具抗肿瘤活性的海洋微生物菌株的初步筛选
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海洋微生物产生的抗肿瘤物质研究在当今医学领域中,癌症是一种全球性的重大疾病,已经成为世界范围内死亡率最高的疾病之一。
尽管人们已经在癌症治疗方面取得了一些进展,但仍然需要寻找新的治疗方法。
近年来,越来越多的研究表明,海洋微生物中的天然产物可能成为抗肿瘤药物的重要来源。
本文将重点讨论海洋微生物产生的抗肿瘤物质的研究进展和前景。
1. 海洋微生物的多样性及潜在应用海洋是地球上最大的生物资源库之一,其中包含着极其丰富的微生物群落。
由于海洋环境独特的物理、化学特性,海洋微生物具有广泛的生物多样性,并且产生了许多具有潜在应用前景的活性分子。
其中,包括对抗肿瘤活性的物质。
2. 海洋微生物产生的抗肿瘤物质的发现和鉴定目前,研究人员通过不同的方法和策略,如生物活性筛选、化学组合分析、基因组学等,发现了许多海洋微生物产生的具有抗肿瘤活性的物质。
这些物质中包括多种天然产物,如生物碱、多糖、脂质、蛋白质等。
通过进一步的鉴定和研究,研究人员已经发现了一些具有潜在抗肿瘤效应的分子。
3. 海洋微生物产生的抗肿瘤物质的机制研究抗肿瘤物质的机制研究是揭示其抗肿瘤活性的重要途径。
通过研究海洋微生物产生的抗肿瘤物质的作用机制,可以帮助我们更好地了解肿瘤细胞的发生和发展过程,并为新型抗肿瘤药物的开发提供重要的启示。
现阶段,研究人员已经发现了一些海洋微生物产生的抗肿瘤物质的机制,如抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、抗氧化、调节免疫等。
4. 海洋微生物产生的抗肿瘤物质的应用前景海洋微生物产生的抗肿瘤物质具有广泛的应用前景。
这些物质可能成为新型的抗肿瘤药物或为现有的抗肿瘤药物提供辅助治疗。
目前,已经有一些海洋微生物产生的活性物质进入了临床试验阶段。
例如,海洋微生物产生的抗肿瘤物质某某素已经显示出良好的抗肿瘤活性,并在临床试验中取得了一定的进展。
5. 未来的研究方向和挑战尽管目前已经取得了一些进展,但海洋微生物产生的抗肿瘤物质的研究仍面临一些挑战。
例如,海洋微生物产生的抗肿瘤物质的提取和纯化过程仍然较为困难,且目前还没有找到高效的合成方法。
从海藻和植物中发现抗菌和抗肿瘤活性化合物目前,新药尤其是抗生素,急切需要解决病原体抗性的问题,其中大自然拥有最丰富的新抗生素来源,因此,从天然资源中寻找具有显著生物活性的天然产物仍然是发现新药先导化合物的主要途径。
此外,抗生素在生物工程合成领域和化学合成领域也有相当大的进步。
海洋为海洋生物提供了巨大而多样的栖息地。
海洋因其具有不断变化的温度,压力,盐度和金属浓度等因素,使得成为海洋植物和藻类产生新化合物的环境来源。
独特的海洋环境中生长着种类繁多的海洋植物和藻类,这些生物能产生很多具有生物活性的天然产物,不少是在陆地上不曾发现的。
独特的海洋生物使得海洋天然产物具有显著多样性。
近几十年来,海洋天然产物因其多样的生物活性和用途而备受关注。
据文献报道,已从海洋来源中分离出16000个天然产物,包括萜类化合物、甾体化合物、酚类化合物、生物碱-多糖复合物、多肽类化合物、聚酮类化合物、脂肪酸类化合物和甘油类化合物,到目前为止有6800篇出版物。
