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细菌群体感应系统信号分子的分类及检测张彩凤【摘要】Quorum-sensing is a regulatory mechanism,with which the bacteria will release a number of specific signaling molecules,which regulate the group behavior of the specie or other species in the same environment.When the signaling molecules density reaches a critical threshold,bacteria can alter the gene expression to suit the change of environment.This review focuses on the classification of Quorum-sensing,and describes the forecast of application.%细菌的群体感应系统（Quorum-sensing,QS）作为一种细胞的信号转导机制,是细菌通过特定的信号分子浓度来监测周围环境中本身或其它细菌的数量变化,当信号分子达到浓度阈值时,能够启动菌体中相关的基因表达来适应环境变化的一种调控机制。
笔者综述了细菌群体感应系统的分类,并对其应用前景进行了展望。
【期刊名称】《生命科学仪器》【年(卷),期】2011(009)005【总页数】2页(P52-53)【关键词】群体感应;信号分子;检测【作者】张彩凤【作者单位】河北省衡水学院生命科学学院,河北衡水053000【正文语种】中文【中图分类】Q26细菌群体感应系统的研究，已成为国内外研究的热点。
革兰氏阳性细菌及阴性细菌都通过群体感应与周围环境进行信息交流，现已知QS系统参与许多细菌重要的生物学功能调节，如生物的发光、抗生素的合成、质粒的结合转移、病原细菌胞外酶与毒素的产生、生物群游现象以及生物膜形成、根瘤菌与植物共生等等[1]。
AHLs信号分子降解酶的研究进展魏金亚摘要：群体感应（Quorum-sensing system, QS）是原核生物和真核生物中与细胞群体密度相关的通讯机制，参与许多生物学功能的调控。
酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine laetone)AHLs)是调控QS系统的关键信号分子。
通过限制AHLs的浓度来调控与QS相关的生物学功能在理论和实践上具有重要意义。
本文从AHLs信号分子的降解为入口，简要概述了AHLs降解酶的种类、特点特性、生物学功能，并对其在生防和药理学上的应用进行了综述和展望。
关键词：群体感应AHLs 抑制AHL-内酯酶AHL-酰化酶AiiA AttM群体效应（Quorum-sensing system，QS）普遍存在原核生物之间和原核生物与真核生物之间，即细菌感知周围环境同种细胞密度调节其基因表达的现象。
AHLs是G-细菌进行群体效应胞间通讯的关键因素，细菌通过感知这种信号分子来感知细胞密度的阈值。
AHLs能够引发大量与细胞密度或生长时期有关的反应，如生物发光，抗生素合成、细胞游动和聚集、质粒接合转移、生物膜维持和分化、胞外酶合成及人和高等植物致病毒力产生等等[1-3]。
目前已经从一些原核生物和真核生物中鉴定出一些群体感应降解酶，这些降解酶可能降解细菌QS系统的信号分子AHLs，干扰细菌QS系统，抑制致病基因的诱导表达，破坏其参与调控的生物学功能。
在农业(防治植物病害)、医学（以QS系统的调控位点作为靶位来筛选抗药性物质）、环保(蓝藻水华)等研究方面具有重要意义。
AHLs降解酶的种类、特点特性、生物学功能、作用机制以及在生防和药理学上的应用前景等几个方面的研究现状进行了综述。
1 AHLs降解酶种类研究结果表明，许多动物（包括人类）和植物中的病原细菌如玉米细菌性枯萎病菌、菊欧文氏菌、嗜线虫致病杆菌、铜绿假单胞菌和欧文氏胡萝卜软腐病菌等都是依赖AHLs信号分子来实现对其致病因子的合成[7-12]。
细菌能自发产生、释放一些特定的信号分子，并能感知其浓度变化，调节微生物的群体行为，这一调控系统称为群体感应。
细茵群体感应参与包括人类、动植物病原茵致病力在内的多种生物学功能的调节。
简介群体感应（Quorum-Sensing）：近年来的研究证明细菌之间存在信息交流，许多细菌都能合成并释放一种被称为自诱导物质(autoinducer,AI)的信号分子，胞外的AI 浓度能随细菌密度的增加而增加，达到一个临界浓度时，AI能启动菌体中相关基因的表达，调控细菌的生物行为。
如产生毒素、形成生物膜、产生抗生素、生成孢子、产生荧光等，以适应环境的变化，我们将这一现象称为群体感应调节(quorum sensing．QS)。
这一感应现象只有在细菌密度达到一定阈值后才会发生，所以也有人将这一现象称为细胞密度依赖的基因表达(cell density de- pendent control of gene expression)。
