微生物实验设计-病原性球菌的鉴定

病原性球菌及检验一、葡萄球菌属（一）生物学特性1.形态与结构本属菌革兰染色阳性，呈圆球形，直径0.5～1.5μm，不规则成堆排列，形似葡萄串状，在脓汁、肉浸液培养物中，可见单个，成对或短链排列。

无鞭毛和芽胞，某些菌株能形成荚膜。

2.培养特性需氧或兼性厌氧，营养要求不高，通常在肉浸液及肉浸液琼脂或加入血液的培养基上生长良好。

最适pH为7.4，最适温度为35～37℃。

在普通琼脂平板上经35℃24～48h培养，可形成圆形、凸起、表面光滑湿润、边缘整齐并且不透明的菌落，直径为2～3mm。

可产生不同的脂溶性色素，如金黄色、白色、柠檬色色素。

在血琼脂平板上，几乎所有的葡萄球菌可产生α、β、γ和δ溶血素。

在液体培养基（普通肉浸液）中生长迅速呈均匀混浊状。

3.生化反应本属菌触酶试验阳性，对糖的发酵反应不规则，多数能分解葡萄糖、麦芽糖及蔗糖，产酸不产气。

多数致病性葡萄球菌能分解甘露醇产酸、液化明胶和产生血浆凝固酶。

4.抗原葡萄球菌水解后，用沉淀法可获得两种抗原，即蛋白抗原和多糖抗原。

（1）蛋白抗原：为完全抗原，有种属特异性，无型特异性。

存在于葡萄球菌的表面，结合在细胞壁的粘肽部分，具有抗吞噬作用，称葡萄球菌A蛋白。

（2）多糖抗原：是半抗原，具有型特异性，有三种：①A型多糖抗原；②B型多糖抗原；③C型多糖抗原。

5.分类（1）《伯杰系统细菌学手册》（1986）据DNA相关性表型特征等将葡萄球菌分为19个种。

继之，各国学者又相继从人和动物中检出数种凝固酶阴性葡萄球菌新种，共27种。

（2）古典分类法：根据其在固体培养基上产生的不同色素分为金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和柠檬色葡萄球菌。

1965年，国际葡萄球菌和微球菌分类委员会将葡萄球菌分为凝固酶阳性葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）。

CNS常包括表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌。

凝固酶阳性葡萄球菌包括金黄色葡萄球菌、中间型葡萄球菌和家畜葡萄球菌。

6.抵抗力对理化因素抵抗力强，耐热、耐干燥、耐高盐，是抵抗力最强的无芽胞细菌。

医学微生物学实验设计姓名：***学号：**********班级：10级临床十一班病原性球菌的鉴定姚淑宝（石河子大学医学院石河子832000）摘要：球菌是细菌中的一大类，其中对人类有致病性的球菌包括分属葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属和奈瑟菌属的一些细菌。

本次实验设计以掌握病原性球菌的形态和培养特性，熟悉病原性球菌的分离和鉴定程序为目的。

对脓汁中的葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌进行鉴别。

一、鉴定思想本次鉴定试验，先将脓汁标本直接镜检，再分离培养，观察镜下菌体的形态特征以及形成菌落的形态特征确定待测菌的菌属。

然后，对可疑菌落纯培养，通过不同生化反应对同一菌属中的不同细菌进行区别。

（具体见图1-1）分离纯化葡萄球菌属奈瑟菌属血浆凝固酶试验胆汁溶菌试验麦芽糖发酵试验二、鉴定方法（一）直接镜检将脓汁标本涂片进行革兰染色，然后在显微镜下观察细菌菌体的形态、排列、染色性并作出初步诊断。