海洋环境中包含数量众多的微观和宏观有机体种类,特别是海洋植物和藻类被证实具有产生结构独特的次级代谢产物的能力。
植物在海洋世界中,在耐火生物材料的再循环上发挥重要的生态作用,并且在药学应用中能够生产新颖的次级代谢产物。
尽管海洋微生物能产生多种次级代谢产物,它被认为是抗生素的顶级生产者,同时也是制药工业的重要提供者,但在生产抗生素的总量上,海洋植物占最大份额。
海洋植物生长于各种环境中,其中不乏有生存压力,并且它们有能力产生次级代谢产物也是众所周知的。
因此,海洋生物产生的次级代谢产物的生物合成途径和酶反应系统与陆地生物相比有着巨大的差异,导致海洋生物往往能够产生一些化学结构新颖、生物活性多样、显著的先导化合物,为新药研究提供大量的模式结构和药物前体。
海洋是地球上最具多产的生态环境,生长其中的植物次级代谢产物具有相当高的多样性。
自早些时候以来,许多研究人员着眼与从陆地到海洋或淡水的藻类化学成分,尤其是绿藻类,它们有望在营养品和制药行业中被开发利用为功能活性物质;在广泛的陆生植物上研究了这些绿藻代谢产物的化学性质。
海洋微生物的抗肿瘤药用价值引言:随着环境污染的加剧和人类寿命的延长,心脑血管疾病、恶性肿瘤等疾病日益严重地威胁着人类健康,与此同时新的疾病又不断出现,而细菌的抗药性问题也日趋严重,寻找新型药物已经成为十分迫切的任务。
由于陆地资源的不断开发,发现新型生物活性物质的可能性日趋减少,于是人们纷纷将目光投向海洋,特别是寻找抗肿瘤药物,从海洋中取药已经成为各国医药研究的新方向。
从海洋中取药:海洋的特殊环境如高压、低营养、低温(特别是深海)、无光照以及局部的高温和高盐等,造成了海洋微生物的多样性和特殊性。
美国海洋生物实验室研究表明,海洋微生物种类多达1000万种以上。
而目前所研究和鉴别过的海洋微生物还不到海洋微生物总量的5%。
由于海洋微生物具有独特的代谢途径和遗传背景,故可产生出不同结构和功能的天然活性物质,为寻找能解决目前疑难杂症(如恶性肿瘤)的药物提供了丰富的资源,也为微生物工业化生产新药开辟了一条崭新道路。
海洋微生物中抗肿瘤活性物质主要有三个来源,分别是海洋放线菌、海洋细菌和海洋真菌。
海洋放线菌:⏹放线菌是一类比其他微生物具有更为丰富的生物活性物质的生物资源,也是海洋微生物中抗肿瘤代谢产物的重要来源之一。
⏹海洋放线菌主要包括链霉菌属、小单孢菌属以及红球菌、诺卡氏菌、游动放线菌等稀有属种。
⏹应用于临床的微生物药物中,大部分来源于放线菌的次级代谢产物,并仍不断有新的发现。
在放线菌产生的有使用价值的药物中,抗菌药物较多,其次为抗肿瘤药物。
⏹海洋放线菌ACMA006属于链霉菌属 ,其发酵液对多种肿瘤细胞株都具有很强的细胞毒性,能诱导肿瘤细胞凋亡;有良好的抗肿瘤活性。
从发酵液中分离得到2种抗肿瘤活性化合物,放线菌素D以及放线菌素D的衍生物能够激活细胞凋亡程序诱导癌细胞凋亡,通过诱导细胞凋亡而杀死肿瘤细胞海洋细菌:⏹海洋细菌是海洋微生物抗肿瘤活性物质的另外一个重要来源。
主要集中在假单胞、弧菌属、微球菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属和别单胞菌属。
生物制造工艺中的微生物菌株筛选与鉴定生物制造工艺是一种利用生物体的代谢活动,生产化合物、材料等物质的技术。
在生物制造过程中,微生物作为重要的生物体被广泛应用。
