picbio三代测序原理

揭晓你所不了解的第三代测序技术什么是第三代测序技术？百众源生物微信第三代测序技术是指单分子测序技术。

DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。

如果你还记得，我们之前说过二代测序之所以要进行PCR扩增是为了放大信号，而在第三代测序里，在没有进行PCR扩增的情况下，是怎样做到对碱基信号的识别的呢？本文为你揭晓。

1.第三代测序技术原理第三代测序技术原理主要分为两大技术阵营：第一大阵营是单分子荧光测序，代表性的技术为美国Helicos Biosciences的SMS技术和美国太平洋生物（Pacific Biosciences）的SMRT（single molecule real-time,SMRT）技术。

HelicosBiosciences公司虽然第一个成功的开发了单分子测序技术，但未能解决读长的问题，最后公司运营失败，被迫在2012年关闭。

所以，目前所剩的第三代测序技术只有Pacific Bioscience公司推出的单分子实时DNA测序仪。

其实纳米孔测序（nanopore sequencing）在国外也被称为第三代测序技术，但是国内大家喜欢把它列为第四代测序技术。

Pacbio的测序原理是：DNA聚合酶Phi29和模板结合，4色荧光标记4种带荧光集团的碱基（即是fluoro-dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。

当加入的碱基与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。

这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。

同时这DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一，读长主要跟酶的活性保持有关，它主要受激光对其造成的损伤所影响。

第二大阵营为纳米孔测序，代表性的公司为英国牛津纳米孔公司。

新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。

三代测序原理
三代测序原理是指第三代测序技术，又称为单分子测序技术。

与第一代（Sanger测序）和第二代（高通量测序）相比，第三代测序技术具有更高的速度、更低的成本和更长的测序读长等优点。

第三代测序技术的原理主要是基于测序模板的直接测序，而不需要PCR扩增。

这种直接测序的方法可以避免PCR扩增引入
的错误，并且能够在一个测序周期内得到完整的序列信息。

在第三代测序技术中，常用的方法是通过将DNA分子固定在
一个载体上，形成DNA聚集体。

然后，通过负电荷的方式将
这些DNA聚集体附着在固定的表面上，形成一个DNA分子
阵列。

接着，通过使用荧光染料将这些固定的DNA分子标记出来，
并且使用激光束在一个固定的区域内进行扫描。

这样，就可以得到每个DNA分子的位置和荧光信号强度信息。

在测序过程中，通常会使用一种特殊的酶来控制DNA链的合
成过程。

这种酶能够识别每个碱基的序列信息，并且在特定的条件下将其添加到适当的位置。

通过不断重复这个步骤，直到测序反应完成，就可以得到整个DNA分子的序列信息。

总结起来，第三代测序技术的原理是通过直接测序DNA模板，
不需要PCR扩增，通过固定DNA分子并使用荧光标记，通过酶的作用在特定条件下完成碱基的添加，最终得到完整的
DNA序列信息。

这种技术具有快速、低成本和长读长等优势，在各种生物学研究中得到了广泛的应用。

二代和三代测序原理及技术详解二代测序（Second Generation Sequencing）和三代测序（Third Generation Sequencing）是现代生物学中常用的两种高通量测序技术。

二代测序技术主要包括Illumina测序技术和Ion Torrent测序技术，而三代测序技术则由PacBio和Oxford Nanopore等公司开发。

本文将详细介绍二代和三代测序的原理和技术。

二代测序技术采用了不同的原理，但其基本步骤相似。

首先，DNA 或RNA样本需要经过一系列的前处理步骤，如DNA片段化、连接测序指示子、PCR扩增等。

然后，将样品片段化的DNA或RNA分子固定到测序平台上，通过荧光标记的碱基依次加入到模板上，并经过图像采集系统进行扫描和记录。

最后，根据荧光信号的强度和位置确定每个碱基的序列，并通过计算机算法进行基因组的重建和分析。

Illumina测序技术是目前应用最广泛的二代测序技术之一。

其基本原理是通过将DNA片段固定到测序芯片上的特定位置上，然后通过反复的循环扩增和碱基加入的方式进行测序。

在每个循环中，只能加入一种荧光标记的碱基，并记录荧光信号，之后通过去除荧光信号并进行图像分析来确定碱基的序列。

Illumina测序技术具有高通量、高准确性和较低的测序成本，并广泛应用于基因组学、转录组学和表观遗传学等领域。

Ion Torrent测序技术是另一种常用的二代测序技术。

其原理基于DNA聚合酶催化链延伸反应，该反应会释放出质子，通过测量质子释放的情况来确定碱基的序列。

Ion T orrent测序技术具有高通量和较低的测序成本，但由于其测序误差率较高，主要应用于低复杂度的基因组测序和个体检测等领域。

与二代测序技术相比，三代测序技术具有更长的读长和更高的速度。

PacBio是其中一种代表性的三代测序技术。

PacBio测序技术基于单分子实时测序（Single-Molecule Real-Time Sequencing）原理，通过将DNA聚合酶与荧光标记的碱基一起加入到DNA模板上，通过测量聚合酶引发的荧光信号来确定碱基的序列。

