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病原生物学实验技术课程内容实验一细菌的分离培养和保存1.菌种的保存目的：①科研：保证研究结果具备良好重复性；②生产：制备诊断抗原和免疫血清；③实验：质控所必需，新配置的试剂需要用标准菌株来做质控。
2.菌种保存的原理：使其生长繁殖受到抑制的休眠状态，减少菌种的变异。
3.菌种保存原则：①长期保证菌种原有性状和活力不变；②考虑保存方法的简便和经济。
4.菌种常用措施：①降低培养基营养成分；②低温、干燥、缺氧、避光；③添加保护剂。
5.菌种保存方法（保存方法、使用范围、优缺点）⑴传代培养保存法：优点：不需要很特殊的设备，操作容易，可随时观察细菌是否存活，是各微生物实验室采用的基本保存方法。
缺点：①保存期限短：需经常传代，易发生变异和杂菌污染；②细菌活力易受影响：培养基成分、温度的微小变化；③需定期移种：保管多种菌株时费力、费用高，占用地方多。
防止变异的措施①控制传代次数：避免不必要的移种和传代；②用典型菌落传代：每次传代时，可用平板划线分离的方法；③选择合适的培养条件：选择一个适宜原种生长的条件可以防止菌种的衰退；④选择合适的菌种保存方法：需要长期保存，应采用冻干法或液氮保存：半固体穿刺法：适用于大多数对营养要求不高的细菌。
保存期限2个月。
斜面保存法：广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的短期保存。
放线菌、霉菌和有芽胞的细菌2－4个月，无芽胞细菌1个月，酵母菌2个月，假单胞菌半个月液体保存法：适用于厌氧菌（庖肉培养基）、链球菌、白喉杆菌、肺炎双球菌、钩体等。
厌氧芽胞杆菌约2个月，无芽胞的细菌约3周液体石蜡保存法：适用于保存真菌、酵母菌和放线菌，对保存细菌的效果较差。
方法：在培养成熟的菌种斜面上，加入灭菌并已将水分蒸发掉的液体石蜡，油层高过斜面末端1cm，封口后以直立状态在室温或4℃冰箱保存。
保存期可达数年。
注意恢复使用时，由于菌体外仍粘有石蜡油，故生长较慢，且有粘性，一般要再移种2~3次才能得到良好的菌种。
⑵低温保存法保存期限约一年，有些菌种可长达10年对容易死亡的无芽胞厌氧菌特别适用，大多数能存活数年，对放线菌的保存也很有效在实际应用中，本法比冷冻干燥法更为方便注意事项：①用此法保存细菌，菌浓度较高时，生存率高，保存期长；②冷冻保存菌融化后，不能继续低温保存，应重新制作菌悬液后再低温保存。
⑶冷冻真空干燥法原理：低温下快速将微生物细胞或孢子悬浮液冻结，然后在真空状态下使水分升华将样品干燥，使微生物处于休眠状态，得以长期保存。
除了只生菌丝不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其它多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用此法。
步骤：优点：同时具低温、干燥、缺氧的菌种保存条件，无需经常传代，保存时间长，存活率高，变异率低，是目前最有效的菌种保存方法之一。
缺点：操作繁琐，技术要求高，需要的设备较昂贵，一般的实验室较少使用。
⑷液氮超低温保存法原理：让生物细胞在液氮超低温的状态下冻结，为减少超低温冻结时所造成的损伤，要先将生物细胞悬浮在合适的保护剂中。
常用保护剂：羊(兔)全血，10%(20%)甘油，10%二甲基亚砜优点：适用范围最广，可保存病毒、噬菌体、立克次氏体、各种细菌、放线菌、真菌、螺旋体、丝状菌甚至动物细胞，操作简便，保存效果好，保存期限长，是目前最有效的菌种长期保存技术之一缺点：液氮消耗量较多6.菌种保管的注意事项①菌种经鉴定后，选用适当方法及时保存；②标签牢固（编号、代次，批号，日期）；③不同属或同属的强弱毒株不可同时在同一无菌室内操作；④保存范围、转移、销毁要遵守卫生部规定；⑤专人负责，每种一卡。
