质粒构建步骤设计

质粒构建实验步骤实验一1．将合成的引物溶解（10uM），分别扩增P1P2，P3P4，2．PCR扩增条件如下：95 ℃ 10 min95 ℃ 30 s50℃ 30 s 10cycle72℃ 30 s72℃ 5min3.反应体系为：20 ul （p1p2和p3p4各两管）dNTP 2 ul10xBuffer 2ulTaq 0.4 ulPrimer P1 （P3） 1.0 ulPrimer P2 （P4） 1.0 ulH2O 13.6 ul4．将产物电泳，检测是否为目标片断（分别为A1B、A2B）,证实为目的片断以后，进行后续扩增5．将扩增出的AB和CD片断等摩尔加入作为模板进行第二次PCR，并且在第二次PCR 时加入引物扩增25个循环，PCR扩增条件如下：95 ℃ 15 min95 ℃ 30 s60 ℃ 30 s 25cycle72℃ 40 s72℃ 5min6．反应体系为：100uldNTP 10 ul10xBuffer 10 ulTaq 1ulProduct P1P2 2 ulProduct P3P4 2 ulPrimer F 1 ulPrimer R 1 ulH2O 73ul实验二连接载体DNA外源DNA片段10×T4 DNA ligase bufferT4 DNA ligase 0.5μl16℃保温8-24小时。

做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA片段没有质粒载体。

实验三10．转化①取100ul感受态细胞置于冰上融化，将50ul感受态细胞加入至10ul连接产物中，冰上30min。

②42℃放置45~60s，冰上放置2~3min。

③加入37℃预温好的200ul LB液体培养基（不含Amp）④37℃振荡培养1h（160~220 rpm）11．铺板铺板之前要先将AMP抗性的LB固体培养基先预温到常温，然后取100 ul菌液涂板，37℃培养过夜（16~24h）12．不带有质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。