[1]自身诱导物质AI细菌可以合成一种被称为自身诱导物质( auto-inducer ．AI ) 的信号分子，细菌根据特定的信号分子的浓度可以监测周围环境中自身或其它细菌的数量变化，当信号达到一定的浓度阈值时，能启动菌体中相关基因的表达来适应环境的变化，如芽胞杆菌中感受态与芽胞形成、病原细菌胞外酶与毒素产生、生物膜形成、菌体发光、色素产生、抗生素形成等等。
根据细菌合成的信号分子和感应机制不同，QS系统基本可分为三个代表性的类型：革兰氏阴性细菌一般利用酰基高丝氨酸内酯( AHL) 类分子作为AI ，革兰氏阳性细菌—般利用寡肽类分子(Al P) 作为信号因子，另外许多革兰氏阴性和阳性细菌都可以产生一种AI - 2的信号因子，一般认为AI - 2是种间细胞交流的通用信号分子，另外最近研究发现，有些细菌利用两种甚至三种不同信号分子调节自身群体行为，这说明群体感应机制是极为复杂的。
细菌信息素的特点1，分子量小：细菌信息素都是一些小分子物质，如酰基-高丝氨酸内酯(AHL)衍生物、寡肽、伽马一丁内酯等，能自由进出细胞或通过寡肽通透酶分泌到环境中，在环境中积累。
植物病原菌的检测原理植物病原菌的检测原理主要分为传统检测方法和分子检测方法两大类。
传统检测方法包括病斑观察、显微镜检测、分离培养、生化、免疫学和生物学检测方法等；分子检测方法主要包括PCR、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、荧光定量PCR、内参PCR、两步PCR、多重PCR、血清学检测、微阵列分析、测序等。
下面将详细介绍传统检测和分子检测方法的原理和应用。
传统检测方法1. 病斑观察法病斑观察是一种最简单、最常用的检测方法。
通过观察植物叶面、茎部等组织上的病斑症状特征，如色素改变、溃疡、软腐、凋萎等症状，判断植物是否感染了病原菌。
该方法通常用于狭义上的病原菌检测，即只能推断出可能存在病原菌，但不具备进一步鉴定病原菌的能力。
2. 显微镜检测法显微镜检测是通过放大被检测样品的细菌菌落、孢子、分生孢子等微观结构，借助显微镜观察和鉴定病原菌的一种方法。
该方法通过观察病原菌的形态、大小、染色性质、分离和生长特征等，与已知的病原菌进行比对，确定植物感染的病原菌种类。
3. 分离培养法分离培养法是通过将被检测的植物组织样品分离培养于富含营养物的培养基上，利用病原菌的生长特性和营养需求进行分离纯化。
通过培养基的选择、温度、湿度、pH值、光照等条件的控制，使病原菌表现出明显的生理与形态特征，便于进一步鉴定和定量检测。
4. 生化检测法生化检测法主要是通过检测病原菌体内的一些特有的生化成分和活性，如酶活性、甘油分解酸生成、酸碱生成、氨氧化等，根据其特异性判断病原菌的类型和数量。
5. 免疫学检测法免疫学检测法主要是利用免疫学原理，通过检测样品中的病原菌抗原或抗体来判断其存在与否。
免疫学检测方法可分为免疫电镜检测、免疫荧光检测、ELISA等。
6. 生物学检测法生物学检测法是利用宿主植物对某一种病原菌的特异性反应来检测病原菌。
常用的生物学检测方法包括种子法、接种法、淫种法、耐病品种鉴定法等。
分子检测方法1. PCR检测法PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，能在短时间内通过特异引物和聚合酶对DNA模板进行扩增。
细菌群体感应在微生物生态系统中的作用研究细菌群体感应是一种自协调的细菌行为，细菌通过分泌信号分子来与它们周围的同种细菌进行通信，并协同地做出响应。
这种协作行为有助于建立细菌社区，并有助于它们在复杂的微生物生态系统中生存和繁殖。
本文将讨论细菌群体感应在微生物生态系统中的作用，并探讨该领域目前的研究进展。
1. 细菌群体感应的基本原理细菌群体感应是一种通过细菌间分泌的信号分子进行交流的行为，这些分子可以传递不同的信息，例如细胞密度、群体方向、环境变化等。
在感应过程中，当一定数量的信号分子被积累到足够数量时，细菌将协调做出共同的行为。
例如，一些细菌会通过群体感应来形成生物膜，从而形成细菌社区，或者来协同合成一些生物活性物质，如光合色素、激素、抗生素等。
这些共同的行为有助于细菌在微生物生态系统中生存和繁殖。
2. 细菌群体感应在微生物生态系统中的作用细菌群体感应在微生物生态系统中起着至关重要的作用。
首先，它有助于细菌建立稳定的细菌社区，并与其他细菌、微生物甚至宿主紧密相连。
这些细菌社区有时会形成生物膜，从而能够更好地抵御环境压力。
其次，它有助于细菌在微生物生态系统中发挥“分工协作”的作用，不同种类的细菌能够通过群体感应来分布不同的环境和角色，以最大化资源利用率并优化生态系统。
另外，细菌群体感应还发挥着各种生态学角色。
例如，在土壤微生物系统中，细菌群体感应可以促进植物生长和根际土壤释放养分。
一些细菌群体感应所产生的代谢产物还被发现对宿主免疫反应和免疫功能具有重要意义。
此外，细菌群体感应还被认为是生态系统中细菌和其他生物之间相互作用的重要媒介，它能够帮助生物维持相互联系并参与生态系统的稳定性。
3. 细菌群体感应的研究进展目前，细菌群体感应的研究进展日新月异。
