氮代谢关键酶活性测定方法

抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。

此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。

因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。

2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。

反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。

每个处理设3 个重复。

（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。

用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。

取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。

硝酸还原酶的测定一、实验目的和要求掌握体内法测定植物组织中硝酸还原酶的原理和方法，阐明诱导酶的含义。

2、实验内容与原则硝酸还原酶（nr）是植物氮素同化的关键酶，与作物吸收和利用氮肥有关。

它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：--产生的NO2可以从组织渗透到外部溶液中，并在溶液中累积。

NO2含量的增加表明酶的活性增加。

装no2含量的测定用磺胺比色法。

在酸性溶液中产生的亚硝酸盐与对c氨基苯磺酸（或对c氨基苯磺酰-订线（胺）反应生成重氮，然后与αC萘胺（或萘基乙二胺）反应生成紫红色偶氮化合物。

生成的红色偶氮化合物在540nm波长处有最大吸收峰，可通过分光光度法测定。

溶液中NO2-的含量可用标准曲线测定。

3、主要仪器设备1、实验仪器分光光度计，真空泵，温箱，天平，2个烧杯，移液管若干，试管3支，剪刀。

2、实验试剂0.1mol/lph7.5的磷酸缓冲液，对-氨基苯磺酸溶液，α-萘胺溶液，亚硝酸钠标准液3.两组大麦幼苗在15-25℃的蒸馏水中培养一周。

一组用硝酸钾治疗，另一组用氯化铵治疗。

四、操作方法和实验步骤1.切两组新鲜叶片。

一组为0.51g处理苗，另一组为0.50g对照苗。

将叶片分别切成0.5~1cm的碎片并压实。

2、两组中各加入15ml的酶促反应液。

3.真空提取10min，充分交换细胞内外液。

4.盖上盖子，在30℃的培养箱中保存20分钟。

5、去除材料，用移液管取4ml反应液，加入2ml磺胺，加入2ml苯基，放置15min。

6、比色：在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的od值。

7.空白管：4ml H2O+2ml磺酰胺溶液+2ml萘乙二胺溶液？在室温下放置15分钟后，在540nm处用分光光度法测定亚硝酸的OD值。

五、实验数据记录和处理称重：处理过的幼苗0.51g；对照苗0.50god值：处理苗0.513a；对照苗0.050aNO2含量标准曲线：y=257.29x-4.8262（x=OD值；y=NO2含量（nmol））。

西瓜（Citrullus lanatus （Thunb.）Matsum.et Nakai ）是葫芦科西瓜属植物。

西瓜清爽解渴，味道甘味多汁，堪称“盛夏之王”，西瓜含有丰富的维生素C、蛋白氨基酸、果糖、葡萄糖、苹果酸等物质，极具营养价值。

我国是西瓜生产与消费的第一大国[1]。

近年来，随着人们生活水平的提高，对西瓜的数量和质量需求不断增加。

因此，提高西瓜产量和质量成为重要的研究任务。

提高西瓜产量和质量不仅依赖于优良品质的选育，还有赖于栽培管理技术，其中水肥管理是西瓜种植过程中最为重要的环节[2]。

水是植物进行物质转化、养分运输的重要条件，在植物光合、形态建成和生长发育中发挥重要的作用[3]。

氮作为作物生长发育所必需的营养元素其中之一，是作物生长的首要限制因素[4]。

植物蛋白质、核酸、酶和叶绿素合成需要氮素，氮素也是内源激素及其前体的主要成分[5]。

植物水和氮的吸收是两个相对独立的过程，但是存在相互的作用和联系，水氮的协调利用是植物物质积累的重要因素[6]，水分通过改善土壤物理化学特征以及土壤生物的活动来增加土壤养分的有效性，土壤养分伴随水分进入植物体内。

因此，协调的水氮关系能够促进植物养分运输、光合作用[7]。

苗为伟等[8]研究表明，施氮肥能够提高缺水环境下植物体内无机离子和有机物质含量，从而改善植株水分状况，提高对环境的适应能力。

马慧敏等[9]研究表明，氮代谢和光合作用对水分和氮素的响应存在差异，充足灌水有利于植物光合作用。

董伟欣等[10]研究表明，随着水氮量的增加，小麦株高、旗叶面积和地上部干重增加，中氮/高水是最理想的水氮互作方式。

前人有关水分和氮肥的研究取得较大的进展，然而有关水氮耦合互作对西瓜生长和产量的影响研究较少，因此，本试验设置3个氮肥水平和2个灌水水平，研究西瓜生长、氮代谢、光合参数以及产量的变化特征，为西瓜的高效栽培提供参考依据。