质粒构建1. 引言质粒是一种重要的实验工具，广泛应用于基因工程、遗传学和生物学研究中。

质粒构建是指将感兴趣的DNA片段插入到质粒中的过程，用于进一步研究DNA序列的功能和相互作用。

本文将介绍质粒构建的基本原理和步骤。

2. 质粒构建的基本原理质粒构建需要以下几个基本要素：•质粒：质粒是一种环状的DNA分子，可存在于细菌、酵母等生物体内。

•DNA片段：DNA片段是质粒构建中要插入质粒的感兴趣DNA序列，可以通过PCR扩增、基因合成等方法得到。

•限制酶：限制酶是一种特殊的酶，能够识别和切割DNA的特定序列。

•连接酶：连接酶是一种酶，能够将DNA片段与质粒连接起来。

基于以上要素，质粒构建的基本原理如下：1.将质粒和目标DNA片段分别进行限制性内切酶切割。

限制酶切割会产生粘性末端或平滑末端的DNA片段。

2.使用连接酶将目标DNA片段与质粒连接起来。

连接酶能够将两条DNA片段的末端连接起来，形成一个完整的质粒。

3.利用转化或转染等方法将质粒导入到宿主细胞中。

质粒在宿主细胞中进行复制和表达。

3. 质粒构建的步骤质粒构建的具体步骤如下：3.1 质粒提取从质粒宿主细胞中提取质粒是质粒构建的第一步。

常用的质粒提取方法包括碱裂解法、盐溶解法、商业提取试剂盒等。

质粒提取的目的是获取纯度较高的质粒样本，便于后续实验操作。

3.2 目标DNA片段的获取目标DNA片段可以通过PCR扩增、基因合成等方法得到。

PCR扩增需要设计引物，引物的序列与目标DNA片段的两端相互衔接。

基因合成则需要将目标DNA序列依照设定的序列进行化学合成。

3.3 DNA片段与质粒的连接将目标DNA片段与质粒进行连接，需要使用连接酶。

连接酶则需要根据DNA片段和质粒的不同情况选择合适的连接酶和反应条件。

连接酶反应通常包括连接酶、DNA片段和质粒的混合体系，以及一定的温度和时间。

3.4 转化或转染将连接好的质粒导入到宿主细胞中，以使质粒在宿主细胞中进行复制和表达。

质粒构建流程范文质粒是在分子生物学研究中常用的载体，用于将外源基因导入到真核或原核细胞中。

质粒构建是将所需基因插入质粒中的过程，通常包括以下几个步骤：选择适当的质粒骨架、获得目标基因、PCR扩增目标基因、消除酶切位点、连接、转化宿主细胞和筛选等。

下面将详细介绍质粒构建的流程。

第一步：选择适当的质粒骨架质粒骨架是质粒的基本结构，包括起始子、终止子、选择性标志物和多个酶切位点，用于插入目标基因。

在选择质粒骨架时，需要考虑质粒复制起源、复制调节元件和基因表达调节元件等因素。

第二步：获得目标基因目标基因是要插入到质粒中的外源基因，可以是从生物体中提取的DNA或通过合成DNA获得的。

在获得目标基因时，需要考虑基因的大小、序列特征和功能等因素。

第三步：PCR扩增目标基因PCR（聚合酶链反应）是一种常用的DNA扩增技术，可以通过引物在DNA模板上进行反复扩增，得到大量的目标基因的DNA片段。

在PCR扩增目标基因时，需要选择适当的引物和反应条件，并进行反应优化和扩增验证。

第四步：消除酶切位点在插入目标基因之前，需要消除质粒骨架内的酶切位点，避免再次被酶切产生的片段。

可以通过点突变、限制性内切酶切除和引物设计等方法消除酶切位点。

第五步：连接将PCR扩增的目标基因与质粒骨架连接，通常可以通过限制性内切酶切除和连接、引物设计和T4DNA连接酶等方法实现。

在连接时，需要考虑连接位点的互补性和酶切位点的匹配等因素。

第六步：转化宿主细胞质粒构建完成后，需要将其转化到适当的宿主细胞中，使其在细胞内复制和表达。

常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞等。

第七步：筛选转化后的宿主细胞需要进行筛选，以获得携带目标基因的阳性克隆。

常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选和PCR鉴定等。

质粒构建是一项复杂而精细的实验技术，需要熟练的实验操作和严密的实验设计。

在实验过程中，需要注意反应体系的优化、质粒构建产物的验证和质粒的稳定性等因素。

酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建质粒构建是酵母菌表面展示技术的关键步骤之一。

通过质粒构建，可以将目标蛋白基因与表面展示载体进行连接，实现对目标蛋白在酵母菌表面的展示。

以下是酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建的具体内容。

第一步：目标蛋白基因与表面展示载体设计根据目标蛋白的特性和所需实验目的，选择合适的表面展示载体。

常用的载体有pCTCON2、pYD1、pYD2等。

此外，还需要根据质粒构建所需的连接酶切位点，设计引物对目标蛋白基因进行扩增。

第二步：目标蛋白基因扩增利用PCR方法，使用设计好的引物对目标蛋白基因进行扩增。

扩增条件可以根据目标片段的长度和GC含量进行优化。

扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物的大小，并使用纯化试剂盒纯化产物。

第三步：表面展示载体线性化将表面展示载体进行限制性酶切，选择合适的限制性酶对载体进行切割。

切割产生的末端可以根据所需进行处理。

线性化的表面展示载体可以提高质粒的转化效率和稳定性。

第四步：目标蛋白基因与表面展示载体连接将线性化的表面展示载体与目标蛋白基因进行连接。

连接可以通过多种方法进行，如PCR法、接头连接法等。

连接方法的选择应根据实验需求进行。

第五步：连接产物转入宿主酵母菌将连接好的质粒转化到酵母菌宿主细胞中。

转化可以选择化学法或电转法进行。

转化后，将细胞均匀涂布在含有适当选择性的培养基上，利用培养基中的选择性条件筛选转化成功的菌落。

第六步：筛选和鉴定质粒对于转化成功的菌落，进行筛选和鉴定。

首先通过酵母菌表面展示的方法对菌落进行初步筛选。

初步筛选后的菌落进行PCR扩增，使用测序方法对扩增产物的序列进行验证。

第七步：质粒抽提和进一步分析对于验证成功的酵母菌菌株，进行质粒抽提。

常用的质粒抽提方法有碱裂解法、按序列分析法等。

抽提得到的质粒可以进行进一步分析，如限制性酶切、测序等。