这是因为细菌群体感应在医学、环境保护、农业等领域都有重要应用价值。
例如，在医学中，对细菌群体感应的深入研究能够有助于探索新型抗生素的生产和应用；环境保护中，它可以帮助减少有毒物质的生产和释放，改善微生物生态环境；在农业中，它能够协助控制农业害虫和植物病害。
AHLs信号分子降解酶的研究进展魏金亚摘要：群体感应（Quorum-sensing system, QS）是原核生物和真核生物中与细胞群体密度相关的通讯机制，参与许多生物学功能的调控。
酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine laetone)AHLs)是调控QS系统的关键信号分子。
通过限制AHLs的浓度来调控与QS相关的生物学功能在理论和实践上具有重要意义。
本文从AHLs信号分子的降解为入口，简要概述了AHLs降解酶的种类、特点特性、生物学功能，并对其在生防和药理学上的应用进行了综述和展望。
关键词：群体感应AHLs 抑制AHL-内酯酶AHL-酰化酶AiiA AttM群体效应（Quorum-sensing system，QS）普遍存在原核生物之间和原核生物与真核生物之间，即细菌感知周围环境同种细胞密度调节其基因表达的现象。
AHLs是G-细菌进行群体效应胞间通讯的关键因素，细菌通过感知这种信号分子来感知细胞密度的阈值。
AHLs能够引发大量与细胞密度或生长时期有关的反应，如生物发光，抗生素合成、细胞游动和聚集、质粒接合转移、生物膜维持和分化、胞外酶合成及人和高等植物致病毒力产生等等[1-3]。
目前已经从一些原核生物和真核生物中鉴定出一些群体感应降解酶，这些降解酶可能降解细菌QS系统的信号分子AHLs，干扰细菌QS系统，抑制致病基因的诱导表达，破坏其参与调控的生物学功能。
在农业(防治植物病害)、医学（以QS系统的调控位点作为靶位来筛选抗药性物质）、环保(蓝藻水华)等研究方面具有重要意义。
AHLs降解酶的种类、特点特性、生物学功能、作用机制以及在生防和药理学上的应用前景等几个方面的研究现状进行了综述。
1 AHLs降解酶种类研究结果表明，许多动物（包括人类）和植物中的病原细菌如玉米细菌性枯萎病菌、菊欧文氏菌、嗜线虫致病杆菌、铜绿假单胞菌和欧文氏胡萝卜软腐病菌等都是依赖AHLs信号分子来实现对其致病因子的合成[7-12]。
植物病原细菌鉴定实验指导一、实验目的了解植物病原细菌的分类与鉴定方法，掌握分离、纯化、鉴定菌种方法，培养技术和生化鉴定技术。
二、实验原理细菌的鉴定包括形态学、生理生化和分子生物学鉴定等。
一般细菌的形态学特征，如生长形态、荧光特性、大小观感、颜色、质地等特征对细菌种属的鉴定非常重要；生理生化鉴定主要通过细菌在不同培养基上的生长特性、代谢途径等指标；分子生物学鉴定主要通过PCR扩增等手段，对细菌基因组的DNA序列进行分析和比对，建立物种特异性的DNA指纹。
三、实验步骤1、样品收集和处理收集可能感染病原细菌的植物样品，如叶片、茎、根等，通常选择表现症状明显的植株或部位作为样品。
将植物样品取出，进行表面消毒处理，可使用0.1%次氯酸钠、70%乙醇等消毒液对样品进行表面消毒，去除植物表面微生物的影响。
2、分离与纯化将消毒后的植物样品移植到适宜的培养基中，如普通营养琼脂培养基，选用相应的富营养培养基有利于分离病原菌。
将培养皿放置在适宜的温度和湿度下进行培养，通常选用28℃，相对湿度为60%左右为适宜。
在植物样品污染细菌生长后，从单个菌落中分离纯化，将纯化后的菌株进行保存或进行进一步的鉴定工作。
3、形态学鉴定观察细菌菌落的形态、大小、颜色等特征，对细菌形态特征的精细观察非常重要。
如分泌物、粘质或胞外多糖的分泌，以及生物质塑性、溶胶的形成等细节观察是形态学鉴定的重要参考标准。
4、生理生化鉴定通过生理生化鉴定，了解细菌的生长特性和代谢途径，选用不同的培养基和筛选方法可以判断病原菌的代谢类型。
如选择碳水化合物代谢及活性酶的测定等手段，增加了进一步分类和鉴定细菌的能力。
5、分子生物学鉴定应用PCR技术，对从植物样品中提取到的细菌DNA进行扩增，基于特异性PCR产物筛选与目的DNA序列的核苷酸序列比对，可以非常准确地测定细菌所属属种。
四、实验注意事项1、实验室要保持清洁，保证实验环境卫生。
2、植物样品取自已知病害株，避免误判。
植物内生菌的高通量测序分析与应用植物内生菌是指寄生在植物体内，与植物共生的微生物。
它们能够提高植物的生长和抗病能力，从而保护和促进植物的生长。
植物内生菌是生态系统中重要的组成部分，但对其多样性和功能的研究仍相对较少。
高通量测序技术的出现为研究植物内生菌提供了新的方法，从而促进了研究进展。
一、高通量测序技术的概述高通量测序技术是指以高度自动化的方式对DNA或RNA序列进行高通量测序，从而得到海量的DNA或RNA序列数据。
高通量测序技术的出现极大地推动了基因组学、转录组学和蛋白质组学等领域的发展，使得科学家们能够更加深入地理解生命的本质。
同时，高通量测序技术也应用于微生物学领域的研究，为研究微生物与宿主之间的相互作用提供了新的手段。