1　材料与方法1.1　试验材料试验于2021年江苏省淮安市淮安区石塘镇大棚内进行，属于亚热带湿润季风气候，平均气温为14.5℃，年平均在957mm，无霜期216d左右，全年日照时数2136-2411h，整体表现为雨热同季，雨量集中，冬冷夏热，光能充足，热量丰富。

不同氮肥类型及施氮量对大豆产量和品质的影响0 引言大豆［Glycine max（Linn.）Merr.］是豆科大豆属植物，在我国栽培历史悠久，是我国重要的粮食作物和油料作物。

大豆含有丰富的脂肪、蛋白质、膳食纤维等，具有较高的营养价值。

当前，我国是世界上最大的大豆进口国，对大豆的需求量较大。

因此，大力发展大豆种植业，提高大豆产量和品质至关重要。

氮素是大豆形成新器官和生成籽粒蛋白质的原料，并参与蛋白质合成过程，是影响大豆产量的主要因素。

土壤中的氮素以多种形态存在，植物能够吸收利用的主要是铵态氮、硝态氮及一些可溶性有机氮分子。

酰胺态氮属于有机氮肥，需要经过土壤中的脲酶作用，水解成碳酸铵或碳酸氢铵后才能被植物吸收利用。

植物对不同形态氮素的吸收、运输机制不同，而且其同化效率也存在很大差异。

大量研究表明，氮肥类型能够影响植株对氮元素的吸收和利用效率，进而影响植物地上部分生长。

氮肥类型还会影响植物对其他矿质元素的吸收，主要是因为不同类型氮肥的生理酸碱性存在差异，会导致植物根际土壤pH值发生变化，进而使植物根系对其他阴离子和阳离子的吸收比例发生变化。

因此，笔者通过试验研究不同氮肥类型及施氮量对大豆产量和品质的影响，探寻适宜大豆生长的氮肥形态，从而为大豆种植管理提供科学依据。

1 试验材料与方法1.1 试验地概况试验地位于安徽省利辛县，属暖温带半湿润气候区，年平均气温14.9 ℃，年平均日照时间2 184 h，年无霜期213 d 左右，年平均降水量831 mm。

试验地土壤类型为砂姜黑土，耕层土壤有机质含量为13.8 g/kg，全氮含量为0.57 g/kg，速效磷含量为32.18 mg/kg，速效钾含量为105.72 mg/kg。

1.2 试验材料供试大豆品种为皖豆24。

试验用酰胺态氮肥为尿素，硝态氮肥为硝酸钾，磷肥为过磷酸钙，钾肥为氯化钾，均购于当地农资市场。

1.3 试验设计试验采用完全随机设计，设7 个处理（含1 个对照），以不施氮肥为对照（CK），N1～N6为6个施氮处理，其中N1为施用酰胺态氮肥40 kg/hm2、N2为施用酰胺态氮肥70 kg/hm2、N3为施用酰胺态氮肥100 kg/hm2、N4为施用硝态氮肥40 kg/hm2、N5为施用硝态氮肥70 kg/hm2、N6为施用硝态氮肥100kg/hm2。

抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。

此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。

因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。

2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。

反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。

每个处理设3 个重复。

（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。

用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。

取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 220mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。