不同的微生物菌株具有不同的代谢途径和特性,为生物制造带来了多样性和可塑性。
微生物菌株的筛选和鉴定是生物制造过程中不可或缺的环节。
一、微生物菌株筛选微生物菌株筛选是确定在生物制造工艺中使用的微生物菌株的过程。
微生物菌株筛选的目的是筛选出能够在特定条件下有效产生目标化合物、并具有良好稳定性的菌株。
1. 初步筛选初步筛选是指对一批菌株进行初步筛选,以确定其是否适合进行后续的深入筛选。
初步筛选的方法包括:对微生物菌株进行外观观察、有机物分解能力检测、生长速度检测、耐受性检测等,以排除生长缓慢、低产量、对特定条件不敏感等菌株。
2. 深入筛选深入筛选是指对初步筛选后的微生物菌株进行深入筛选,以确定其是否可以产生目标化合物。
深入筛选需要进行以下几个方面的检测:(1)代谢通路鉴定:通过对微生物菌株代谢途径的鉴定,确定其是否具有产生目标化合物的代谢能力。
(2)生物活性检测:通过对微生物菌株抗菌、杀虫、抗肿瘤、抗氧化等生物活性的检测,确定其是否具有生产潜力。
(3)产量检测:通过对微生物菌株产生的目标化合物产量进行检测,确定其产量是否满足生产需求。
二、微生物菌株鉴定微生物菌株鉴定是对已经确认生产潜力的微生物菌株进行结构、生理、生化、分子生物学等多方位的检测,确定其属于哪一个物种、亚种以及亚型等级。
微生物菌株鉴定的目的是确保使用的微生物菌株的质量和稳定性。
1. 形态学和生理学特征鉴定形态学和生理学特征鉴定是通过对微生物菌株形态特征和生理学特征的描述,确定其属于哪一个物种。
形态学和生理学特征包括微生物菌株的菌落形态、色素特征、形态、大小、运动方式、传代过程等。
2. 生化特征鉴定生化特征鉴定是通过对微生物菌株进行化学反应、生化反应等测试,考察其在代谢途径中的特殊酶类的运作和产物的生成,进而确定其属于哪个物种和亚种。
海洋生物源天然产物的药理活性筛选海洋生物是地球上最为丰富多样的生物资源之一,拥有极高的生物多样性和独特的适应性,其中许多植物、动物和微生物生物因产生了丰富多样的天然产物而备受研究者关注。
这些海洋生物源天然产物具有潜在的药理活性,具备开发成新药的前景。
本文将介绍海洋生物源天然产物的药理活性筛选方法及其意义。
一、海洋生物源天然产物筛选方法1. 采集海洋生物样品:海洋生物源天然产物的筛选首先需要采集具备潜在药理活性的生物样品。
这些样品可以是海洋动植物的组织、细胞、体液或微生物的培养物等。
采集过程需要遵循保护海洋生物资源的原则,并确保样品的纯度和质量。
2. 提取和分离:从海洋生物样品中提取天然产物是药理活性筛选的基础步骤。
提取可以利用物理方法(如研磨、超声波等)或化学方法(如溶剂提取、萃取等)进行。
分离则是通过多种色谱技术(如柱层析、高效液相色谱等)和电泳技术(如凝胶电泳、毛细管电泳等)实现,以获得单一纯度的化合物。
3. 结构鉴定:提取和分离得到的单一化合物需要进行结构鉴定。
利用一系列分析技术,如核磁共振、质谱、红外光谱等,确定化合物的分子结构和功能基团。
这一步骤有助于后续药理活性筛选的解释和理解。
4. 药理活性筛选:得到化合物之后,需要进行药理活性筛选。
药理活性筛选包括体外实验和体内实验两个层面。
在体外实验中,常用的筛选方法包括抗氧化活性、抗炎活性、抗肿瘤活性、抗菌活性等。
而在体内实验中,常用的筛选方法包括小鼠模型、大鼠模型和小鼠移植瘤模型等。