二、植物内生菌的高通量测序分析植物内生菌的高通量测序分析主要包括以下步骤：从植物中提取细菌DNA或RNA，将其测序，利用生物信息学方法对数据进行分析并解读。
其中，细菌DNA或RNA的提取是关键的一步，直接影响到后续测序的准确性和结果的可靠性。
常用的提取方法有CTAB法、商业DNA提取试剂盒等。
DNA建库方法包括PCR扩增法和文库构建法等。
常用的测序技术有Illumina、454和Ion Torrent等。
对于测序数据的分析，主要包括序列质量控制、比对到基因组、功能注释和微生物多样性分析等步骤。
三、应用高通量测序技术的应用在植物内生菌研究方面主要体现在以下几个方面：1、细菌多样性分析：通过高通量测序技术，可以分析和比较不同物种、不同栽培期和不同种植环境中植物内生菌的多样性和丰度。
2、功能注释分析：通过高通量测序技术，可以分析植物内生菌的基因组和转录组，了解其功能和生物学特性，从而为深入研究植物内生菌的生物学过程提供基础数据。
3、参与植物养分循环的研究：植物内生菌和植物之间的相互作用存在许多方面，其中包括植物养分循环与营养互作。
通过高通量测序技术，可以揭示细菌与植物之间养分循环和营养互作的分子机制，从而为发展微生物肥料和提高农作物产量提供支持。
一种定量测定群体感应信号分子ahl的生物学方法群体感应信号分子(AHL)是一类在细菌间传递的化学信号分子，起到调节以细菌共享资源为基础的群体行为的重要作用。
本文将介绍一种定量测定群体感应信号分子AHL的生物学方法。
AHL是通过产生、分泌和感应的方式在细菌社群中传递的信号分子。
在细菌合作进化中，AHL分子扮演了一种高效通信系统的角色。
测定AHL分子的含量可以帮助我们了解细菌社群的协作机制以及疾病形成的过程。
测定AHL的方法主要包括生物学方法和生物物理化学方法，本文将重点介绍一种生物学方法。
生物学测定AHL的方法是基于细菌感受器Quorum Sensing自动调控系统的原理。
这种方法通过测定AHL的效应剂对细菌群体行为的影响来定量测定AHL的含量。
具体操作步骤如下：1.培养产生AHL的细菌：选取含有AHL感应器基因的细菌株，例如常用的海洋细菌Vibrio fischeri。
将细菌在适当的培养基中培养至合适的生长期。
2.收集培养液：将细菌培养液离心，收集上清液，称为细菌培养液。
3.制备AHL效应剂：选取一种能够与AHL相互作用的棕榈酰传感蛋白(Pal)。
将该蛋白纯化并与探针染料(如螺旋体红)结合，制备AHL效应剂。
4.测定AHL的含量：将细菌培养液与AHL效应剂共孵育一段时间。
通过测定AHL效应剂与AHL之间的结合产生的荧光信号的强度来定量测定AHL的含量。
5.分析结果：根据测定得到的荧光信号强度，可以比较不同细菌培养液中AHL的含量。
这种生物学方法测定AHL的优势在于可以定量测定AHL的含量，并能通过对比不同细菌培养液中AHL含量的差异来研究细菌间的相互作用和共享资源的机制。
然而，这种方法也存在一些限制。
首先，该方法只适用于具有AHL 感应机制的细菌，对于其他不同类别的细菌需要采用其他方法。
其次，该方法需要对AHL感应器基因进行表达，这可能会增加实验的复杂性。
最后，该方法只能从培养液中测定AHL的含量，无法对AHL在细菌内部的分布和转运进行定量测定。
细菌群体感应信号分子淬灭酶的研究进展邢启凡;柳鹏福;史吉平;孙玉梅【摘要】群体感应（Quorum sensing，QS）是细菌细胞间通过信号分子互相交流的一种现象，细菌细胞通过分泌并感应特定的信号分子浓度，当信号分子浓度达到一定阈值时，细菌细胞会启动特定基因尤其是很多致病基因的表达，这就给防治某些植物、动物性疾病提供了一种新思维。
群体淬灭（Quorum quenching，QQ）就是基于群体感应而提出的，它主要是通过分解细菌细胞所产生的信号分子，使信号分子浓度在阈值之内，从而使细菌无法表达特定致病因子，进而防治病害的一种方法，群体淬灭酶是研究的最多也是最有效的淬灭途径。
到目前为止，很多群体淬灭酶已经被分离出来。
系统总结了群体淬灭酶的种类、特性、催化机制和生理功能方面的进展。
%Quorum sensing(QS)is a phenomenon of intercellular communication of bacteria via signal molecules. Bacteria secrete the specific signal molecules and respond to them, and bacterial cells enable the expression of specific genes, especially disease-causing genes whilethe signal molecules accumulate to a threshold concentration. This provides a new thought to prevent plants and animals from bacterial pathogenicity. Quorum quenching(QQ)based on QS system is a schema to decompose