响应面法优化猪血超氧化物歧化酶的提取工艺

响应面法优化硫酸软骨素提取的酶解工艺陈亚;徐晓燕【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2012(033)005【摘要】目的以猪喉软骨为原料,提取硫酸软骨素,优化酶解工艺条件.方法采用碱提-酶解-醇沉的方法提取硫酸软骨素,在单因素试验的基础上,通过响应面分析优化酶解工艺.结果酶解最佳工艺组合为:胰酶浓度1.0％、pH值8.6、酶解温度46℃、酶解时间2.8h.结论采用上述组合,以氨基葡萄糖含量为指标,氨基葡萄糖含量达25.94％.研究结果具有工业应用价值.%Purpose The chondroitin sulfate was isolated from pig laryngeal cartilage. The technique of enzymatic hydrolysis of chondroitin sulfate extraction was improved. Methods The chondroitin sulfate was isolated through the process of alkali extraction-enzymatic hydrolysis-alcohol precipitation. Based on the single factor tests, the technique of enzymatic hydrolysis of chondroitin sulfate extraction was improved by response surface methodology. Results To extract the chondroitin sulfate from pig laryngeal cartilage in enzymatic hydrolysis,the best combination of extracting technique was; the enzyme concentration of 1.0% ,8. 6 of pH, the temperature of 46℃ , and the timeof 2. 8 h. Conclusion The content of glu-cosamine in the chondroitin sulfate was 25. 94% after the optimization of the technique. The results can be calculated for industrial use.【总页数】4页(P548-551)【作者】陈亚;徐晓燕【作者单位】江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室,江苏省盐城技师学院,江苏盐城224002;江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室,江苏省盐城技师学院,江苏盐城224002【正文语种】中文【中图分类】R282.74;TQ464.1【相关文献】1.响应面法优化中性蛋白酶提取牡蛎牛磺酸酶解工艺条件 [J], 刘亚南;张志胜;佟海菊;孙克岩;宋欣2.响应面法优化鲨鱼硫酸软骨素的提取条件 [J], 张弘;谢果凰;茅大振;何斌辉;傅春燕;刘冰冰;杨文鸽3.响应面法优化鹅全骨硫酸软骨素的酶法提取工艺 [J], 谢晶;尹义捐;杨欲成;金晨钟;王双辉;卢超4.响应面法优化鹿骨多肽酶解工艺及其体外抗氧化活性 [J], 揣欣欣;郭冰洁;刘露露;牛红梅;马月;张亚丽;刘小瑜;苑广信5.响应面法优化蛋壳膜硫酸软骨素提取工艺 [J], 刘涛;张铁鹏;栾欣悦;刘贺;刘宁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

实验三 猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活力测定一、 实验原理超氧化物歧化酶(SOD)是一种能够专一性清除超氧离子自由基-2O 的金属酶。

它是一种酸性蛋白，对热、pH 和蛋白酶的水解较一般酶稳定。

SOD 催化下述反应：222222O O H O H +→+-+.。

机体内-2O 过量或不足都会对人体产生危害，SOD 对过量的-2O 及时清除保证-2O 含量的相对平衡。

本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为材料，从中提取SOD 并进行纯化。

该实验SOD 酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，其酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%酶量定义一个酶单位。

样品中蛋白质含量采用考马斯亮蓝250-G 法测定。

考马斯亮蓝250-G 在游离状态下呈粉红色，与蛋白质结合后呈蓝色。

在一定范围内，溶液在595nm 波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围是1-1000ug 。

SOD 同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。

二、试剂与材料[1]试剂：ACD 抗凝剂、0.9%NaCl 、丙酮、05%乙醇、氯仿、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/LEDTA 钠盐溶液、3 mmol/L 邻苯三酚钠溶液、考马斯亮蓝250-G 标准蛋白质溶液、[2]器材：分光光度计、试管、刻度吸管、离心机、烧杯。