7.细菌的分离培养临床常见标本初分离细菌应选用的培养基种类8.细菌的接种方法①平板划线法：从混合培养物中分离单个菌落分区划线法（含菌量多）连续划线法（含菌量少）②斜面接种法：纯化培养和保存菌种③穿刺接种法：保存菌种和观察动力④液体接种法：肉汤增菌和糖发酵试验⑤涂布接种法：菌量计数和药敏试验9.细菌的培养方法①需氧培养：用于各种需氧菌和兼性厌氧，细菌检验中最常用的方法。
②CO2培养法：用于分离培养需要CO2气体生长的细菌，脑膜炎奈瑟菌、布鲁菌、淋球菌，烛缸法。
③厌氧培养：用于分离培养专性厌氧菌，焦性没食子酸法、厌氧罐法、厌氧袋法、厌氧箱培养法等。
实验二病毒基因组遗传进化分析1.病毒的进化：病毒的由来、存在及其发展演变的过程、特征和规律。
2.研究病毒进化的难度：病毒特别微小；病毒没有化石；病毒进化的随机性强。
3.病毒（Virus）是形态最微小、结构最简单的微生物。
因其体积微小，必须用电子显微镜放大几万至几十万倍后方可观察；结构简单表现为无完整的细胞结构，仅有一种类型核酸（RNA或DNA）作为其遗传物质。
特点：从进化的角度来说,病毒是高度的进化的生物,并仍在不断的进化。
病毒一般只编码从宿主细胞中不能得到的功能,除功能基因外很少浪费基因组序列。
意义：通过研究现存的病毒,希望了解病毒的起源和进化历程,预示病毒特别是人类病毒未来的变异和进化方向,需要了解随着环境因素的变化,病毒将如何变异、变异的速度、选择压力等,从而能有效地控制和避免人类和动物病毒病的爆发。
4.两种类型的病毒:①以DNA为遗传物质的病毒；②以RNA为遗传物质的病毒。
一般认为它们有着不同的起源和不同的进化.5.病毒起源的学说：病毒起源：病毒或遗传物质从它的前身大分子中独立出来进行自主复制和进化的时候,称为病毒起源。
三类起源学说：①退化性学说；②病毒起源于宿主细胞中的DNA和RNA成分的学说；③病毒起源于具有自主复制功能的原始大分子学说。
6.研究病毒分子进化的有关方法：单基因进化树；基因组的排列与进化研究；基因组的基因组成与进化研究。
⑴利用核苷酸或蛋白质序列绘制单基因进化树①在构建进化树时，首先利用计算机程序对具有多个同源基因的核苷酸或蛋白质序列进行同源序列的优化排序，然后利用定量分子系统学的方法，如邻接法、最大简约法等，构建出单基因的进化树，从而预测相对应的物种。
②利用单基因序列做出的进化树，可以用来研究病毒的亲缘关系、进化速率和流行病学分析。
③单基因进化树在相当程度上可能不能反映病毒的进化，而仅仅代表了基因的进化。
⑵基因组的排列与进化研究①利用基因组的排列顺序做进化树：基因组上基因的排列顺序可以通过一定的方法构建成进化树。
比如2001年，Herniou等人利用相对断裂点矩阵法和邻近基因配对法构建了杆状病毒基因组进化树。
②与单基因进化树相比，它们从另一个侧面反映了基因组的进化规律，也就是基因组的重排现象。
⑶基因组的基因组成与进化研究通过对基因组中基因的组成分析，了解在病毒的进化过程中，病毒基因的进化过程，为进一步研究基因功能鉴定良好的基础。
7. DNA病毒的进化影响DNA病毒的进化的因素①突变和重组影响病毒基因组产生进化的主要动力是突变和重组。
由于病毒变异频率快、短时间能复制许多代、会产生一些缺陷性病毒,导致病毒变异快。
变异导致病毒生物功能的巨大变化，从而改变了病毒与宿主细胞的关系，面对新宿主的选择压力成为迫使病毒进化的原因之一。