the signal molecules beyond the threshold concentration, and therefore represses the expression of specific virulence gene, so finally the prevention and control of diseases are achieved. The enzymes of QQ have been explored the most and also proved to be the most effective ways of quenching. To date, many QQ enzymes have been isolated successfully.Here we review progress on QQ enzymes with aspects of their type, property, catalytic mechanism, and physiologic function.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2015(000)010【总页数】8页(P48-55)【关键词】群体感应;群体淬灭;分子淬灭酶;酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶;酰基高丝氨酸内酯酶【作者】邢启凡;柳鹏福;史吉平;孙玉梅【作者单位】大连工业大学生物工程学院，大连 116034;中国科学院上海高等研究院可持续技术研究中心，上海 201210;中国科学院上海高等研究院可持续技术研究中心，上海 201210;大连工业大学生物工程学院，大连 116034【正文语种】中文微生物自从被发现直到20世纪60年代，人们一直认为细菌是单细胞生物，不会表现出多细胞生物的性状。
植物相关细菌群体感应信号分子的检测*刘晓光1, 2, 高克祥2, 高吉刚31江苏大学生命科学研究院镇江（212013）2山东农业大学植保学院泰安（271018）3 山东农业大学化学与材料科学学院泰安（271018)E-mail：xgliu66@摘要：许多革蓝氏阴性细菌以种群密度依赖的方式调控基因的表达，这种称为群体感应的调控机制主要基于细菌产生的可扩散的小分子信号物质——酰基高丝氨酸内酯（AHLs）。
通过组合使用灵敏度不同的系列报告菌株，基于琼脂平板的生物检测及反相C18薄层层析（TLC）分析，比较研究了3株植物固氮内生菌Herbaspirillum spp.和2株植物根际促生菌Serratia plymuthica产生AHLs的模式。
结果显示了植物细菌AHLs的多样性。
3株固氮内生菌Herbaspirillum spp.和S. plymuthica菌株IC1270都与小麦根际生防细菌Pseudomonas fluorescens 2-79具有相似的模式，产生OH-取代基的AHLs。
而2个S. plymuthica 菌株，从葡萄根际分离的IC1270和从油菜根际分离的菌株HRO-C48则产生完全不同类型的AHLs。
菌株IC1270主要产生OH-取代基的HHHL，HOHL， HRO-C48却产生无取代基的BHL , HHL 和优势种O-取代基的OHHL。
由此说明不同属的植物细菌可能具有相似的AHLs模式；相反，即使生态位相似的同种植物根际细菌S. plymuthica的不同菌株间，却可能产生完全不同类型的AHLs，似乎与亲缘关系无关。
关键词：Serratia plymuthica；Herbaspirillum spp.; 群体感应系统；酰基高丝氨酸内酯中图分类号：Q9331.引言在革蓝氏阴性细菌中，有3个重要的基因表达的全局调控系统，即GacA/GacS双因子信号转导系统（GacA/GacS two-component system），胁迫和稳定期的δ因子RpoS，以及细胞种群密度依赖的Quorum-sensing（QS）系统。
坚强肠球菌SQ-3-2基于Lux S群体感应系统信号分子AI-2的检测及方法优化张腾;贺银凤【摘要】To explore that if the Enterococcus durans SQ-3-2 produces the quorum-sensing signal autoinducer-2 by utilizing a biological assay and optimize the test condition at the same time.The experiment employed a biolumi-nescent bacterial reporter strain called Vibrio harveyi BB170, which produces light in response to AI-2.We collected the cell-free culture fluids and added them to the V.harveyi BB170 reporter strain.The resulting