培养基配制和灭菌方法验证

无菌检查方法验证：取本品，分别加灭菌注射用水 1ml 溶解，采用薄膜过滤法依法检查(中国药典 2022 年版二部附录Ⅺ H )，应符合规定。

菌液制备： 10 倍稀释法培养基 营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基硫乙醇酸盐培养基改良马丁培养基改良马丁琼脂斜面 培养基菌悬液制备计数结果菌种 代数 稀释级 菌落数(cfu/ml )枯草芽孢杆菌 4 10-6 61金黄色葡萄球菌 4 10-7 89大肠埃希菌 4 10-6 78生孢梭菌 4 10-6 67白色念珠菌 4 10-7 83黑曲霉菌 4 10-4 401、供试品处理将供试品去掉铝塑盖，外表面用75%酒精全面消毒，然后向每支样品中注 入 1.0ml0.1%的蛋白胨灭菌溶液，备用。

2、检查阳性对照： 将等量的试验菌直接加入到液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液 体培养基管中，在相应的温度下培养。

液体硫乙醇酸盐培养基管在 30-35℃下培菌种枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 大肠埃希菌 CMCC(B)44102生孢梭菌 CMCC(B)64941白色念珠菌 CMCC(F)98001黑曲霉菌 CMCC(F)98003菌悬液制备用 0.9% 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌少于 100cfu (菌落行程单 位)的菌悬液加入 5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将 孢子洗脱，再同上制成每 ml 含菌 小于 100cfu 的菌悬液养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。

观察记录。

阴性对照：将灭菌的液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液体培养基管直接放在相应的温度下培养。

液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。

观察记录。

样品 (薄膜过滤法)：每种实验菌取10 支处理好的供试品溶液，将溶液合并后加入制备好的菌悬液1ml，用0.1%的蛋白胨灭菌溶液稀释至100ml，按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，将其分为3 等份，分别置于含硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作为阳性对照用。

1. 稀释液的制作磷酸盐缓冲稀释液贮存液：磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g蒸馏水 500mL用大约175 mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2（图1-1、1-2），用蒸馏水稀释至1000 mL后贮存于冰箱。