三代测序之PacBio SMRT技术全解析2017-05-11 11:29 来源:基因谷技术气温回升，天气渐暖，花儿开了一簇又一簇~在这美好的季节里，我们准备聊点新话题。

今天小编要来和你分享：PacBio SMRT测序那些事儿~测序技术在近几年中又有里程碑的发展，Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。

与前两代相比，第三代测序有什么不同呢？今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBio SMRT测序平台。

PacBio SMRT测序原理Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。

基本原理如下：聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落聚合反应持续进行，测序同时持续进行PacBio SMRT测序原理PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的？我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。

SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。

ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。

只有在这个区域内，碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到，大幅地降低了背景荧光干扰。

第三代PacBio测序技术的测序原理和读长针对PacBio单分⼦测序——第三代测序技术的测序原理和读长DNA基因测序技术从上世纪70年代起，历经三代技术后，⽬前已发展成为⼀项相对成熟的⽣物产业。

测序技术的应⽤也扩展到了⽣物、医学、制药、健康、农林、园艺、花卉、环保、法医等许多领域，并成为⼀项与我们⾐⾷住⾏密切相关的⾼技术产业。

据最新统计，2012年全球基因测序市场的产值已超过百亿，按最近⼏年增长速度，预计2017年市场产值将加倍。

因此可以说，基因测序在我国⽣物科技领域具有⾮常重要的战略意义。

“第三代测序技术”的研发已有近⼗年时间，商业化的第三代测序仪上市也有三年,⽬前，国内对Pacbio单分⼦测序研究也有了最新进展：⼀，中科院药植所采⽤PacBio单分⼦测序揭⽰丹参叶绿体DNA修饰之间复杂的相互作⽤：编码及⾮编码RNA的表达2014年6⽉10⽇，中科院药⽤植物研究所（IMPLAD）刘昶团队在《PLOS ONE》杂志上发表了利⽤PacBio测序技术揭⽰丹参（Salvia miltiorrhiza）叶绿体DNA修饰之间复杂相互作⽤的相关⽂章，该⽂章报道了丹参叶绿体中编码及⾮编码RNA的表达情况。

这也是国内PacBio第三代测序⽤户在国际性杂志发表的第⼀篇⽂章。

丹参是最⼴泛使⽤的药⽤植物之⼀。

作为基于叶绿体基因⼯程⼿段开发使丹参活性成分过表达⽅法的第⼀步，该研究团队从基因组，转录组，和碱基修饰三⽅⾯对丹参叶绿体进⾏了分析。

先从新鲜叶⽚中提取总基因组DNA和RNA，然后进⾏链特异性RNA测序和PacBio 公司的单分⼦实时（Single-Molecule Real-Time, SMRT）测序分析。