提取方法2：Zhang CF, Peng SB, Peng XX, Chavez AQ,Bennett J. Response of glutamine synthetase isoforms to nitrogen sources in rice Oryza Sativa.L roots.Plant Sci,1997,125:163-170Rhodes D, Rendo GA, Stewart GR. The control of glutamine synthetase level in Lemna minor L. Planta, 1975, 125:201-211The reaction mixture (3.0 ml) consistedof sodium ketoglutarate (10_mol), ammonium chloride(10_mol), calcium chloride (10_mol), NADH (2_mol), Tris–HClbuffer (100_mol, pH 8.2) and enzyme 0.1 ml.Following a 30 min incubation period at 30◦C in 20μmol MgSO4, 80μmol α-ketoglutarate, 6μmol hydroxylamine, 8μmol ATP and enzyme extract, the enzymatic reaction was terminated by the addition of 1.5 ml of a solution containing 0.37mol/l FeCl3, 0.2 mol/l TCA and 0.37 mol/l HCl andthe amount of glutamyl hydroxamate determined at 540 nm.Lea P J, Blackwell R D, Chen F L. Enzymes of primary metabolism. In: Harborne J B.Methods in Plant Biochemistry. Vol.3. New York: Academic Press, 1990. pp 260-273the reaction mixture (3 ml) consisted of 5μmo l α-ketoglutarate, 1μmol potassium chloride, 48.75μmol Tris–HCl buffer (pH 7.6), 0.6μmol NADH, 0.3 ml enzyme and 8μmol L-glutamine300μmol Tris–HCl buffer (pH 8.0), 600μmol ammonium chloride, 3μmol calcium chloride, 0.6μmol NADH, and 0.1 ml enzyme. The change of absorption value was detected at 340 nm in 3 min,Singh RD, Srivastava H S. Increase in glutamate synthase (NADH) activity in maize seedlings in response to nitrate and ammonium nitrogen. Physiol. Plant, 1986, 66:413-416Loulakakis KA, Roubelakis-Angelakis KA. Intracellular localization and properties of NADH–glutamate dehydrogenase form Vitis vinifera L.: Purification and characterization of the major leaf isoenzyme.Journal of Experimental Botany, 1990, 41:1223-1230EP酶活性的测定高玲, 叶茂炳‘ 张荣铣“ 徐朗莱, 小麦旗叶老化期间的内肤酶植物生理学报,1998,24（2）183-188硝酸还原酶活性的测定：仪器：离心机；分光光度计；冰箱；研钵；试管等试剂：亚硝酸钠；Na2HPO4·12H2O；NaH2PO4·2H2O；磺胺；浓盐酸；萘基乙烯胺；KNO3K2HPO4·3H2O；半胱氨酸；EDTA；NADH（辅酶Ⅰ）；李合生主编，植物生理生化实验原理和技术，高等教育出版社，2000,125-127 Li H-S(李合生). Experimental Principle and Technique for Plant Physiology and Biochemistry (植物生理生化实验原理和技术).Beijing: Higher Education Press, 2000. pp 125-127 (in Chinese)关于您问的“磷酸缓冲液里该加多少EDTA和半胱氨酸，均没有说明”在此书的P126页写的很全面，步骤也非常详细，请查阅，如：提取缓冲液。

谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸脱氢酶（GDH）是碳氮代谢的关键酶。

淀粉酶，转化酶，硝酸还原酶，谷氨酰胺合成酶活性测定原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP 和M g 2+ 存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。

在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ—谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。

谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ—谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg －1 protein·h －1 。

也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A·mg －1 protein·h －1 。

【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2 ml、1ml）。

【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+ ，2mmol/L DTT，0.4 mol/L 蔗糖。

称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO 4 ·7 H 2 O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml；反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg 2+ ，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2 mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO 4 ·7H 2 O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0. 1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml；反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A 的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和0.6mol/L HCl 混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl 3 ·6H 2 O，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml；40mmol/L ATP 溶液：0.1210g ATP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。

烤烟碳氮代谢关键酶活性动态及其与类胡萝卜素关系研究杨志晓1，史跃伟1，林世峰1，王志红1，谢升东1，任学良1*（贵州省烟草科学研究院，贵阳550081）摘要：以红花大金元、K326为试验材料，采用大田种植方式，研究了不同基因型烤烟叶片碳氮代谢关键酶的活性动态及其与类胡萝卜素的相关性。

结果表明，在烟草生长发育过程中，硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、蔗糖转化酶和淀粉酶活性均呈现先上升后降低的变化规律，硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶和淀粉酶在移栽后60 d达到最大值，而蔗糖转化酶活性最大值出现在移栽后75 d。

类胡萝卜素各组分（β-类胡萝卜素、叶黄素、新黄质和紫黄质）含量随着生育进程的推移，呈下降趋势。

在整个生育期内，红花大金元叶片硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、蔗糖转化酶和淀粉酶活性以及类胡萝卜素各组分含量均高于K326。

