做药敏试验时，应挑取已分纯的菌落4-5个制备菌悬液。

4.1.1.直接菌落法：用一次性拭子挑取生长在无选择性琼脂平板上新鲜菌落，悬浮于0.45%生理盐水中，混匀后，采用比浊仪调整浊度至0.5麦氏浊度。

4.1.2.肉汤增菌法：将单个菌落接种至肉汤培养基，置于35℃孵育，采用比浊仪调整浊度至0.5麦氏浊度（通常孵育2-6h）。

5.实验方法常用在检测菌或标准菌株平板上挑取培养18~24h的纯菌落均匀溶解于3ml 0.45%无菌生理盐水中，调校浓度至0.5麦氏单位；校正后的菌液应在15min内接种。

5.1.接种用无菌医用棉签蘸取调好的菌液，在试管内壁将多余的菌液旋转挤去后在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60°，最后沿平板边缘涂抹1周，校正浓度后的菌液在15min内接种完毕。

SOP_15-25 纸片扩散法（K-B法）抗生素敏感试验标准操作程序【目的】用于分离菌的抗生素敏感试验。

【适用范围】WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。

本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。

无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。

【该SOP变动程序】本标准操作程序的改动,可由任一使用本SOP的工作人员提出,并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【试验用材料】1.培养基Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。

多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基，维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。

此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批间差异等方面均优于其他培养基。

若检测肺炎链球菌的敏感性时，在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。

测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和2.5mg/ml辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。

制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。

在水平的实验台上倾制。

琼脂厚为4mm，允许误差为土lmm。

琼脂凝固后，应测一下pH是否正确。

琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。

2.药物纸片抗菌药物纸片直径约为6.00～6.35mm，每片的吸水量约20μl。

采用K-B法，纸片的药物含量必须与该法规定的一致，不得任意更改。

药物纸片可以购买，也可自制，用前必须做质量鉴定。

用以下两个指标判定纸片的质量：2.1片间差：是衡量不同纸片含药是否均一的指标。

测定方法：以质控菌株接种M-H琼脂平板，一块平板上贴6张相同的纸片。

35C过夜，培养后，记录6个抑菌直径，其最大和最小之差不应大于1～2mm。

2.2准确度:判定纸片的实际含药量与标量是否一致。

纸片的合理保存十分重要。

药物纸片必须在有干燥剂的容器内低温(-10℃以下)保存。

检验科细菌耐药性监测SOP文件一、耐甲氧西林葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococci,MRS）MRS是引起临床感染的常见病原菌，同时也是引起医院感染的重要病原菌之一，其耐药特点是耐受甲氧西林的同时，还对临床广泛应用的多种抗生素呈现多重耐药，因而该菌所致感染已成为临床治疗的一大难题。

（一）MRS测定方法1、纸片扩散法接种物：直接悬液法从非选择琼脂平皿上挑取少许单个菌落至无菌生理盐水调至浓度0.5 McFarland,具体操作同常规纸片法药敏试验。

苯唑西林纸片，1μg/片，检测MRS平板应置于35℃（而不是37℃）孵育24h（而不是16～18h）。

结果判断：金黄色葡萄球菌：S：≥13mm；I：11～12mm；R:≤10mm。

凝固酶阴性葡萄球菌：S：≥18mm；R≤17mm。

对于苯唑西林纸片周围的抑菌圈内有任何小菌落或稀薄“菌膜”生长都应列为MRS。

2、琼脂筛选法：如果纸片试验结果中介时，可做琼脂筛选法，培养基为MH琼脂+6μg/ml苯唑西林+4%NaCl，调整菌液浓度0.5McFarland，于35℃孵育24h，凡有任何生长即使一个菌落均报MRS。

（二）MRS监测意义对于MRS，应报告对所有头孢菌素类和其他β-内酰胺酶类耐药，喹喏酮类药物，除氟哌酸外，环丙氟哌酸，氟嗪酸有较好抗菌活性（耐药率10～23%之间），利福平敏感率在90%以上，未见耐万古霉素菌株，但已有万古霉素中介金黄色葡萄球菌。

二、高水平耐药的肠球菌（HLAR）及耐万古霉素的肠球菌（VRE）（一）药敏测定方法1、常规测定方法：采用K-B纸片扩散法，头孢菌素不用做（均为耐药），氨苄，庆大霉素，替考拉宁，万古霉素一定要做。

2、高水平氨基糖甙类耐药性测定：⑴高含量纸片扩散法：通常测定庆大霉素和链霉素的高度耐药性，具体操作如常规纸片法药敏试验。

药敏纸片：庆大霉素：120μg/片；链霉素300μg/片结果判断：R：≤6mm；I：7～9mm；S：≥10mm⑵含单一高浓度抗生素琼脂平皿法：稀释法：庆大霉素：R：≥500μg/ml；链霉素：R：2000μg/ml3、万古霉素耐药性测定：纸片扩散法，具体操作如常规纸片法药敏试验，万古霉素纸片为：30μg/片，检测平皿置35℃24h（而不是16～18h），并注意抑菌圈内有无小菌落或薄膜生长。

细菌耐药的监测方法一、细菌耐药监测的方法定义 AST 是一个检测细菌耐药性的是一个检测细菌耐药性的体外抑菌试验（ART）AST目的：检出细菌对抗生素的耐药性，预测临床治疗结果。

AST:（1）手工试验 1.纸片扩散法(S,I,R)2.稀释法(MIC)3. E test(MIC)（2）自动仪器 Vitek，Microscan，Phoenix（3）分子试验 PCR直接检测mecA基因（4）酶试验 Nitrocefin、ESBL检测(一)常规药敏试验1.细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。

也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。

（2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。

（3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。

若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶（4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。

2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。

临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。

如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。