实验先是将RNA测序得到的reads mapping到基因组，使该研究⼩组确定了80个蛋⽩质编码基因的相对表达⽔平。

此外，还明确了19个多顺反⼦转录单元和136个假定反义和基因间⾮编码RNA（ncRNA）基因。

第三代测序技术的原理和应用第一部分：引言随着基因组学研究的快速发展，测序技术也在不断进步。

第一代测序技术（Sanger测序）和第二代测序技术（高通量测序）已经取得了重大突破，但仍存在一些限制。

为了克服这些限制，第三代测序技术应运而生。

本文将介绍第三代测序技术的原理和应用。

第二部分：第三代测序技术的原理第三代测序技术是一种新型的高通量测序技术，其原理与传统的测序技术有所不同。

第三代测序技术的原理主要包括以下几个方面：1.基于单分子扩增：第三代测序技术采用单分子扩增的方法，不需要PCR过程和文库构建步骤，从而避免了样本损失和引入偏差。

2.实时测序：第三代测序技术实时监测DNA合成过程，可以直接检测每个碱基的加入，无需后续的显著化和检测步骤。

这大大提高了测序速度，并降低了成本。

3.长读长读长读：相比第二代测序技术生成的短读长度，第三代测序技术可以产生更长的读长，一次读取几千个碱基。

这种特点对于重复序列的分析、基因组结构建模和个体基因组描绘等研究非常有用。

第三部分：第三代测序技术的应用第三代测序技术广泛应用于不同领域的基因组学研究。

以下是第三代测序技术的几个重要应用方面：1.药物研发：第三代测序技术可以快速高效地获得个体基因组序列信息，帮助科学家识别药物靶点，推动个体化药物研发。

2.疾病研究：通过第三代测序技术，我们可以快速识别临床样本中的致病基因，深入研究疾病的遗传基础，并帮助制定个性化治疗方案。

3.农业研究：第三代测序技术可以高通量地鉴定和分析作物、家畜和其它农业生物的基因组信息，有助于优化农业生产和提高农作物品质。

4.环境研究：第三代测序技术可以帮助科学家研究环境中的微生物群落，揭示微生物对环境变化的响应，从而提供更好的环境保护策略。

5.进化研究：第三代测序技术可以提供大量的遗传信息，促进生物的进化研究，深入了解物种的起源、演化和适应性变化等问题。

第四部分：结论第三代测序技术以其独特的原理和广泛的应用前景吸引了基因组学研究领域的关注。

三代测序原理及步骤
三代测序是一种新型的高通量测序技术，与传统的二代测序技术相比，具有更快的速度、更高的分辨率和更低的成本。

三代测序的原理主要分为三个步骤：预处理、测序和数据分析。

1. 预处理：样本DNA需要进行预处理，包括DNA提取、文
库构建和引物连接等。

其中文库构建过程中，DNA分子被打
断成较小的片段，并与适当的引物序列连接。

这个过程是为了克服DNA分子长度和连续读取长读长的难题。

2. 测序：三代测序主要依赖于单分子测序技术。

这种技术可以直接读取单个DNA分子的序列信息，避免了文库扩增和PCR
等步骤对序列的干扰。

常用的三代测序技术包括SMRT （Single Molecule Real-Time）测序、Nanopore测序等。

其中，SMRT测序技术利用圆盘形态的DNA多聚酶在放射线观测下
合成DNA，观察到DNA的添加情况，从而得到DNA的序列
信息；Nanopore测序技术则利用微小的纳米孔通过测量DNA
分子通过孔的电导变化来分析DNA序列。