相关分析结果表明，蔗糖转化酶活性与类胡萝卜素各组分含量呈显著负相关。

关键词：烤烟；碳氮代谢；酶；类胡萝卜素；相关分析中图分类号：S572.01 文献标识码：A 文章编号：Dynamic of Key Enzymes Activity Involved in Carbon and Nitrogen Metabolism in Flue-cured Tobacco and their Correlation with CartenoidsYANG Zhixiao1, SHI Yuewei1, LIN Shifeng1, WANG Zhihong1, XIE Shengdong1, REN Xueliang1*(Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550081, China)Abstract: The dynamic of key enzyme activities involved in carbon and nitrogen metabolism in different flue-cured tobacco cultivars were studied with K326 and Honghuadajinyuan in field condition, and their correlations with cartenoids was also investigated. The results showed that the activities of nitrate reductase, glutamine synthetase, invertase and amylase all increased at the earlier stage and decreased at later stage in the growth and development period of tobacco. The activities of nitrate reductase, glutamine synthetase, and amylase reached maximum at 60 d after transplanting, but the peak activity value of invertase was at 75 d after transplanting. The contents of carotenoids components (β-carotene, lutein, neoxanthin, violaxthin) decreased gradually with the proceeding of tobacco growth and development process. In the whole growth period, Honghuadajinyuan had higher enzyme activity and carotenoids content than K326. There was significant negative correlation between the activity of invertase and the contents of carotenoids components.Keywords: tobacco; carbon and nitrogen metabolism; enzyme; carotenoids; correlation近年来，我国烟叶生产水平大幅提升，烟叶生长的整齐度和烤后烟叶质量的均衡性大大提高[1]；但与国外优质烤烟相比，香气质差、香气量不足、化学成分不够协调仍是影响我国烟叶质量提高的制约性因素[2]。

实验5 硝酸还原酶活性的测定【实验目的】掌握硝酸还原酶活性测定的两种方法，加深对硝酸还原酶在植物体氮素代谢中作用的理解。

【实验原理】硝酸还原酶（nitrate reductase,NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，（NO3-+NADH + H+→NO2-+NAD ++H2O）。

产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（or 对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（or 萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。

其反应如下：生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。

硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。

一般单位鲜重以Nμg/（g﹒h）为单位。

NR的测定可分为活体法和离体法。

活体法步骤简单，适合快速、多组测定。

离体法复杂，但重复性较好。

Ⅰ离体法【材料设备】（三）试剂1、NaNO2标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.1g溶于无离子水后定容至100ml，然后再吸取1ml用蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO21μg，用时稀释之。

2、0.1mol/L PH7.5的磷酸缓冲液，Na2HPO4·12H2O 30.0905g与NaH2PO4·2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1000mL。

3、1%（m/V）对氨基苯磺酸（磺胺酸）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol/L的HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol/LHCL）。

4、0.02%（m/V）萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100mL 去离子水中，贮于棕色瓶中。

5、0.1mol/L KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250mL 0.1mol/L Ph7.5的磷酸缓冲液中.6、0.025mol/L Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.8640g Na2HPO4·12H2O，0.0570g KH2PO4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中。

櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄［２５］张　艳，刘彦伶，李　渝，等．喀斯特石漠化地区土地利用方式对土壤团聚体稳定性及其有机碳分布特征的影响［Ｊ］．土壤通报，２０２１，５２（６）：１３０８－１３１５．［２６］ＦａｎＺ，ＴｉａｎＸＦ，ＺｈａｉＳ，ｅｔａｌ．Ｃｏ－ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ－ｒｅｌｅａｓｅｕｒｅａａｎｄａｓｕｐｅｒａｂｓｏｒｂｅｎｔｐｏｌｙｍｅｒｔｏｉｍｐｒｏｖｅｎｉｔｒｏｇｅｎａｎｄｗａｔｅｒｕｓｅｉｎｍａｉｚｅ［Ｊ］．ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙａｎｄＳｏｉｌＳｃｉｅｎｃｅ，２０２２，６８（７）：９１４－９２８．［２７］张　倩，韩本高，张　博，等．控失尿素减施及不同配比对夏玉米产量及氮肥效率的影响［Ｊ］．作物学报，２０２２，４８（１）：１８０－１９２．［２８］ＪａｒｉｗａｌａＨ，ＳａｎｔｏｓＲＭ，ＬａｕｚｏｎＪＤ，ｅｔａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｒｅｌｅａｓｅｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓ（ＣＲＦｓ）ｆｏｒｃｌｉｍａｔｅ－ｓｍａｒｔａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅｐｒａｃｔｉｃｅｓ：ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗｏｎｒｅｌｅａｓｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｍｅｔｈｏｄｓｏｆｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ａｎｄｅｆｆｅｃｔｏｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｓ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｏｌｌｕｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ，２０２２，２９（３６）：５３９６７－５３９９５．［２９］于文勇，葛祥菡，孙娅婷，等．有机肥与控释尿素配施对坡耕地土壤氮素淋溶及玉米产量的影响［Ｊ］．中国土壤与肥料，２０２２（１２）：５３－６０．［３０］ＬｉＺＬ，ＬｉｕＺＧ，ＺｈａｎｇＭ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ－ｒｅｌｅａｓｅｕｒｅａａｎｄｆｕｌｖｉｃａｃｉｄｉｍｐｒｏｖｅｄｔｈｅｓｏｉｌｎｕｔｒｉｅｎｔｓｕｐｐｌｙａｎｄｍａｉｚｅｙｉｅｌｄ［Ｊ］．ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙａｎｄＳｏｉｌＳｃｉｅｎｃｅ，２０２１，６７（５）：６３３－６４６．黄人杰，王　娇，龙尚沅，等．不同烤烟品种间碳氮代谢关键酶及其产物的差异［Ｊ］．江苏农业科学，２０２４，５２（５）：１０２－１０７．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２４．０５．０１５不同烤烟品种间碳氮代谢关键酶及其产物的差异黄人杰１，王　娇１，龙尚沅１，熊　晶２，郜军艺２，高焕晔１（１．贵州大学烟草学院／贵州省烟草品质研究重点实验室，贵州贵阳５５００２５；２．贵州省烟草公司毕节市公司，贵州毕节５５１７００） 摘要：为探究不同品种间碳、氮代谢关键酶及其主要产物间的差异和内在联系，寻找碳氮代谢适宜的后备烤烟品种，进行４个品种（云烟８７、云烟１０５、云烟１１６、云烟１２１）的田间试验，观测其团棵期、旺长期、现蕾期总糖、还原糖、总氮、烟碱含量及代谢关键酶［蔗糖合成酶（ＳＳ）、蔗糖磷酸合成酶（ＳＰＳ）、硝酸还原酶（ＮＲ）、亚硝酸还原酶（ＮｉＲ）、谷氨酰胺合成酶（ＧＳ）］活性。