葡萄球菌属：革兰染色阳性，球形，无芽胞、无鞭毛，呈葡萄串状排列。

链球菌属：革兰染色阳性，球形或椭圆形，无芽胞、无鞭毛，呈链状或成双排列。

肺炎链球菌具有荚膜双球的典型形态。

奈瑟菌属：革兰染色阴性，无芽胞、无鞭毛，常成双排列。

脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌大多于中性粒细胞内外分布。

通过直接镜检可以确定脓汁标本中细菌的菌属。

在确定菌属的基础下再对脓汁标本中的细菌分离纯化，然后挑取可以菌落通过再次涂片染色镜检、致病物质检查、生化反应、血清学鉴定等方法进行菌属内的区别。

（二）分离纯化用分区划线法将脓汁中的细菌接种在血琼脂平板培养基或巧克力色培养基上并在5%二氧化碳、37℃的条件下培养18~48小时。

观察菌落的形态。

葡萄球菌属：在血平板上形成圆形凸起、表面光滑、润湿、边缘整齐、不透明的菌落。

形成金黄色、白色和柠檬色脂溶性色素，多数金黄色葡萄球菌菌落周围有β溶血现象。

链球菌属：在血平板上形成灰白色、圆形凸起、半透明或不半透明的细小菌落。

病原性球菌检查（二） 实验目的1掌握病原性球菌培养物性状。

2掌握血浆凝固酶试验原理方法。

3掌握密集接种法，熟悉药物（如抗生素）抑菌杀菌原理并了解纸片法、试管法的试验方法及应用。

实验材料1、菌种：金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌6~8小时肉汤培养物。

2、培养基：普通琼脂平板、肉汤培养基。

3、药品：青霉素溶液（50u/ml ）、抗生素滤纸片。

4、器具：恒温箱、接种环、酒精灯、试管、无菌棉拭、无菌小镊子、无菌吸管、玻片、血浆。

实验内容一、病原性球菌的培养物观察肉眼观察葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌在血琼脂平板上的生长情况及脑膜炎球菌在巧克力（色）琼脂平板上的生长情况，比较菌落的形态特征。

（1）葡萄球菌：在血琼脂平板上培养18~24小时，形成圆表凸起，表面光滑、湿润、边缘整齐，菌落不透明。

金黄色葡萄球菌金黄色，可产生透明溶血环；表皮葡萄球菌白色、无溶血环，腐生葡萄球菌白色或柠檬色，无溶血环。

（2）链球菌：在血琼脂平板上培养18~24小时，形成灰白色、圆形凸起、半透明或不透明的细小菌落。

甲型溶血性链球菌不完全溶血，在菌落周围形成草绿色溶血环，乙型溶血性链球菌完全溶血、形成透明溶血环，丙型链球菌不发生形成圆形、光滑隆起透明似露珠的菌落。

在血琼脂平板上不发生溶血溶血、无溶血环。

（3）肺炎球菌：血琼脂平板上培养18~24小时，形成细小、灰白色、扁平、半透明的菌落，周围有草绿色溶血环，其与甲型溶血性链球菌相似，培养2~3天后，因菌体发生自溶，菌落中央下陷呈“脐状”。

（4）脑膜炎球菌：在巧克力（色）琼脂平板上加5%CO237℃培养24小时， 形成圆形光滑隆起透明似露珠的菌落，无溶血环。

二、血浆凝固酶试验1、原理致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使人或动物血浆发生凝固，因此，测定血浆凝固酶的有无是鉴定葡萄球菌致病性的重要依据。