以上就是酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建的内容。

通过以上步骤，我们可以构建目标蛋白的表面展示载体，并将其成功转化到酵母菌中，为后续的酵母菌表面展示实验打下基础。

质粒构建全过程范文质粒构建是分子生物学实验中的一项重要技术，用于将目标基因插入到质粒中，进而导入到宿主细胞中。

下面将详细介绍质粒构建的全过程。

第一步：设计引物在质粒构建之前，需要设计引物，包括引物序列的选择和设计。

引物是用于在PCR反应中扩增目标基因的特定序列。

引物的选择应考虑到目标基因的特点，如长度、GC含量、互补性及其它特异性需求。

第二步：PCR扩增目标基因通过PCR反应扩增目标基因，此过程中，使用上一步设计的引物。

PCR反应的条件和周期取决于目标基因的特点，如长度和GC含量。

扩增后的DNA片段可以通过琼脂糖凝胶电泳检测。

第三步：准备载体质粒选择一个合适的载体质粒，根据实验需求选择质粒的构型、大小及适用宿主细胞。

将质粒提取并进行消毒处理，以去除可能的污染物。

第四步：限制性内切酶切质粒与目标基因通过在特定位点使用限制性内切酶切割载体质粒和PCR扩增得到的目标基因，以生成互补的黏性末端。

第五步：连接目标基因与载体质粒将切割后的载体质粒与目标基因进行连接。

此时，两者的黏性末端会互相连接，形成短暂的连接体。

可以使用连接酶、盐溶液等辅助物质来增强连接效果。

连接后的质粒可以通过琼脂糖凝胶电泳检测。

第六步：转化宿主细胞将连接后的质粒转化到宿主细胞中，以使宿主细胞具有新质粒。

转化的方法有多种，包括化学法、电渗透法、热冲击法等。

选择合适的转化方法要考虑到宿主细胞的特点。

第七步：宿主细胞筛选与鉴定转化完成后，宿主细胞需要进行筛选与鉴定。

一般来说，可以利用抗生素抗性基因选择含有质粒的细胞。

通过培养在含有抗生素的培养基上，只有含有质粒的细胞能够生长。

第八步：验证目标基因的插入通过PCR扩增或测序等方法验证目标基因是否成功插入到质粒中，并且在宿主细胞中表达。

可以使用特异性引物扩增目标基因，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。

测序可以进一步验证目标基因的正确性。

第九步：扩增检测阳性菌落通过原核培养使阳性菌落扩增，以获得足够大量的质粒实验使用。

质粒构建步骤
嘿，你问质粒构建步骤啊？这事儿还挺复杂，不过咱慢慢说。

第一步呢，得先确定你要构建啥样的质粒。

就像你要盖房子，得先有个设计图吧。

想好你要把哪些基因放进去，要让质粒有啥功能。

这可不能瞎整，得有个明确的目标。

第二步，准备材料。

你得有合适的载体质粒，就像盖房子得有块地一样。

还有你要插进去的基因片段，这就好比盖房子的砖头瓦块啥的。

还得有各种酶啊，像剪刀一样把东西剪开再拼起来。

第三步，把基因片段剪下来。

用特定的酶在合适的位置把基因片段从原来的地方切下来。

这就像用剪刀把一块布剪成你想要的形状。

得小心点，可别剪坏了。

第四步，把基因片段插进载体质粒里。

这就像把一块拼图放进一个大拼图里一样。

用另一种酶把载体质粒打开一个口子，然后把基因片段塞进去。

再把口子封上，让它们连在一起。

第五步，验证一下你构建的质粒对不对。

可以用一些方法，比如测序啊，看看基因片段是不是插对地方了，有没有弄错啥的。

要是不对，就得重新来过。

比如说有个科学家想构建一个能让细菌发光的质粒。

他先想好要把哪个发光基因插进去，找好了载体质粒和各种酶。

然后小心翼翼地把发光基因剪下来，插进载体质粒里。

最后验证的时候发现插对了，可高兴了。

把这个质粒放到细菌里，细菌就真的发光了。

所以说啊，质粒构建可不是件容易的事，得一步一步来，细心又耐心。

咋样，现在知道质粒构建的步骤了吧？。

载体构建质粒构建步骤有哪些？载体构建过程：1、引物设计2、⽬的⽚段选取：RNA提取、RNA反转录、PCR扩增、PCR产物纯化3、双酶切4、连接:T4 DNA ligase连接或者同源重组连接（新贝⽣物：#B101、#B102）5、转化6、菌落PCR7、测序：1)摇菌；2)送样; 3)⽐对；8、菌种保存：菌种⽐对成功，则可保存菌种备⽤。

9、质粒提取：菌种⽐对成功，冻存菌种后，菌液⽤于提取质粒。

⼀、载体构建基本原理分、切、连、转、筛1、分：分离出要克隆的⽬的基因及载体。

2、切：⽤限制性内切酶切割⽬的基因和载体，使其产⽣便于连接的末端。

限制性内切酶：是⼀类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸⽔解酶。

限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三⼤类。

其中Ⅱ型酶能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内切割，产⽣特异性DNA⽚段，是DNA 重组技术中常⽤的酶。

Ⅰ型酶：具有修饰和切割功能，⽆固定切割位点Ⅲ型酶与Ⅰ型类似，能识别特异位点，但切割位点在识别位点以外Ⅱ型酶特点：①识别顺序⼀般为4－6个碱基对②识别顺序具有180度的旋转对称性，呈完全的回⽂结构③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割，可产⽣两种不同末端：平末端，粘末端平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时切割形成平末端，如：SmaI5’－CCC GGG－3’ 5’－CCC GGG－3’3’－GGG CCC－5’ 3’－GGG CCC－5’5′突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割DNA双链，于对称轴的5 ′末端切割产⽣5 ′端突出的粘性末端，如：Hind Ⅲ5’―AAGCTT―3’ 5’― A 5’－AGCTT―3’3’―TTCGAA―5’ 3’― TTCGA－5’ A―5’3′突出粘末端:与5′突出粘末端作⽤相反，产⽣3 ′端突出粘末端，如：PstI5’―CTGCAG―3’ 5’―CTGCA－3’ G―3’3’―GACGTC―5’ 3’―G 3’－ACGTC―5’3、连：将切割后的⽬的基因和载体⽤T4 DNA连接酶连接或者同源重组⽅法连接。