三、操作步骤1、SOD 提取[1] 取40ml 新鲜猪血，5000r/m 离心10min ，去上层血浆，取下层红血球粘稠液。

加入2倍体积的0.9%Nacl 溶液清洗，5000r/m 离心10min ，弃上层清液。

[2] 向洗净的红血球中加入适量蒸馏水至15ml ，剧烈搅拌30min ，使其充分溶血。

再向溶血溶液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%的乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，均浆呈红色，再继续搅拌15min ，4000r/m 离心10min ，去变性蛋白质沉淀物，得上层液，留样1ml 。

一、原理1.超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基O-2（）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、抗炎及抗癌等作用因而在医药、化妆品及食品工业等方面有了广泛的应用前景。

SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。

按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD（二聚体，蓝绿色）、Mn-SOD（紫红色）和Fe-SOD（黄褐色）三种。

H+O-2 H2O2O2O-2SOD催化下述反应：2+2→+。

机体内的过量和不足均对机体不利，O-2O-2O-2SOD对过量的的及时清除保证了机体内的含量相对的平衡。

机体内的形成可分为O-2生理性和病理性两方面。

在一些正常生理过程中会形成一些。

例如：呼吸链中电子传递O-2O-2结果可产生一些。

在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中会产生大量的。

过量O-2O-2 H2O2O2的如不及时清除，会对细胞损伤。

SOD将歧化为和，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化或氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。

2.有机溶剂沉淀法分离纯化蛋白质本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行分离纯化。

有机溶剂沉淀法的基本原理：①亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀；②水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。

常见的有机溶剂有丙酮和乙醇等。

3.邻苯三酚自氧化法测定酶活力酶活性测定的方法有以下几种方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法及亚硝酸法等。

本实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为1个酶单位。

邻苯三酚自氧化法的原理：利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自O-2氧化，产生，生成有颜色的中间产物。

实验三猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定生物化学与分子生物学刘志坚S2*******一、超氧化物歧化酶（SOD）概述SOD是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅基，因此它对热、PH以及某些理化性质表现出异常的稳定性。

SOD根据所含金属辅基不同可分为三种：第一种是铜（Cu）锌（Zn）金属辅基称（Cu/Zn-SOD）最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于肌体细胞浆中。

它为同源二聚体酶，其中一个亚基结合一个Cu原子，另一个亚基结合一个Zn原子，两个亚基间的相互作用提高了酶的催化活性和稳定性，金属原子的氧化还原完成了酶的催化功能。

第二种是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内。

Mn—SOD是由203个氨基酸残基构成的四聚体，Mn3+处于三角双锥配位环境中，其中一轴向配位为水分子，另一轴向被蛋白质辅基的配位His-28占据，另3个配位His-83、His-170和Asp-166位于赤道平面。

第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe—SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。

其活性中心是3个His，1个Asp和1个H2O扭曲四面体配位而成。

其中，Mn—SOD 、Fe—SOD的结构特征是不含半胱氨酸，含有较多的色氨酸和酪氨酸，因此紫外吸收光谱类似一般蛋白质，在280nm附近有最大吸收峰，Mn—SOD的可见光谱在475nm处附近有最大吸收，Fe—SOD在350nm处有最大吸收，这都反映了所含金属离子的光学性质。

SOD为自由基清除剂，它广泛存在于生物体的各种组织中，能清除O2-（超氧阴离子）自由基，而超氧阴离子自由基具有细胞毒性，可使脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症，肿瘤和自身免疫性疾病，并可能促使机体衰老。