light production was measured using a luminometer or scintillation counter.AI-2 activity was deduced according to the induction of luminescence ofV.harveyi BB170.The fluorescence of the V.harveyi increased after adding the cell-free culture fluids of E.durans SQ-3-2 and based on the fluorescence intensity of different sample experiment condition was optimized.We found that the E.durans SQ-3-2 produces the quorum-sensing signal AI-2.With the increase of cell density, concentration of signaling molecule AI-2 increased and the maximum value was reached in logarithmic period.Optimal testing condition was sample pH =7 and sample ratio of 1: 100.Experiment lays the foundation to further study of function of AI-2 from E.durans SQ-3-2.At the same time, the optimized experimental conditions for detection of quorum-sensing signal AI-2 of various kinds of lactic acid bacteria is the experimental foundation.%通过生物学方法检测坚强肠球菌SQ-3-2是否产生群体感应信号分子AI-2,并对检测条件进行优化.将坚强肠球菌SQ-3-2培养上清液加入到由哈维氏弧菌BB170构成的特异性报告系统中,使用多功能酶标仪化学发光模式检测荧光强度,通过与AB培养基空白对照进行荧光强度的比较得出坚强肠球菌SQ-3-2是否产生具有活性的AI-2信号分子,同时依据荧光强度的大小对加样比和酸碱度两个条件进行优化.研究结果表明,坚强肠球菌SQ-3-2培养上清液中含有AI-2信号分子,随着菌体密度的增加信号分子AI-2的浓度也随之增大,在对数期末期达到最大值.方法优化实验证明最佳检测条件为待测样品pH=7,加样比例为1∶100.实验为进一步研究坚强肠球菌SQ-3-2的Lux S系统打下基础.同时,方法优化实验为检测各类乳酸菌是否分泌AI-2信号分子提供了一定的实验基础和理论依据.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2013(039)002【总页数】6页(P168-173)【关键词】坚强肠球菌SQ-3-2;信号分子AI-2;检测;方法优化【作者】张腾;贺银凤【作者单位】内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特,010018【正文语种】中文群体感应(quorum sensing，简称QS)即细菌随着菌体密度的增大和生长周期的变化分泌出一种或几种化学信号分子，通过这些信号分子进行种内或种间交流，协调群体行为［1］。
植物相关细菌群体感应信号分子的检测*刘晓光1, 2, 高克祥2, 高吉刚31江苏大学生命科学研究院镇江（212013）2山东农业大学植保学院泰安（271018）3 山东农业大学化学与材料科学学院泰安（271018)E-mail：xgliu66@摘要：许多革蓝氏阴性细菌以种群密度依赖的方式调控基因的表达，这种称为群体感应的调控机制主要基于细菌产生的可扩散的小分子信号物质——酰基高丝氨酸内酯（AHLs）。
通过组合使用灵敏度不同的系列报告菌株，基于琼脂平板的生物检测及反相C18薄层层析（TLC）分析，比较研究了3株植物固氮内生菌Herbaspirillum spp.和2株植物根际促生菌Serratia plymuthica产生AHLs的模式。
结果显示了植物细菌AHLs的多样性。
3株固氮内生菌Herbaspirillum spp.和S. plymuthica菌株IC1270都与小麦根际生防细菌Pseudomonas fluorescens 2-79具有相似的模式，产生OH-取代基的AHLs。
而2个S. plymuthica 菌株，从葡萄根际分离的IC1270和从油菜根际分离的菌株HRO-C48则产生完全不同类型的AHLs。
菌株IC1270主要产生OH-取代基的HHHL，HOHL， HRO-C48却产生无取代基的BHL , HHL 和优势种O-取代基的OHHL。