3. 数据分析：三代测序产生的数据量大、复杂，需要进行数据预处理、序列比对、变异检测、基因组组装等一系列的数据分析步骤。

这些步骤主要包括数据清洗、基因组或转录组的组装、SNP分析、结构变异分析等。

总体来说，三代测序的步骤包括预处理、测序和数据分析。

通
过这些步骤，可以高效地获得高质量的基因组或转录组序列，并进一步分析相关的生物学功能和基因表达调控等信息。

p i c b i o三代测序原理The manuscript can be freely edited and modified三代测序之P a c B i o S M R T技术全解析2017-05-1111:29来源:气温回升;天气渐暖;花儿开了一簇又一簇~在这美好的季节里;我们准备聊点新话题..今天小编要来和你分享：PacBioSMRT测序那些事儿~测序技术在近几年中又有里程碑的发展;PacificBiosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台;让三代测序正式走入我们的视线..与前两代相比;第三代测序有什么不同呢今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBioSMRT测序平台..PacBioSMRT测序原理PacificBiosciences公司研发的单分子实时测序系统SingleMoleculeRealTime;SMRT应用了边合成边测序的原理;并以SMRT芯片为测序载体..基本原理如下：聚合酶捕获文库DNA序列;锚定在零模波导孔底部4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部荧光dNTP被激光照射;发出荧光;检测荧光荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配;在酶的作用下合成一个碱基统计荧光信号存在时间长短;区分匹配碱基与游离碱基;获得DNA序列酶反应过程中;一方面使链延伸;另一方面使dNTP上的荧光基团脱落聚合反应持续进行;测序同时持续进行PacBioSMRT测序原理PacBioSMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔zero-modewaveguides;ZMWs和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上Phospholinkednucleotides..SMRTCell含有纳米级的零模波导孔;每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序;并实时检测插入碱基的荧光信号..ZMW是一个直径只有10~50nm的孔;当激光打在ZMW底部时;只能照亮很小的区域;DNA聚合酶就被固定在这个区域..只有在这个区域内;碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到;大幅地降低了背景荧光干扰.. SMRTCell和ZMWs将荧光染料标记在核苷酸的磷酸链而不是碱基上;当核苷酸掺入到新生的链中;标记基团就会自动脱落;减少了DNA合成的空间位阻;维持DNA链连续合成;延长了测序读长..SMRT测序最大限度地保持了聚合酶的活性;是最接近天然状态的聚合酶反应体系..荧光标记在焦磷酸链上的核苷酸PacBioSMRT测序送样要求PacBioSMRT测序建库流程DNA打断之后;经过末端修复、接头连接、片段筛选、杂交测序引物和聚合酶绑定;即可出库准备上机测序;建库过程无PCR反应..PacBioSMRT建库流程PacBioSMRT技术特点PacBioSMRT技术有两种测序平台;RSⅡ和Sequel;应该如何选择小编已将二者的对比表准备好啦~表3RSⅡ和Sequel测序平台比较Sequel平台与RSII平台相比具有很大的优势;Sequel平台测序通量高、单Gb数据成本低、周期短..1.第三代基因测序技术又被为"SingleMoleculeRealTimeSMRT DNASequencing"单分子实时DNA测序技术;该方法基于纳米孔的单分子读取技术;不需要扩增即可快速读取序列..目前;PacificBiosciences公司已经成功推出了商业化的第三代测序仪PacB ioRS平台;使得第三代测序正式走入人们的视角..PacBioRSII是PacificBiosciences公司研发的单分子实时测序系统SingleMolecu leRealTime;SMRT;其专利的SMRTCell含有15;000个纳米级的零模波导孔zero-mod ewaveguides;ZMWs;每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序;并实时检测插入碱基的荧光信号..2.2技术特点ü 利用测序过程聚合酶反应的动力学变化;首次实现对碱基修饰进行直接测序..ü 超长的读长：平均测序读长能达到7;000-8;000bp;最长读长能达到3;0000bp；ü 准确率高：对基因组组装和基因组变异检测;可以最多达到99.999%的准确率；ü 敏感性强：可以检测频率在0.1%的minorvariants；ü 无PCR扩增偏好性：样本不需要进行PCR扩增;避免了覆盖度不均一和PCRartif acts；ü 最小的GC偏好性GCbias：在极端高GC和极端低GC区域;可以轻松测定;从而保证序列的均匀覆盖度..3.3数据产出试剂盒平均读长数据量/SMRTCellP4-C2Chemistry 5.5-6Kb ~200MbP5-C3Chemistry 8-10Kb ~250Mb4.4应用领域1全基因组denovo测序与二代测序最高不超过1kb的读长相比;PacBioRSII的长读长将有效解决短序列数据的拼接难题..同时;与二代测序的模板样品需要扩增相比;PacBioRSII无需扩增可直接对单个分子进行测序;有效避免了PCR扩增偏好性和GC偏好性;PacBioRSII可轻松跨越GC含量异常过高或过低及高度序列重复的区域;实现序列覆盖的完整性和均一性..2基因组草图的优化或基因组完成图绘制对前期已开展测序的动植物、微生物基因组结合三代长读长测序数据进行完善和提升..针对前期已经开展全基因组测序;获得基因组草图的动植物、微生物等;可以结合PacBioRSII平台长读长reads进行补充;从而快速获得前期没有测得的信息及提升基因组的完整度..另外还可以针对前期没有检测获得的结构变异信息structural -variationevents、串联重复序列信息tandemduplication、易位信息Inversion 等..尤其在微生物基因组完成图的绘制中;可在一天之内、成本低于$1;000即可将基因组完善获得0gapcontig..3全长转录本测序PacBioRSII的长读长可实现全长转录本测序;并使基因可变剪接形式的识别成为可能;因此可以对新基因及其isoform进行更全面的研究..同时;长读长不再需要对RN A-Seq的reads进行组装;因此可以更完整的对基因模型和转录的基因进行更全面的注释;用以改进参考基因组中的基因注释信息..4宏基因组测序长读长reads能够更为精准地鉴定水体、土壤、肠道等生境中微生物的种类的鉴定;能够更加快捷地获得更多微生物种的全基因组序列..516SrDNA全长测序PacBioRSII的平均读长为8-10Kb;而16SrDNA长度大约为1540bp;因此结合该平台测序可以成功测序获得16S的全长序列..6细胞器基因组测序叶绿体基因组和线粒体基因组序列都包含重复序列、反向重复序列等复杂结构;Pac BioRSII的长读长可直接跨越这些区域获得这些细胞器的全基因组序列信息等;基因组组装不依赖于是否有近缘物种的线粒体和叶绿体基因组信息等、重测序能够检测到全面的SNPs及indel信息..7全基因组重测序&稀有变异鉴定PacBioRSII长读长测序reads无GC偏号;能够全面获得基因组的遗传变异;包括SN Ps的鉴定到CNV、SV结构变异等;可运用至人类癌症基因组重测序等..PacBioRSII 平台测序周期在10hours小时即可完成测序;可应用至需要快速反馈的临床检测中;如细菌感染疾病中细菌的鉴定、病毒的鉴定等;取样开展重测序和目前已有的细菌、病毒基因组数据库进行比对鉴定即可..8表观遗传学PacBioRSII利用测序过程聚合酶反应的动力学变化;首次实现对碱基修饰进行直接测序..当碱基有额外修饰时;DNA聚合酶的合成速度会减慢;对应的信号会被检测出来..每种碱基修饰事件都会使聚合酶的“停顿模式”PacBioRSII产生微小差异;最终反映到荧光脉冲信号的间隔上..除了甲基化修饰;还可以检测5-hC、5-hmU、5-h U、1-mA、6-mA、8-oxoA、BPDE、6-mT、6-mG等碱基修饰;甚至可以鉴别传统亚硫酸氢盐测序法无法区分的甲基化修饰和羟甲基化修饰..PacBio平台可以在测序的同时即可检测表观遗传学修饰信息;只需对测序数据选择合适的软件即可分析碱基修饰信息..5.5。