构建质粒的步骤构建质粒是一种重要的实验技术，用于在细菌或其他生物体中携带和复制外源DNA。

下面将介绍构建质粒的步骤。

1. 选择质粒载体：首先需要选择适合的质粒载体。

质粒载体是一种环状DNA分子，可以自主复制并在宿主细胞中表达外源基因。

常用的质粒载体有pUC18、pBR322等。

选择适合的质粒载体需要考虑载体大小、复制起点、抗生素抗性基因等因素。

2. 获得外源DNA片段：外源DNA片段可以是来自其他生物体的DNA序列，也可以是人工合成的。

获得外源DNA片段的方法有PCR扩增、限制性内切酶切割等。

3. 切割质粒和外源DNA：使用限制性内切酶将质粒和外源DNA切割成互补的黏性末端。

确保切割后的DNA末端与质粒载体互补，以便进行连接。

4. 连接质粒和外源DNA：通过DNA连接酶将切割后的质粒和外源DNA连接起来，形成重组质粒。

连接时需要考虑连接缓冲液的条件和酶的适宜温度。

5. 转化宿主细胞：将重组质粒导入宿主细胞中，使其能够复制和表达外源基因。

常用的转化方法有热激转化、电击转化等。

转化后，需要在含有抗生素的培养基上筛选出含有质粒的转化子。

6. 确认质粒的构建：通过PCR扩增、限制性内切酶切割或测序等方法，确认质粒是否成功构建，并验证外源基因是否正确插入。

7. 大规模培养质粒：如果质粒构建成功，可以进行大规模培养，以获得足够的质粒量。

培养条件需要根据质粒载体的特性进行调整。

8. 提取质粒：使用质粒提取试剂盒等方法，从大规模培养的细菌中提取质粒。

提取的质粒可以用于进一步的实验研究或应用。

通过以上步骤，就可以成功构建质粒。

构建质粒是分子生物学研究中常用的技术手段，可以用于基因克隆、基因表达、基因敲除等研究中。

同时，构建质粒也是基因工程和生物工程的重要基础。

20170814质粒构建流程武汉大学Angelo一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。

使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用酶切位点。

3）选择载体。

根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。

如pMSCV，4）选择酶切位点。

对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。

载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。

5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子前的全部碱基。

6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。

一般选择三个保护碱基。

7）引物设计完成，送公司合成。

二、目的片段获取方法一：1. RNA提取2. RNA反转录获得目的片段方法二：从韩家淮实验室索取（通常采用）具体流程：1、PCR扩增PCR程序：95℃5min 95℃30s 58℃30s 72℃延伸（根据基因片段大小设定时间）35cycle 72℃5min 22℃保存注：可根据不同基因调节退火温度，延伸时间，循环数。

2、PCR产物纯化1）根据PCR基因的大小配制1%-2%琼脂糖凝胶，放电泳槽里，点样并电泳10-20min2）割胶回收（产物电泳结果含杂带）① 将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5ml EP管。

② 加等体积（1g=1ml）GC buffer ,65℃水浴10min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min，进行试剂盒回收③ 溶液加入回收柱中，12000rpm离心，1min，废液倒回再离一次④ 弃废液，加500μl washing buffer，离心12000rpm，1min ⑤ 弃废液，加500μl PW washing buffer，离心12000rpm，1min ⑥ 空管离心12000g，2min，弃废液，柱子转移到新1.5ml EP 管⑦加入30-50μl elution buffer于硅胶膜上，室温孵育2min，离心13000g，1min标上基因名称，日期⑧电泳检测三、载体和片段双酶切（分开酶切）20μl 反应体系如下片段：PCR纯化产物16μl FD buffer(10×) 2μl 酶A 1μl 酶B 1μl 反应条件：37℃水浴2h 加loading buffer（10×）终止反应注：buffer类别依使用的酶具体选择载体：载体质粒大于1.5ug并补ddH2O至16ul FD buffer(10×) 2μl 酶A 1μl 酶B 1μl 反应条件：37℃水浴2h或以上加loading buffer（10×）终止反应注：buffer类别依使用的酶具体选择四、载体酶切产物回收和纯化片段一般不进行胶回收，只进行回收柱纯化1）一般配制1%琼脂糖凝胶，放电泳槽里，点样并电泳20-30min（琼脂糖凝胶配制：琼脂糖凝胶（1%）30ml 琼脂糖粉0.3g 1×TAE 30ml 微波炉加热溶解，冷却一会儿后加入1μl gold view核酸染料或溴化乙锭（有毒），混匀，倒板，插梭子。