二、海洋生物源天然产物药理活性筛选的意义1. 探索新药来源:海洋生物源天然产物具有丰富的化学结构和多样的药理活性,对于医学和药物研究而言具有重要意义。
通过药理活性筛选,有可能发现潜在的新药分子,拓展药物创新领域。
2. 提高药物研发效率:海洋生物源天然产物经过药理活性筛选后,有望提供备选的候选药物分子。
这有助于缩短新药研发周期,提高药物研发效率。
3. 解决重要疾病问题:海洋生物源天然产物具有广泛的药理活性,可应用于多种疾病的治疗。
海洋药用生物资源的发掘与开发案例分析近年来,随着全球医药行业的不断发展和人们对海洋资源的关注,海洋药用生物资源的发掘与开发成为了一个备受关注的热门话题。
海洋药物的研究具有巨大的潜力,不仅可以为人类健康提供更多选择,还可以为社会经济带来巨大的贡献。
本文将通过案例分析介绍一些海洋药用生物资源的发掘与开发的经典案例,以期为相关科学家和企业提供一些启示与借鉴。
案例一:珊瑚类物种在药物开发中的应用珊瑚是一种特殊的生物群落,广泛分布于全球海洋环境中。
近年来,科学家们发现珊瑚体内的生物活性物质具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种药理学活性,在药物发现领域拥有巨大的应用潜力。
例如,美国一家生物科技公司在研发方面取得了重要突破,利用珊瑚类物种提取出一种名为Lumisponge的生物活性物质,具有抗菌和抗肿瘤的活性。
此外,还有研究发现珊瑚内的某些化合物具有抗血小板凝聚、调节免疫系统的作用。
这些发现为海洋药物的开发提供了全新的可能性。
案例二:海洋微生物在新药研发中的应用海洋是地球上最大的生物圈之一,拥有丰富多样的微生物资源。
海洋微生物因其特殊的环境适应性和独特的生物代谢产物,成为了新药研发的热门领域之一。
一项研究发现,海洋微生物中的某些化合物具有抗菌和抗肿瘤的活性,并已成功应用于临床。
比如,美国一家制药公司利用从海洋微生物中分离出的化合物开发出了一种名为Ziconotide的新型镇痛药物,成为了慢性疼痛领域的重要突破。
此外,一些海洋微生物还被发现能够产生多种酶类,并广泛应用于生物工程和工业生产领域。
海洋微生物资源的发掘与开发为新药研发提供了新的思路和可能性。
案例三:海洋植物在美容保养中的应用除了生物医药领域,海洋植物也在美容保养领域发挥着重要作用。
一些具有保湿、抗氧化和抗衰老活性的海洋植物成分,如海藻、珊瑚藻等,被广泛应用于化妆品和护肤品中。
例如,一种名为Fucoidan的海藻多糖成分被发现具有卓越的抗氧化和抗皱效果,被用于抗衰老产品中。
海洋药物开发中的活性成分的微生物发酵研究通过对海洋环境中具有潜在药用价值的微生物进行研究和开发,海洋药物开发领域取得了显著的成果。
微生物发酵技术被广泛应用于海洋药物开发中,这是因为微生物能够产生各种具有生物活性的化合物,这些化合物对人类疾病具有潜在的治疗作用。
本文将重点讨论海洋药物开发中的活性成分的微生物发酵研究的相关内容。
海洋中的微生物是一种丰富的生物资源,它们在抗菌、抗病毒、抗肿瘤等领域具有巨大的潜力。
海洋环境的特殊性使得海洋微生物具有独特的生物特性,从而产生了一系列具有潜在药用价值的活性成分。
微生物发酵技术是一种利用微生物代谢产物的生产技术,通过对微生物进行培养和发酵,可以大规模获得生物活性物质。
因此,微生物发酵技术被广泛应用于海洋药物开发中。