由此说明不同属的植物细菌可能具有相似的AHLs模式；相反，即使生态位相似的同种植物根际细菌S. plymuthica的不同菌株间，却可能产生完全不同类型的AHLs，似乎与亲缘关系无关。
关键词：Serratia plymuthica；Herbaspirillum spp.; 群体感应系统；酰基高丝氨酸内酯中图分类号：Q9331.引言在革蓝氏阴性细菌中，有3个重要的基因表达的全局调控系统，即GacA/GacS双因子信号转导系统（GacA/GacS two-component system），胁迫和稳定期的δ因子RpoS，以及细胞种群密度依赖的Quorum-sensing（QS）系统。
它们控制植物相关细菌的许多表型，如植物生长促进能力、致病性、次生代谢物的产生、生物膜形成以及蛋白和酶的分泌等[1]。
酰基高丝氨酸内脂N-acyl homoserine lactones（AHLs/acyl-HSLs）是许多革兰氏阴性细菌都产生的群体感应信号分子，它作为自身诱导物（autoinducer）在革蓝氏阴性细菌中介导以种群密度依赖和生长发育阶段(指数生长后期和稳定期)依赖方式的基因表达调控。
植物相关细菌的QS系统调控微生物种群之间以及与寄主植物之间的相互作用，包括共生、致病性、抗生素及胞外酶的产生等特性，因此在农业、医学、环境保护等领域具有广阔的应用前景。
而且AHLs在自然界中作为全局调控的信号分子，通常是在GacA/GacS两组分信号转导系统的控制之下。
许多研究已证实这3个全局调控系统之间存在着密切联系，交互作用（cross-talk）。
尽管有些结果相互矛盾，依然可以推测这种调控的级联反应在细菌中可能是一个普遍的现象[2, 3]。
本文通过组合使用多种系列灵敏度不同的AHLs信号分子的报告菌株或质粒，以植物根基金项目：本课题受国家自然科学基金（项目编号：30370954，30670030）资助际生防细菌Serratia plymuthica 菌株IC1270[4]和HRO-C48[5]，以及3种具有固氮作用的禾本科植物内生细菌Herbaspirillum spp.[6-9]为供试菌株，初步研究并比较分析了不同类型的植物相关细菌产生AHLs信号分子的模式，为进一步阐明QS系统全局调控细菌和寄主植物互作的机制奠定基础，可为通过遗传操纵QS信号通路改善植物与生防或固氮细菌菌株的有益互作开辟新途径。
2.材料和方法2.1 材料2.1.1 菌株和培养条件本研究所使用的细菌菌株和质粒见表1。
液体或固体的LB/LA (Luria-Bertani broth and agar) 用于细菌的培养。
报告菌株和供试菌株分别于30℃或37℃振荡培养（140 rpm）至对数生长后期。
2.1.2抗生素本实验所用抗生素的工作浓度：氨苄青霉素(Amp)， 100µg/ml；利福平(Rif)，40µg/ml ；庆大霉素(Gm)，30µg/ml；四环素(Tc)，20µg/ml。
购于Sigma公司。
表1 供试菌株和质粒Tab1. Strains and plasmids used in this studyStrain or plamid Relevant characteristics* Reference or sourceAgrobacterium tumefaciens NTL4/pZLR4 Gm r Cb r; β-galactosidase induction-based acyl-HSL bioreporter 11 Chromobacterium violaceum CV026 Violacein production-based acyl-HSL bioreporter 12 Escherichia coli F-endA1 hsdR17 (rK _ mK +) supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1DH5αΦ80d lacZ∆M15 λ- 13S17-1(λ-pir) thi pro hsdR hsdM recA rpsL RP4-2 (Tc r::Mu) (Km r::Tn7) 13 Pseudomonas fluorescens 2-79 phenazine+ production of 3-hydroxy acyl-HSLs 14 Serratia plymuthicaIC1270 Rif r, isolated from rhizosphere of grape in Uzbekistan 4 HRO-C48 Rif r, isolated from rhizosphere of oil rape in Germany 5 Herbaspirillum seropedicae 7 Herbaspirillum frisingense 8 Herbaspirillum rubrisubalbicans 9 PlasmidspSB401 Tc r, lux-based acyl-HSL bioreporter 15 pSB536 Amp r, lux-based acyl-HSL bioreporter 15 pSB1075 Amp r, lux-based acyl-HSL bioreporter 15* Amp r, ampicillin resistance; Gm r, gentamicin resistance; Tc r, tetracycline resistance; Rif r, rifampicin resistance.2.2 方法2.2.1 培养上清液中萃取AHLs信号分子：50 ml待测菌株的过夜培养物，通过离心除去细菌菌体，上清液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，加入无水硫酸钠，过滤后通过旋转蒸发干燥, 回溶于1.5ml乙酸乙酯中。