构建质粒详细步骤在基因工程中，构建质粒是一项基础且关键的任务，以下是构建质粒的详细步骤。

1.目的基因获取首先，需要获取目的基因。

目的基因可以通过引物设计和克隆载体构建的方法获得。

引物设计是根据目标基因的序列，通过软件辅助设计出一对特异性引物。

克隆载体构建则是根据目标基因的特点，选择或构建一个适合的克隆载体，以便于目的基因的获取和后续操作。

2.载体质粒选择在获取目的基因之后，需要选择一个合适的载体质粒。

载体质粒的选择应考虑以下几个因素：质粒来源（如细菌、酵母等）、质粒大小（合适的大小能够确保插入的目的基因稳定存在并且可复制）、质粒序列（序列应清晰、稳定，以确保质粒的准确性）。

3.酶切质粒和目的基因获取到的质粒和目的基因需要进行酶切处理。

这一步骤主要是为了将目的基因插入到质粒中。

通常使用限制性内切酶对质粒和目的基因进行酶切，并且需要控制酶切时间和温度，以确保酶切效果良好且不会对DNA造成损伤。

4.T4DNA连接酶连接酶切后的质粒和目的基因需要通过T4DNA连接酶进行连接。

T4DNA连接酶能够将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来。

在这个过程中，需要控制DNA的浓度、缓冲液的选择、反应温度以及是否过夜连接等条件，以确保连接的有效性和正确性。

5.转化受体细胞连接完成的质粒需要转化入受体细胞中。

常见的受体细胞包括细菌、酵母、昆虫等。

转化过程需要考虑受体细胞的类型、数量、转化效率和筛选策略等因素。

例如，对于细菌转化，需要选择感受态细胞作为受体细胞，并控制转化温度和时间以确保转化效率。

6.克隆筛选及鉴定转化后的受体细胞需要进行克隆筛选和鉴定，以找出含有正确插入目的基因的克隆。

筛选和鉴定可以通过菌液制备、抗体制备、筛选策略和鉴定方法等步骤实现。

例如，可以通过菌落PCR或抗药性筛选策略筛选出阳性克隆，并采用DNA测序等技术对阳性克隆进行鉴定。

7.质粒大量制备最后，需要对筛选出的阳性克隆进行大量制备质粒的操作。

这一步骤通常采用碱裂解法或热法等常规方法制备质粒。

同源重组构建质粒步骤
同源重组构建质粒是一种常用的基因工程技术，用于将外源基因插入到质粒中。

以下是同源重组构建质粒的一般步骤：
1. 选择合适的质粒载体：根据实验需要选择适当的质粒载体，通常选择含有适当多个限制酶切位点的质粒。

2. 执行酶切反应：将选定的质粒载体进行限制酶切反应，使用限制酶切酶将质粒切割为线性片段。

3. 扩增外源基因：使用PCR等技术扩增所需的外源基因片段，同时设计引物使得其两端带有与质粒载体的酶切位点相同的序列。

4. 接头连接：将扩增的外源基因片段与酶切后的质粒片段进行连接，使用连接酶将二者进行连接。

连接酶可以是T4 DNA连接酶等。

5. 转化宿主细胞：将连接后的质粒导入到合适的宿主细胞中，常用的宿主细胞包括大肠杆菌等。

6. 选取转化子：利用筛选法选择成功转化质粒的宿主细胞，可以使用抗生素等抗性筛选方法。

7. 确认质粒插入：通过PCR、酶切等方法对转化细胞进行筛
选和验证，确认质粒中外源基因的插入情况。

8. 提取质粒：从筛选验证通过的细胞中提取质粒，通常使用质粒提取试剂盒等方法进行质粒提取。

9. 验证质粒：通过测序等方法验证质粒中外源基因的序列，确认构建成功。

以上步骤仅为一般的同源重组构建质粒步骤，具体实验操作可能因实验设计和需求的不同而有所差异。

（lnc2为例，lnc2分三段连接，GTP1、GTP2、GTP3(具体见文档“lncRNA4构建质粒的基本步骤：和lncRNA2的实验说明”中lnc2的部分)）基本流程：设计三个片段的引物（设计时注意载体pcDNA3.1的酶切位点）普通PCR 琼脂糖凝胶电泳后胶回收酶切电泳后胶回收酶连转化涂板挑单菌落（10管）摇菌提质粒酶切初步鉴定测序具体步骤：1、设计引物2、先将GTP1进行普通PCR(三个片段的模板分别为单独连接有该片段的质粒)，扩增条件聚合酶的说明书上有，50μl体系。