2、方法及结果（1） 玻片法：①取干净玻片一块，用记号笔将玻片划成两格，其中一格加2接种环的生理盐水，另一格加1：2人血浆（或免血浆）1接种环。

病原性球菌的检验一、葡萄球菌属Staphylococcus⏹广泛存在于自然界，多数是不致病的腐物寄生菌。

⏹致病性葡萄球菌可引起化脓性炎症、败血症、食物中毒等。

分类与分型1）金黄色葡萄球菌(S. aureus)：多数致病。

（2）表皮葡萄球菌(S. epidermidis)：偶可致病。

（3）腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)：不致病。

（4）致病性菌株能产生黄色或柠檬色素。

（5）多数金黄色葡萄球菌可被相应噬菌体裂解，表皮葡萄球菌不敏感。

金黄色葡萄球菌的致病性⏹用噬菌体可将金葡萄菌分为4群23个型。

⏹肠毒素型食物中毒由Ⅲ和Ⅳ群金葡萄菌引起，Ⅱ群菌对抗生素产生耐药性的速度比Ⅰ和Ⅳ群缓慢很多。

⏹造成医院感染严重流行的是Ⅰ群中的52、52A、80和81型菌株。

⏹引起疱疹性和剥脱性皮炎的菌株经常是Ⅱ群71型。

金黄色葡萄球菌的流行病学⏹作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。

因而，食品受其污染的机会很多。

金黄色葡萄球菌及其检验⏹革兰氏阳性球状，排列呈葡萄串状。

无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，个别形成荚膜。

致病性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）菌体较小、约0.5~1um., 普通0.4~1.2um。

培养及生化特性1.在普通培养基上生长良好（需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃、pH7.4 ，对营养要求不高，加少量葡萄糖或血液生长更旺盛。

），在麦康凯琼脂平板不生长。

2. 血平板上生长更佳，致病菌株β溶血3. 产生金黄色色素4. 高度耐盐: 可在7.5~15%NaCl肉汤中生长。

5. 分解葡、乳、麦、蔗糖，产酸不产气，触酶阳性，致病菌株能分解甘露醇。

6. 金黄色葡萄球菌能产生的毒素和酶（致病因素P149）1）溶血毒素2）杀白细胞素3）血浆凝固酶：区分葡萄球菌是否具有致病性的重要标志。

4）脱氧核糖核酸酶：5）肠毒素6）溶纤维蛋白酶7）透明质酸酶抗原性1. 多糖抗原：具有群特异性，存在于细胞壁，借此可分群。

病原性球菌的鉴定流程一、样本采集。

这是鉴定病原性球菌的第一步啦。

就像要找到小坏蛋，得先知道从哪儿找起。

那这个样本采集的地方可就多了去了。

如果怀疑是皮肤感染，就从感染的皮肤那块取点东西，可能是脓呀或者皮屑啥的。

要是呼吸道有问题，那痰液就是个重要的样本来源呢。

还有如果是泌尿系统的毛病，尿液就派上用场啦。

采集样本的时候呀，可得小心点，要是不小心污染了样本，那后面的鉴定可就不准了。

比如说采尿液的时候，要保证尿道口周围干净得很，不然混进去别的细菌，就乱套了。

二、直接镜检。

样本采好了，接下来就把样本放在显微镜下瞅瞅。

这就像是在人群里找那个特别的脸。

对于病原性球菌，我们可以用革兰氏染色法来处理样本。

经过染色之后，病原性球菌就会显出它的庐山真面目啦。

如果是革兰阳性球菌呢，染完色就会呈现出蓝紫色，像一颗颗紫宝石似的。

要是革兰阴性球菌呢，就是红色的啦。

这个时候我们就能初步判断是不是球菌，是阳性还是阴性的，这对后面进一步确定是哪种病原性球菌可重要着呢。

三、分离培养。

光在显微镜下看还不够呢，我们得把这些球菌单独培养出来，让它们自己长成小菌落。

就像把一群小朋友分开，让他们各自玩耍，这样我们就能更清楚地观察它们的特点啦。

不同的病原性球菌喜欢的生长环境还不太一样呢。

比如说葡萄球菌，在普通的琼脂培养基上就能长得很好，而且长得还挺快，就像一群小贪吃鬼，很容易就把培养基里的营养物质吃光光，然后长成一个个小菌落。

而链球菌呢，对生长环境就有点挑剔啦，可能需要在血液琼脂培养基上才能茁壮成长。

四、生化试验。

菌落长出来了，我们还得对它们进行更多的测试，这就是生化试验啦。

这个生化试验就像是给这些球菌出一道道小难题，看看它们怎么回答。

比如检测它们能不能发酵某些糖类，不同的病原性球菌发酵糖类的能力是不一样的。

葡萄球菌可能对葡萄糖发酵得很厉害，产生很多酸和气体，但是链球菌对葡萄糖的发酵就没那么猛啦。

还有检测它们是不是能产生一些特殊的酶，像血浆凝固酶，这可是葡萄球菌的一个重要标志呢。