进一步通过真空旋转蒸发浓缩，最终残余物溶解于50µl 乙腈中，于-20℃冰箱中保存，用于基于琼脂平板的生物检测和TLC分析。
2.2.2 基于琼脂平板的AHLs生物检测：不同的报告质粒或菌株对检测不同类型取代基以及碳链长度的AHLs 信号分子的灵敏度不同[2]，本实验组合使用以下系列的报告质粒和菌株几乎可检测所有侧链长度和不同取代基的AHLs 信号分子。
参照文献[10]的方法，在已制备好的琼脂平板上，铺一层与不同报告菌株混合的0.6%的软琼脂，凝固后打孔（5mm ），孔内注入待测样品，并以合成的多种AHLs 标准样品（Sigma ）为对照。
30℃恒温箱中孵育数小时或过夜培养，观察结果并拍摄照片。
应用报告质粒（pSB401, pSB536, pSB1075）分析检测上述AHLs 提取物的生物发光（lux -based ）能力，发射的光线通过CL-BIS 发光仪 (DNR Imaging Systems Ltd.)监测。
报告菌株Chromobacterium violaceum CV026产紫色素分析由样品孔周围细菌菌苔产生的深篮紫色的色素指示AHLs 信号分子的产生；报告菌株Agrobacterium tumefaciens NTL4/pZLR4在X-Gal (40µg/ml) 存在时诱导β-半乳糖苷酶的产色分析参考文献[7]的方法，样品孔周围扩散的蓝色区带指示AHLs 信号分子的产生。
2.2.3 AHLs 信号分子的TLC 分析[11]：通常取5µl 的乙酸乙酯提取液点样于RP18，F 254S 反相TLC 平板（德国Merck ），展开剂为甲醇：水（60：40，vol/vol ）。
约4h 充分展开后，溶剂被蒸发，干燥的TLC 平板用混有不同报告菌株的软琼脂（0.6% agar ）覆盖。
琼脂凝固后，至于密闭的塑料容器中30℃恒温箱中孵育数小时或过夜培养，观察结果并拍摄照片。
以合成的AHLs 标样作对照。
3. 结果与分析3.1 S . plymuthica IC1270 和Herbaspirillum spp. 菌株AHLs 的检测分析3.1.1琼脂平板检测结果：使用产生蓝色斑点的报告菌株A. tumefaciens NTL4/pZLR4（图1A ）和生物发光的报告质粒pSB401（图1B ）时，菌株IC1270都表现阳性反应；而产紫色素的报告菌株Chromobacterium violaceum CV026和报告质粒pSB536, pSB1075都不能检测到菌株IC1270 AHLs 信号分子的产生，表现阴性反应。
也说明菌株IC1270不产生长链的信号分子（≥C 10-HSLs ）和短链的BHL(N-butanoyl-L-HSL)。
而使用报告菌株 A. tumefaciens NTL4/pZLR4时，3个Herbaspirillum spp. 菌株样品孔周围都产生蓝色区带，表现阳性反应（图1A ），产生AHLs 。
图１ 在琼脂平板上检测S. plymuthica IC1270 和Herbaspirillum spp.产生的AHLs 信号分子Fig 1 Detection of AHLs produced by S. plymuthica IC1270 and Herbaspirillum spp. on agar-plates with A.tumefaciens NTL4/pZLR4 reporter (A) and pSB401 lux reporter (B)OHHL: standard; IC1270: S. plymuthica IC1270; H1: H.seropedicae ; H2: H. frisingense ; H3: H. rubrisubalbicans3．1．2 AHLs 信号分子的TLC 分析：经TLC 分离后，使用混有报告菌株A. tumefaciens NTL4/pZLR4和x-gal 的软琼脂铺平板，与标准样品比较，并以生防菌P. fluorescens 2-79的AHLs （Lane 6）为参照[14]，结果显示S. plymuthica 菌株IC1270产生至少3种可检测水平的羟基取代基的HHHL(N-3-hydroxy-hexanoyl-L-HSL)和HOHL(N-3-hydroxy-octanoyl-L-HSL)及1种未知的信号分子； 而3个Herbaspirillum spp. 菌株产生2种可检测水平的羟基取代基的HHHL （R f =0.56）和HOHL( R f =0.30)。