3、制胶（琼脂糖凝胶），将PCR产物全部上样，电泳（电泳液要新配置）45min左右后放紫外灯下，用干净刀片切出目的片段放置干净EP管，紫外灯每次照射时间不能太长。

4、用胶回收试剂盒回收，具体步骤见说明书。

5、胶回收后，用Nhe I，Kpn I两种酶将胶回收产物和载体pcDNA3.1进行双酶切5小时。

6、制胶，将酶切产物全部上样，跑电泳，胶回收（同步骤3、4）7、配酶连体系（见文档“分子生物学反应体系”），反应条件见连接酶说明书。

一般4℃过夜8、转化，（具体步骤见文档“分子生物学反应体系”）9、挑单菌落，10管，在加有氨苄的LB的试管中培养12~16h,37℃,140rpm.10、小提质粒（具体步骤见质粒提取试剂盒说明书）11、根据片段设计相关酶进行酶切鉴定，刷选出目的质粒，送去测序12、GTP1连上去后，GTP2、GTP3也与上述方法一样进行操作，只是GTP2的载体变为pcDNA3.1-- GTP1，GTP3的载体变为pcDNA3.1-- GTP1-- GTP2，同时相关的双酶切的酶也不同，GTP2片段时用Kpn I，BamHI。

GTP3片段时用BamHI，Xho I。

质粒构建流程质粒构建是分子生物学实验中常见的一项重要技术，它可以用于基因克隆、蛋白表达、基因编辑等多个领域。

在本文中，我们将介绍质粒构建的基本流程，希望能够帮助大家更好地理解和掌握这一技术。

第一步，设计引物。

质粒构建的第一步是设计引物。

引物是一小段单链DNA，它们的序列与目标DNA的两端相互补。

在构建质粒时，我们需要设计两对引物，分别用于扩增目标DNA的两端。

引物设计的好坏将直接影响到后续的实验效果，因此需要仔细选择引物的序列，确保其具有高度的特异性和稳定性。

第二步，PCR扩增。

设计好引物后，接下来就是进行PCR扩增。

PCR是一种体外合成DNA的方法，通过PCR扩增可以在短时间内获得大量目标DNA。

在PCR反应中，我们需要将待扩增的DNA模板、引物、DNA聚合酶和反应缓冲液混合，然后进行一系列的温度循环，最终得到目标DNA的扩增产物。

第三步，酶切和连接。

获得PCR产物后，接下来需要进行酶切和连接。

酶切是利用限制性内切酶在特定的酶切位点上切割DNA分子，从而得到特定的DNA片段。

在质粒构建中，我们通常会选择两种不同的限制性内切酶，分别用于酶切目标DNA和质粒载体。

然后将酶切后的目标DNA 片段与质粒载体连接，形成重组质粒。

第四步，转化和筛选。

最后一步是将重组质粒转化至宿主细胞中，然后进行筛选。

转化是利用化学方法或电穿孔法将质粒导入宿主细胞内，使其在细胞内进行复制和表达。

然后通过对转化后的细胞进行抗生素筛选或荧光筛选，筛选出含有目标重组质粒的细胞克隆。

总结。

质粒构建是一项复杂而又重要的实验技术，它涉及到许多分子生物学的基本原理和实验操作。

通过本文的介绍，相信大家对质粒构建的流程有了更清晰的认识。

当然，质粒构建的具体操作还需要根据实验的具体要求和目的进行调整和优化。

希望本文能够为大家在质粒构建实验中提供一些帮助和指导。

一，引物设计:1,选择合适的载体。

酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒）。

2，在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。

1，使用word2，设计引物：primer-upPrimer-down3，核对----送公司合成。

4，对公司合成的引物离心，10000rpm、5-10分钟、at 4℃，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（2dH2O），再把上游引物和下游引物混在一起，at 4℃保存。

二，PCR（P出目的片段）：（一）、从韩家淮实验室赠送的菌液里P出目的片段：12ul韩家淮实验室的菌液，相应的抗生素94℃ 5min菌液1ul 94℃ 30sec2x PFU mix 25ul 58℃ 30secPrimer 1ul 72℃ X min2d H2O 23ul 72℃ 5min（X是根据片段的长度设定，500-1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值2℃）3，跑胶、回收:（1），配胶：称的琼脂糖加入60ml的1X TAE加入的EB()25分钟后，即可点样跑胶。

（2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。

（3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）4，做胶回收（天根{TIANGEN}公司的DNA纯化回收试剂盒）: 按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，Elution Buffer预先在55-65℃温箱中水浴，并且在加过EB后，放在37℃温箱中2min。