图1：测序技术的发展历程生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。

以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。

第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。

自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。

研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。

在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。

这个网址为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。

值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。

其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。

图2：Sanger法测序原理第二代测序技术总的说来，第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。

三代基因组测序技术简介及其原理整理第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法以及1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）。

1977年，桑格测定了第一个基因组序列——噬菌体X174，全长5375个碱基。

自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。

研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。

在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。

Sanger法原理：1）在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP（N=A/G/T/ C）加到引物的3’- OH末端，合成出新的互补链。

在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP，在互补链在DNA聚合酶作用下延伸时，一旦连接上ddNTP，由于双脱氧核糖的2’和3’都不含羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键而终止反应，随即形成一系列不同长度的、以同样引物为起始、以同一碱基终止的短片段混合物。

2）双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。

化学裂解法原理：与Sanger法类似，将DNA模板分成4个反应。

在每个反应中，先在模板5’端进行放射性标记，再加入能特异性在其中一种碱基处切开DNA的化学试剂。

反应进行时，平均一个DNA分子只在随机位点产生一次裂解。

接着，通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。

第二代测序技术第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。

因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。

经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。

第三代测序技术原理
第三代测序技术是指最新一代的高通量测序技术，它与第一代和第二代测序技
术相比，具有更高的测序速度、更低的成本和更高的准确性。

第三代测序技术的原理主要包括单分子测序、纳米孔测序和合成孔测序等多种技术。

本文将重点介绍第三代测序技术的原理及其应用。

首先，单分子测序是第三代测序技术的核心原理之一。

它通过直接测序单个DNA分子，避免了PCR扩增和文库构建等步骤，大大简化了测序流程。

单分子测
序技术主要包括荧光基团标记、逐个核苷酸加入和荧光检测等步骤。

这种原理使得第三代测序技术在测序速度和准确性上有了质的飞跃。

其次，纳米孔测序是第三代测序技术的另一重要原理。

它利用纳米孔将DNA
分子拉伸成单链，然后通过电压驱动DNA分子逐个通过纳米孔，通过测量电流信
号来识别不同的核苷酸。

这种原理使得第三代测序技术可以实现长读长，大大提高了测序的准确性和覆盖度。

最后，合成孔测序是第三代测序技术的又一重要原理。

它利用合成纳米结构来
实现单分子测序，通过控制合成孔的尺寸和形状，可以实现对不同长度的DNA分
子进行测序。

这种原理使得第三代测序技术可以实现更高的测序速度和更低的成本，为基因组学研究提供了强大的工具。

总的来说，第三代测序技术的原理主要包括单分子测序、纳米孔测序和合成孔
测序等多种技术，它们共同推动了测序技术的发展，为基因组学研究提供了强大的工具。

随着第三代测序技术的不断进步，相信它将在生命科学研究和临床诊断中发挥越来越重要的作用。

p i c b i o三代测序原理集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#三代测序之PacBio SMRT技术全解析2017-05-11 11:29 来源:气温回升，天气渐暖，花儿开了一簇又一簇~在这美好的季节里，我们准备聊点新话题。

今天小编要来和你分享：PacBio SMRT测序那些事儿~测序技术在近几年中又有里程碑的发展，Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。

与前两代相比，第三代测序有什么不同呢今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBio SMRT 测序平台。

PacBio SMRT测序原理Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。

基本原理如下：聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落聚合反应持续进行，测序同时持续进行PacBio SMRT测序原理PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。

SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。

ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。