它的功能为：（1）抑制心脑血管疾病：机体的衰老与体内氧自由基的产生与积累密切相关，SOD课清除人体内过多的有害的氧自由基，是对健康的有益的功效成分。

猪血超氧化物歧化酶分离纯化工艺改进及其抗氧化活性研究王保全;庞晓斌;李昭华;平娟;王玲玲;董先智【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2010(000)002【摘要】以新鲜猪血为原料,首次利用改进的新工艺提取分离超氧化物歧化酶,经过溶血,热变,丙酮沉淀,超滤浓缩,SephadexG-75凝胶过滤层析和DEAE-sepharose-fast flow离子交换层析纯化,冷冻干燥等步骤,得到高纯度酶,并对酶的相关性能进行研究.试验结果显示产品粗酶活性在3 000 U/mg左右,分剐经SephadexG-75和DEAE-sepharose-fast flow层析纯化后,酶活分别达到5 585 U/mg和6 148 U/mg产品得率分别为13.4%和10.32%,SDS-PAGE凝胶电泳显示为单一条带达到电泳纯,其分子量在31 kD附近,其临苯三酚抗氧化活性明显.【总页数】5页(P168-172)【作者】王保全;庞晓斌;李昭华;平娟;王玲玲;董先智【作者单位】河南大学药学院,开封,475001;中国科学院生物物理研究所,北京,100101;河南大学药学院,开封,475001;中国科学院生物物理研究所,北京,100101;河南大学药学院,开封,475001;河南大学药学院,开封,475001;中国科学院生物物理研究所,北京,100101【正文语种】中文【相关文献】1.苦瓜抗氧化活性成分的分离纯化及抗氧化活性研究 [J], 刘苇芬;郭丽萍2.麦苗中超氧化物歧化酶抗氧化活性研究 [J], 张志清;丛军;林虹;晁正3.红花籽抗氧化肽的分离纯化及抗氧化活性研究 [J], 孙立;毛晓英;陈计峦;李保山4.湖南猪血桃花色苷提取工艺优化及抗氧化活性研究 [J], 杨玉;陈为峰;袁野;廖琼;邓文;徐海;卜范文5.猪血中抗菌肽类物质的分离纯化和抗菌活性研究 [J], 张艳梅;佘锐萍;刘天龙;李文贵;贾君镇;包汇慧因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猪血中超氧化物歧化酶S O D分离纯化及活力测定TTA standardization office【TTA 5AB- TTAK 08- TTA 2C】实验二猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定一、原理超氧化物岐化酶SOD广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。

它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。

SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。

根据金属辅基的不同，它可以分为四类，分别为Mn-SOD、Cu-Zn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD，其中最常见CuZn-SOD，主要存在于真核细胞的细胞质中。

CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为×104，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体，每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。

SOD作为机体内最重要的抗氧化酶体之一，可以直接清除过量的超氧自由基，阻止机体的过氧化，对机体有较高的防护作用及保健价值。

本实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定。

酶活性单位定义为:在1ml的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个活力单位。

二、试剂与器材1、试剂：ACD抗凝剂、%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯亮蓝G-250、50mmol/L 磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐溶液、3mmol/L 邻苯三酚溶液等。

2、器材：752分光光度计、分析天平、具塞试管、刻度吸管、离心机、烧杯、电泳装置、微量进样器、注射器等。

三、操作步骤提取取新鲜猪血20ml，加入到檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为：1，轻轻搅拌均匀，4000r/min离心10min，收集红血球。

然后用2倍体积生理盐水洗涤，4000r/min离心10min，弃上清液；重复2次，得洗净的血红球浓稠液。

然后向洗净的红血球加入等倍体积去蒸馏水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入倍体积的预冷95%乙醇和倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，4000r/min离心10min，除去变性蛋白沉淀，取清液。

猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的提取及其活力的测定一、实验目的了解猪血中SOD的提取及其活力测定的方法和原理，为充分利用猪血资源和提取SOD 提供技术基础。

二、实验原理（1）从猪血中分离纤维连接蛋白、免疫球蛋白和血红素后,提取SOD。

通过优化邻苯三酚的用量、SOD样液用量、反应温度和缓冲液pH值,对邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的条件进行了优化。

按照优化后的条件测定联合提取的SOD的比活力。

[结果]SOD活性测定的优化条件为50mmol/L邻苯三酚7μ,l 50mmol/LTris-HCl(pH 8.2)3m,l反应温度为25℃,SOD样液添加量为10μl。