对胶回收的产物跑胶验证。

可建立10ul的体系：回收产物2ul、10xloading buffer 2ul、2d H2O 6ul。

三，酶切、链接：1，目的片段酶切：（37℃酶切过夜或者4小时）insert ：上述胶回收产物35ul10 x H buffer（）7ul50ul的体系 dd H2O 6ul酶1 1ul酶2 1ul2，载体酶切：（37℃酶切过夜或者4小时）Vector （1ug/ul）：2 ul10 x buffer（）3ul20ul的体系dd H2O 13ul酶1 1ul酶2 1ul为方便以后使用，载体可以一次性多切点。

质粒构建流程一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。

使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。

3）4）选择酶切位点。

对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。

载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。

5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。

6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。

一般选择三个保护碱基。

7）引物设计完成，送公司合成。

二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒：Bioteke高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存）准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤：1）将1000 Hl裂解液RL加入细胞中，混合5min。

2）加200 Hl氯仿混合，震荡15$,室温孵育3min。

3）4℃, 12000rpm 离心 10min。

4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550 H1）5）加入1倍体积（550 H1） 70%乙醇，混匀6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃, 10000rpm离心45s7）弃废液，重套收集管，加500 Hl去蛋白液RE, 12000rpm离心45s8）弃废液，重套收集管，加700 H l去漂洗液RW, 12000rpm离心60s9）弃废液，重套收集管，加500 H l去漂洗液RW, 12000rpm离心60s10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min11）吸附柱放入新EP管，加50 Hl RNase free water于膜上，室温放置2min12）4℃, 12000rpm 离心 60s13）点样：5Hl RNA+ 1 H l 10X14）-20℃保存2. RNA反转录试剂盒： TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser （-20℃保存）准备：冰盒，②④⑤⑥取出解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管操作步骤：1）基因组DNA去除（10Hl体系）② 5XgDNA eraser buffer 2Hl① gDNA eraser 1HlTotal RNA 4Hl （可根据RNA浓度调整）⑥ RNase free water 3HlPCR仪中进行，程序：42℃, 2min f4℃注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入2）反转录反应（20Hl体系）④5XprimerScript buffer 2 4ul⑤primerScript RT enzyme mix I 1ul⑥RT primer mix 1ul⑦RNase free water 4ul1）反应液10 HlPCR 仪：37℃, 15min—85℃, 5s―4℃注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中-20℃长期保存3.PCR扩增高保真酶primerstar扩增，50 Hl体系如下：5XPS buffer 10Hl PCR程序：dNTP 4Hl 95℃5minHl 95℃30sHl 56℃30s , 35cyclecDNA 1 H l（可变）72℃1minR-primer 1Hl 72℃10minF-primer 1 H l 注：可根据不同基因调节退货温度，延伸时点样：5Hl PCR 产物+ iHl 6X4.PCR产物纯化1）液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）试剂盒：Microelute cycle-pure spin protocol（OMEGA bio-tek） D6293-01①②转移至HiBind MicroElution DNA柱（套收集管），室温离心10000g, imin。

质粒构建流程1(总7页)质粒构建是现代分子生物学研究中非常关键的一步。

在细菌中将需要表达的外源基因通过质粒表达，已经被广泛应用于蛋白表达、基因功能分析和疫苗研究等方面。

下面我们将详细介绍质粒构建的流程。

一、质粒选择在进行质粒构建之前，首先要根据实验需求选择适合的质粒。

目前常用的质粒有pUC19、pET系列、pcDNA3.1等。

选择质粒时需要考虑以下因素：1. 质粒大小：不同质粒大小不同，承载的基因段数也不同，需要根据实验需要选择适合的大小。

2. 引物、酶切位点：质粒上的引物和酶切位点需要考虑是否符合实验设计，方便后面的操作。

3. 表达宿主：质粒表达需要宿主细胞，不同宿主细胞适合表达的质粒不同，需要根据实验需要选择适合的宿主细胞。

4. 表达标签：如果需要通过表达检测蛋白质，可以选择带有表达标签的质粒，如His 标签、Flag标签等。

5. 细菌抗性标记：质粒需要选择带有适当的细菌抗性标记，方便后续筛选。

二、PCR扩增目的基因在选择了适合的质粒之后，需要将需要表达的目的基因进行PCR扩增，以得到DNA模板，方便后续质粒构建过程。

PCR扩增需要根据实验目的设计合适的引物，引物需要选择在基因片段两端的序列上。

一般情况下，引物序列长度为18-30bp，并且需要避免序列间存在重复。

此外，引物需要考虑跨越的酶切位点，方便后续克隆操作。

PCR反应体系一般包括模板DNA、引物、Taq DNA聚合酶、缓冲液和dNTPs等。

反应条件为94℃预变性2-5min，94℃变性30s，温度根据引物长度而定，一般为55-65℃，延伸时间1-3min，72℃合成外显子，最后72℃固定3-5min。