稀释液：用蒸馏水稀释1.25mL贮存液至1000mL,分装于合适容器,121℃高压灭菌15min。

1-1 1-22. 培养基制作①计算出所需数量，用电子称、称量纸、药勺来称取。

②放入比所用蒸馏水大的烧瓶中，使之充分混匀于蒸馏水后加热溶解并煮沸。

※备注：即使是同一培养基，各个厂家的配制方法多少有些不同，所以一定要充分参照培养基上的说明。

2.1 倾注培养培养基：加温溶解（高压灭菌）保存使用时溶解倾注●平板计数琼脂等：高压灭菌后保存，使用时加温溶解。

●去氧胆酸盐琼脂培养基：使用时将培养基粉末加温溶解。

※备注：倾注培养时，向培养基分注的步骤参照下述的注意事项①样液稀释以及从接种到培养基混合完毕，最好在15分钟以内完成。

②每个平皿的分注量约15-20ml。

分注后将平皿倾斜和旋转使之充分混合，但要注意不要让培养基从平皿内溢出，且不要粘附在平皿壁和盖上。

③分注时三角烧瓶挂有培养基滴时，下一次分注的培养基可能被烧瓶外壁的细菌污染，所以要用酒精棉擦拭，再将瓶口用火焰灭菌。

2.2 平板培养基：平板培养基是将溶解后的培养基分注15-20ml到无菌平皿里，使之凝固。

●TCBS琼脂培养基、DHL琼脂培养基：加温溶解后，分注、凝固、干燥表面。

为了防止沉淀的发生，加温溶解后要充分混匀（注意不要起泡）。

●EMB琼脂培养基：高压灭菌后，分注、凝固、干燥表面。

●卵黄甘露醇高盐琼脂培养基：将鸡蛋放在95%酒精中浸泡1小时左右，用酒精棉（纱布）擦拭蛋壳表面，打开鸡蛋取出卵黄。

加入经高压灭菌后冷却到55-60℃培养基里（6%卵黄）搅拌摇匀凝固后干燥表面（搅拌时不要起泡）。

若培养基温度过高，卵黄凝固，过低则培养基分注时开始结块，所以操作要迅速。

培养基的制备与灭菌实验报告一、引言在微生物学研究中，培养基的制备与灭菌是非常重要的步骤。

培养基是供养微生物生长和繁殖所必需的营养物质的混合物，而灭菌则是为了消除其中的有害微生物，保证培养基的纯净度。

本实验旨在探讨培养基的制备与灭菌的方法与步骤，以及其对微生物培养的影响。

二、培养基的制备2.1 选择培养基成分培养基的成分根据所需培养的微生物种类和目的而定，常见的成分包括碳源、氮源、无机盐、生长因子等。

在制备培养基之前，需要明确所需微生物的营养需求，选择合适的成分。

2.2 配制培养基根据所选的成分和配方，按照一定比例将各种成分溶解在适当的溶剂中，常见的溶剂包括蒸馏水和生理盐水。

注意溶解顺序和温度，保证各种成分充分溶解。

2.3 调节pH值微生物对pH值的要求各不相同，因此在制备培养基时需要调节pH值。

使用酸碱溶液逐滴加入培养基中，同时使用pH试纸或pH计检测pH值，直到达到所需的范围。

2.4 灭菌前的处理在灭菌之前，需要对培养基进行一些处理，包括过滤、加热和冷却等。

过滤可以去除其中的固体杂质和大颗粒微生物。

加热可以杀灭其中的有害微生物，常用的方法包括高温灭菌和压力灭菌。

冷却后的培养基可以用于微生物的培养。

三、灭菌实验3.1 高温灭菌高温灭菌是常用的灭菌方法之一，其原理是利用高温杀灭微生物。

将配制好的培养基倒入培养瓶中，盖上瓶盖，放入高温灭菌器中。

设置合适的温度和时间，一般为121℃，15-20分钟。

高温灭菌后的培养基可以用于无菌条件下的微生物培养。

3.2 压力灭菌压力灭菌是一种利用高温和高压杀灭微生物的方法。

将配制好的培养基倒入培养瓶中，盖上瓶盖，放入压力灭菌器中。

设置合适的温度和压力，一般为121℃，15-20分钟。

压力灭菌后的培养基可以用于无菌条件下的微生物培养。

3.3 灭菌效果验证灭菌后的培养基需要进行灭菌效果验证，以确保其中没有活菌存在。

常用的方法包括接种试验和平板计数法。

接种试验是将灭菌后的培养基接种到无菌平板上，观察是否有菌落生长。

hanks配制与灭菌实验报告Hanks配制与灭菌实验报告摘要：本实验旨在通过配制Hanks液体培养基以及进行灭菌实验，验证Hanks液体培养基的配制方法的准确性和灭菌方法的有效性。

实验结果表明，配制的Hanks液体培养基符合要求，能够支持细胞生长和繁殖；而经过灭菌处理后的培养基能够杀灭细菌和其他微生物的生长，确保实验的无菌性。

1. 引言Hanks液体培养基是一种常用的细胞培养基，广泛用于细胞培养、细胞实验和细胞学研究中。

为了保证培养基的品质和无菌性，正确的配制方法和灭菌处理是非常重要的。

2. Hanks液体培养基的配制方法Hanks液体培养基的配制方法如下：1) 准备所需材料：Hanks盐、葡萄糖、无菌水。

2) 称取适量Hanks盐，并加入适量无菌水中溶解。

3) 加入适量葡萄糖，继续搅拌溶解。

4) 调整溶液的pH值至7.4左右。

5) 加入适量的无菌水，使溶液体积达到所需的总体积。

6) 过滤并分装至无菌培养瓶中。

3. Hanks液体培养基的质量控制为了确保配制的Hanks液体培养基的质量，我们需要进行质量控制。

主要包括以下几个方面：1) pH值的测定：使用pH计测定Hanks液体培养基的pH值，确保其在7.2-7.6之间。

2) 游离氨基酸测定：通过游离氨基酸测定方法，检测Hanks液体培养基中游离氨基酸的浓度，确保其符合要求。

3) 空白对照培养：将配制好的Hanks液体培养基分装至无菌培养瓶中，进行空白对照培养，观察是否有微生物生长。

4. Hanks液体培养基的灭菌方法为了确保Hanks液体培养基的无菌性，我们需要进行灭菌处理。

常用的灭菌方法有以下几种：1) 高温灭菌：将Hanks液体培养基装入无菌容器中，放入高压灭菌锅中进行高温高压灭菌处理。

2) 过滤灭菌：使用无菌滤器将Hanks液体培养基过滤，去除其中的微生物。

3) 紫外线灭菌：将Hanks液体培养基装入无菌培养瓶中，置于紫外线灭菌器中进行紫外线照射。

7.4.1 培养基配制及器具的灭菌操作人：复核人：日期：7.4.1.2 除菌过滤前TSB培养基微生物限度检验检查依据：微生物检查参照《微生物限度测定标准操作规程》（QC117）,采用薄膜过滤法.营养琼脂培养基的配制：称取营养琼脂培养基干粉（中检所监制，批号：）g，加纯化水ml加热溶解。