实验一植物抗氧化酶活性的测定植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等。

它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反应。

所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。

一、超氧化物岐化酶活性测定超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（）的酶，它催化下列反应：2反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。

已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。

【原理】本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲。

后者在560nm处有最大吸收，而SOD可清除从而抑制了甲的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

一个酶活性单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50％）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。

【仪器与用具】高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx）；试管数支；黑色硬纸套。

【试剂】1．50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。

2．提取介质50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）。

3．130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称取1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml。

4．750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取61.33m g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml，现配先用，避光保存。

5．100μmol/L EDTA-Na2溶液：取37.21m g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。

6．20μmol/L核黄素溶液：取7.53m g核黄素定容至1000ml避光保存。

赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》）参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27～29硝酸还原酶活性的测定原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮简单易行，在一般条件下都能做到。

红色的偶氮染料。

反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。

增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。

这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5μg的NaNO2。

仪器药品721型分光光度计真空泵（或注射器）保温箱天平真空干燥器钻孔器三角烧瓶移液管烧杯0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5（见附表2）。

0.2mol/L KNO3：溶解20.22g KNO3于1000ml蒸馏水中。

磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。

α—萘胺试剂：0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水中，稀释至100ml。

NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸馏水溶解成1000ml。

然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO2 5μg，用时稀释之。

操作步骤1. ．将新鲜取回的叶片（蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用蒸馏水洗涤2梍3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3—0.4g （或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L 磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+蒸馏水5ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。

然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。

碳氮代谢测定谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸脱氢酶（GDH）是碳氮代谢的关键酶。

淀粉酶，转化酶，硝酸还原酶，谷氨酰胺合成酶活性测定原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和M g 2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。

在反应体系中，谷氨酰胺转化为Y-谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。

谷氨酰胺合成酶活性可用产生的 Y-谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位Mmol mg -1 protein h - 1。

也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A mg -1 protein h -1。

【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2 ml、1ml）。

【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含 2mmol/L Mg 2+，2mmol/L DTT，0.4 mol/L 蔗糖。

称取 Tris （三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO 4 7 H 2 0，0.1543g DTT （二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至 pH8.0，最后定容至 250ml ；反应混合液 A （0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，PH7.4）：内含80mmol/L Mg 2+，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2 mmol/L EGTA，称取 3.0590g Tris，4.9795 gMgSO 4 7H 2 0, 0.8628g 谷氨酸钠盐， 0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0. 1mol/L HCl调至pH7.4,定容至 250ml ；反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A的成分再加入 80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和 0.6mol/L HCl混合液）：3.3176g TCA （三氯乙酸），10.1021g FeCl 3 6H 2 0，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定容至100ml；40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。