扩增反应可以根据需求选择合适的引物、反应体系和行程。

三、酶切质粒酶切质粒是将已有质粒经过酶切后得到的线性化质粒。

酶切需要选择适合的内切酶切割质粒，切割后的末端需要具有互补的序列，以方便后续的连接操作。

酶切反应需要同时加入酶和反应缓冲液，反应条件需要根据不同酶而定。

II.质粒的构建（1）扩增全长（touch down PCR）退火温度逐渐降低的PCR，设PCR程序的时候，可以将退火设为每个循环-0.5度或更慢的降低。

先用高温扩5-10个循环，再用低温扩增15-25个循环，这样也是广义上的touchdown。

原理就在于，温度的升高提高了PCR扩增的特异性，但也提高了引物结合的难度，降低了扩增的效率，因此一开始先用高温扩增，保证扩增的严谨性，待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，提高扩增的效率（此时非特异的位点由于丰度低，无法和特异位点竞争）。

1.准备PCR反应溶液：向微量离心管中依次加入上游引物 0.5uL下游引物 0.5uLcDNA 0.5uLddH2O 11uL2*MasterMix 12.5uL2.PCR程序设置LID=104度step1 94度 5minstep2 94度 30sstep3 71度 1min （-0.7℃）step4 72度 1min go to step2 15cyclesstep5 94度 1minstep6 61度 1minstep7 72度 1min go to step5 25cycles . . . . step8 72度 10min3.结束反应，PCR产物放待电泳检测或-20℃长期保存。

（2）PCR产物跑胶切胶回收在紫外灯下切出还有目的DNA的琼脂糖凝胶，切胶时尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。

切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。

切碎胶块。

胶块切碎后可以加快胶块融化时间，提高DNA的回收率。

称量胶块重量，计算胶块体积。

计算胶块体积时，以 1 mg=1 μl 进行计算。

向胶块中加入胶块融化液 Buffer GM，Buffer GM的加量如下表：凝胶浓度 Buffer GM使用量1.0％ 3 个凝胶体积量1.0％～1.5％ 4 个凝胶体积量1.5％～2.0％ 5 个凝胶体积量Buffer G与胶块均匀混合后室温15-25℃融化胶块（胶浓度较大或比较难溶时可以在37℃加热）。

质粒构建流程一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。

使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。

3）选择载体。

根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。

如pcDNA3.1(+)，4）选择酶切位点。

对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。

载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。

5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。

6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。

一般选择三个保护碱基。

7）引物设计完成，送公司合成。

二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存）准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤：1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。

2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。

3）4℃，12000rpm离心10min。

4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl）5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s7）弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s9）弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min11）吸附柱放入新EP管，加50μl RNase free water于膜上，室温放置2min12）4℃，12000rpm离心60s13）点样：5μl RNA+ 1μl 10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。

scramble质粒构建Scramble质粒构建是一种基因工程技术，用于改变DNA序列，从而实现对目标基因的研究和应用。

在这种技术中，通过将不同的DNA片段随机组合，生成一个新的质粒序列，从而产生多样性和变异性。

Scramble质粒构建的基本步骤包括：1. 选择目标基因：首先需要确定要研究或应用的目标基因。

这个基因可以来自任何生物体，包括细菌、植物、动物等。

2. 分离DNA：将目标生物体中的DNA提取出来，并进行纯化和浓缩。

3. 切割DNA：使用限制性内切酶将DNA切成小片段，并进行电泳分离。

这样可以得到多个不同大小的DNA片段。

4. 随机组合：将不同大小的DNA片段随机组合，并使用连接酶连接它们。

这样可以得到一个新的质粒序列。

5. 转化宿主细胞：将新构建的质粒转化到宿主细胞中。

宿主细胞可以是大肠杆菌等常见实验室细菌。

6. 筛选正常克隆：通过PCR、限制性内切酶切割等方法筛选出正常克隆，确认新构建的质粒序列。

Scramble质粒构建的优点是可以产生多样性和变异性，从而扩大了基因工程的应用范围。

例如，在药物研发中，可以通过Scramble质粒构建来寻找新的药物靶点；在农业领域中，可以通过Scramble质粒构建来改良作物品种等。

然而，Scramble质粒构建也存在一些缺点。

首先，由于随机组合的过程是不可控的，可能会产生无用或有害的序列。

其次，在转化宿主细胞时，新构建的质粒可能会与宿主细胞染色体发生重组，导致不稳定性和不可预测性。

总之，Scramble质粒构建是一种有潜力的基因工程技术，可以用于改变DNA序列，并产生多样性和变异性。

在应用中需要注意其缺点，并采取相应措施来减少风险。