检验用平皿的准备：准备直径90 mm的带盖玻璃平皿套，用牛皮纸包裹。

灭菌：以上培养基和物品统一灭菌，灭菌条件：121°C, 30 min。

操作人：复核人：日期：玫瑰红钠琼脂培养基的配制：称取玫瑰红钠琼脂培养基干粉（中检所生产，批号：）g，加纯化水ml，加热溶解。

检验用平皿的准备：准备直径90 mm的带盖玻璃平皿套，用牛皮纸包裹。

灭菌：以上培养基和物品统一灭菌，灭菌条件：121°C, 30 min。

操作人：复核人：日期：Rodac碟培养基的的配制：称取胰酪胨大豆肉汤培养基干粉（上海中科，批号：）g ，卵磷脂（国药集团，批号：）g，吐温80（批号：）g，加入纯化水ml,微温使其溶解，用1.0M的氢氧化钠调节pH值使灭菌后为7.3±0.2，加入琼脂g，加热使其溶解。

灭菌：灭菌条件：121°C, 30 min。

Rodac碟的批号：，生产厂商：，数量：。

操作人：复核人：日期：取样用试管的准备：准备10 ml试管支，内装2 ml生理盐水和一根医用棉签，管口用医用纱布包裹的脱脂棉塞塞住，再用牛皮纸封口。

灭菌：灭菌条件：121°C, 30 min。

操作人：复核人：日期：检查人：复核人：检查日期：报告日期：7.4.1.4 除菌过滤器的膜完整性检测操作人：复核人：日期：日期：操作人：复核人：附灭菌的温度打印记录操作人：复核人：日期：操作人：复核人：日期：检查人：复核人：日期：7.4.2灌装环境的清洁、消毒效果检查及人员着装检查7.4.2.1操作人员微生物监控进入无菌区的人员按照《洁净区人员更衣标准操作规程》（MF149）进行更衣，操作结束后，按照《灌装无菌区人员更衣确认程序》（QA057）对操作者的左手、右手、口罩、胸口处、帽兜额头处、左臂、右臂等部位的微生物数量进行监测。

培养基配制和灭菌方法验证一、培养基配制培养基是一种供养菌落生长的基础物质，可以提供细菌所需的营养物质和环境条件。

培养基的配制是非常关键的步骤，如果配制不当会影响到培养菌落的生长和观察结果的准确性。

1.1固体培养基的配制固体培养基是通过在液体培养基中加入凝固剂（如琼脂）使其凝固，形成固体的培养基。

固体培养基可以用来分离纯菌、观察菌落特征以及保存菌种。

配制固体培养基的主要步骤如下：步骤一：准备配方根据不同的菌种需要，选择适当的培养基配方。

常见的培养基如营养琼脂(NA)、大肠杆菌琼脂(MacConkey)、血琼脂(Blood Agar)等。

步骤二：计量和溶解根据配方，按照适当的比例称量需要的成分，并加入适量的蒸馏水。

然后，将成分加热溶解，直至成分完全溶解。

步骤三：凝固将已溶解的培养基液倒入培养皿或试管中，装入适量的培养基液。

温度下降至约50℃时，可以添加相应的抗生素(如青霉素)等，促进无菌条件的保持。

待培养基液凝固后，即可进行灭菌处理。

1.2液体培养基的配制液体培养基主要用于培养大量的菌落或进行革兰氏染色等实验。

液体培养基的配制步骤与固体培养基配制类似，只是不需要加入凝固剂。

为了确保培养基无菌，常常需要进行灭菌处理。

2.1常见的灭菌方法常见的灭菌方法主要包括以下几种：1)高压灭菌法：利用高温高压的环境，将培养基中的微生物逐一被杀死。

常用的高压灭菌法是使用高压蒸汽灭菌器进行处理。

2)紫外线灭菌法：使用紫外线灭菌器，将细菌暴露在紫外线下，排除细菌生长的可能性。

3)化学灭菌法：使用化学物质，如乙醛、次氯酸钠等，浸泡培养基或在培养基上喷雾，杀灭细菌。

2.2检验培养基灭菌效果的验证方法验证培养基灭菌效果的方法主要有两种：物理指标法和培养法。

1)物理指标法：即通过检测物理指标，如温度、压力等，来验证灭菌效果。

例如，在培养基中放置一个温度计，通过测量温度变化来判断灭菌的有效性。

2)培养法：即将培养基在灭菌前后进行对照培养，观察菌落的生长情况，或通过采样培养基，进行菌种分离和鉴定。

微生物限度方法学验证 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。

二、菌种、培养基及稀释液表2培养基表3对照用培养基表4试剂稀释液：（1）缓冲液取L磷酸二氢钾溶液250ml,加L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。

（2）%无菌氯化钠溶液取氯化钠，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。

（3）％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯80 ，用％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。

（4）靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。

三、菌液的制备1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。

上述培养物用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50～100cfu的孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。

2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。

用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu 的菌悬液。