②由于基因组大小的限制所产生的进化约束基因的倍增：病毒的外壳对病毒的基因组的大小产生了限制，而病毒基因组上很少有非编码序列存在。
许多基因家族是靠基因倍增和漂移所产生，但因基因组缺少空间，这类基因会在病毒进化中丢失.8. RNA病毒的进化RNA病毒超家族⑴RNA病毒可以看作是一类特殊的mRNA分子。
有三大组：①正链病毒：基因组能直接翻译成蛋白质，不含蛋白质的基因组有感染性.②负链病毒：基因组为mRNA的互补链能，必须先转录才能翻译.③双链病毒⑵根据序列的同源性，RNA病毒被组合成几个超家族。
⑶同一家族的不同病毒被视为来源于同一祖先。
所有的RNA病毒可以用几个超家族来涵盖，说明RNA病毒的起源在地球上生命的进化史中可能只出现过几次。
⑷事实上，RNA病毒在进化史上可能只有一次起源，目前所有的RNA病毒可能是由一个原始的病毒经过分化、重组、基因复制而产生的。
RNA病毒的分歧速率①数据表明:RNA病毒的进化速度比宿主的进化速度快。
②主要是它的突变频率比宿主细胞大约高4个数量级。
③快速变异率使得人们推断，现存的具有复制蛋白序列同源性的动、植物RNA病毒在进化上相互分离的时间要远晚于植物与动物分离的时间。
RNA病毒变异发生的机制①突变病毒变异与进化的主要原因是突变，特别是点突变，此外还有缺失突变和重排。
多数RNA聚合酶不具备错误修复能力。
错误发生率高。
突变基因组的存在有利于病毒迅速适应各类变化着的环境。
②重排两个具有分段基因组的病毒在产生子代病毒时将其遗传物质重新组合,称重排。
重排是具有分段基因组的病毒进化的一个机制。
在进化中,随着条件不同,病毒有时可以分散形成分段基因组，有时又可组成单一基因组，前者的优势是可以借助重排方便地进行遗传交换，而后者的优势是能将包含所有遗传信息的单一RNA分子便利地包装和运输。
③重组重组是两种不同来源的序列经过共价组合形成新的核酸序列。
RNA病毒重组现象并不普遍。
真核细胞一般不具RNA聚合酶，RNA病毒也不编码有利于重组的酶系统，但这并不意味着RNA病毒不发生重组。
9. 病毒进化的特征：①新病毒不断产生，基本上从另一种宿主的病毒演化而来；②新病毒产生后，在新宿主体内分化变异速度快；③新病毒稳定后，其毒力大多在中等水平；④病毒进化有一定随机性，又受选择压力而呈一定的方向性和稳定性；⑤病毒各基因在进化上具有不同的进化特征。
10.病毒与机体相互作用的进化关系对微生物的进化研究表明，任何具有感染能力的微生物（包括病毒）在其生存及增殖能力上的成功进化都取决于它的表型选择。
很显然，这样的表型选择起源于病毒的遗传可变性。
①对于病毒来说，基因突变的产生，实际上依然是由于在病毒感染过程中，病毒与宿主细胞的相互作用所形成的选择诱导效应，这类突变对病毒来说是常见的。
②对某些病毒而言，这类突变引起的表型变化并不明显，但对另外一些病毒，这类突变引起的表型变化极为显著，它常常形成直接的病毒抗原性、毒力的改变，其中最典型的例子就是流感病毒。
③这个RNA病毒的两个主要抗原成分（血凝素抗原和神经氨酸酶抗原）的变化周期之短暂、变化速度之快，令人类对他造成的疾病流行常常防不胜防。
④另外众所周知的人免疫缺陷病毒（HIV病毒）从其被发现以来的几十年间，基因突变导致抗原性漂移的速度也是极为明显的，以至于在一定程度上其疫苗研究屡屡受挫。
⑤病毒的基因突变以及其所导致的表型变化均是发生在其感染宿主细胞之后，尤其明显的是表现为此感染在宿主群体基本完成了一次流行之后。
⑥这很明显的提示，病毒的进化，无论其是有利于病毒的生存，还是不利于病毒的生存，或者如同前面所说的增加病毒毒力还是减弱病毒毒力，均取决于它与宿主细胞、个体、群体相互作用的感染过程。