三、实验原料与试剂氯化钠：一级工业品；乙醇：工业级；氯仿：化学纯；丙酮：工业级；磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液；柠檬酸三钠：化学纯，起抗凝作用；聚丙稀酸、离心沉淀器、生理盐水、氯化钠、去离子水、-4℃左95%的乙醇、-4℃左右氯仿、的确良布、滤纸、-4℃左右的丙酮、pH=7.6的磷酸盐缓冲液、水浴、微孔滤模或定性滤纸滤清、0.4 ml 10%浓度的聚丙烯酸液、五氧化二磷干燥、38 g/L柠檬酸三钠、50%饱和硫酸铵(pH 7.0)、蒸馏水、有机弱酸HA-有机弱碱BOH四、实验方法1、猪血中SOD提取（1）血的预处理接取新鲜猪血，迅速按7份血加1份5%柠檬酸三钠搅匀。

（2）除血清、溶血将血清放入离心沉淀器，以3 000 r/min离心处理约15~20 min。

吸取上清液，下层红血球沉淀加2~3倍生理盐水。

1.2.3配制取试剂氯化钠9 g加去离子水至1 000 ml 搅溶、搅匀，3 000 r/min离心7~8 min，如此2~3次得洗涤红血球，洗涤后红血球在-15℃条件下可保存2个月。

在洗净的红血球中加入等体积去离子水，剧烈搅拌30min，在0~4℃条件下放置10 h以上，使红血球充分破裂。

按溶血体积0.2~0.25倍缓慢加入预冷至-4℃左95%的乙醇。

猪血超氧化物歧化酶联合提取工艺及其活性检测研究王永芬;索江华;李华玮;吴学军;张俊英【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2009(037)023【摘要】[目的] 研究猪血超氧化物歧化酶(SOD)与其他生物活性物质的联合提取工艺,为充分利用猪血资源和规模化生产SOD提供技术基础.[方法] 从猪血中分离纤维连接蛋白、免疫球蛋白和血红素后,提取SOD.通过优化邻苯三酚的用量、SOD样液用量、反应温度和缓冲液pH值,对邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的条件进行了优化.按照优化后的条件测定联合提取的SOD的比活力.[结果] SOD活性测定的优化条件为50 mmol/L邻苯三酚7 μl, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.2)3 ml, 反应温度为25 ℃,SOD样液添加量为10 μl.联合提取的SOD的比活力达到5 056 U/mg蛋白质.[结论] 通过现代生物工程集成技术从猪血中分级提取了4种生物活性物质,所提取的SOD具有较好的活性.【总页数】3页(P11019-11020,11053)【作者】王永芬;索江华;李华玮;吴学军;张俊英【作者单位】郑州牧业工程高等专科学校生物工程系,河南郑州,450011;郑州牧业工程高等专科学校生物工程系,河南郑州,450011;郑州牧业工程高等专科学校生物工程系,河南郑州,450011;郑州市通源生物技术有限公司,河南郑州,450001;郑州市通源生物技术有限公司,河南郑州,450001【正文语种】中文【中图分类】S813.3【相关文献】1.白藜芦醇对持续性心房颤动猪血浆超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的影响 [J], 周晓峰;王志荣;张卓琦;张超群;徐晤;张涛2.猪血超氧化物歧化酶分离纯化工艺改进及其抗氧化活性研究 [J], 王保全;庞晓斌;李昭华;平娟;王玲玲;董先智3.中草药饲料添加剂对仔猪血液中超氧化物歧化酶活性的影响 [J], 陈春林;张素辉;翟少钦;林渝宁;荣素芳4.猪血超氧化物歧化酶联合提取工艺及其活性检测研究 [J], 王永芬;索江华;李华玮;吴学军;张俊英5.湖南猪血桃花色苷提取工艺优化及抗氧化活性研究 [J], 杨玉;陈为峰;袁野;廖琼;邓文;徐海;卜范文因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。