微生物发酵的过程主要包括微生物菌种的筛选、培养条件的优化、代谢产物的提取和纯化等步骤。
首先,需要从海洋样品中筛选出具有生物活性成分的微生物菌种,这一步骤通常要经过多次筛选和鉴定,确保得到的菌种具有较高的活性和较好的生长性能。
接下来,研究人员需要对菌种进行培养条件的优化,包括培养基的配方、温度、pH值、发酵时间等因素的调控,以获得更高产量和更好的活性成分。
同时,为了提高发酵过程的生产效率,还可以使用一系列的生物工程技术,包括代谢工程、菌株改造等手段。
在成功培养出产生活性成分的微生物菌种后,还需要对其产生的代谢产物进行提取和纯化。
常用的提取方法包括有机溶剂提取、分液漏斗萃取、超声波辅助提取等。
提取后的混合物通常还存在其他杂质,需要通过一系列的分离和纯化手段,如色谱技术、逆流色谱技术、凝胶过滤技术等,得到纯净的活性成分。
这些纯净的活性成分可以进一步进行生物活性测试和进一步优化。
海洋药物开发中的微生物发酵研究面临一系列的挑战,其中包括微生物菌种库的建设、培养方法的优化、活性成分的纯化等问题。
微生物菌种库的建设是海洋药物开发的基础工作,海洋中的微生物菌种资源非常丰富,但如何有效地对其进行收集、保存和管理是一个重要的课题。
海洋微生物药物的开发和应用随着陆栖微生物在抗生素、酶、酶抑制剂等生物活性物质方面的大量开发和应用,寻找新种属或特殊性状的微生物及其代谢产生新型药物的难度越来越大。
于是最近几年人们把目光转向更具有药物开发前景的海洋微生物———海洋药物的重要资源[1]。
海洋是生命的起源地,不仅占地球表面积的71%,而且包含着地球上80%的生物资源。
海洋环境的多样性和特殊性如存在的高盐、高压、低温、低营养或无光照等特殊生态环境,共同造就了海洋生物种类的多样性和特殊性,其中海洋微生物种类就多达100万种以上,而目前所研究和鉴别过的海洋微生物还占不到海洋微生物总量的5%[2],其中日本近年来的大量研究发现约27%的海洋微生物具有抗菌活性[3]。
因此海洋微生物普遍具备耐盐、液化琼脂能力的同时还具有独特的代谢途径和遗传背景,产生出不同结构和功能的天然活性物质,所以这成为寻找特定目的海洋微生物及其药物的丰富资源,也为微生物工业化生产新药开辟了一条崭新道路。
1海洋微生物药物的开发和应用现状自从美国1967年提出“向海洋要药(Drug from the sea)”的口号开始,“蓝色药物”引起了各国的重视,短短几十年便有10000多种新型结构的化合物被发现,其中200多种已申请专利[4]。
海洋微生物药物作为海洋药物的重要组成部分同样取得了辉煌的成就,成功的例子是1945年从意大利撒丁岛分离到一株海洋真菌(顶头孢霉菌),它产生的头孢霉素已被开发成临床广泛应用的30多个品种如先锋霉素。
目前海洋微生物药物的开发和应用现状主要有以下几方面。
首先是海洋微生物在抗菌抗病毒类药物方面的开发和应用,它是陆栖微生物药物研究开发的延续和扩展。
药物的直接来源是从海水、海泥中筛选出的微生物代谢产物,可直接开发成新药或经修饰后成为新药,也可作为新药开发的先导化合物。
如厦门鼓浪屿附近海泥中筛选到的链霉菌亚种S. rut- gersensis subsp. Gulangyunensis产生的氨基糖苷8510-1抗生素临床应用表明对绿脓杆菌和革兰氏阴性菌有强抑制活性[5]。
微生物源抗癌活性物质的筛选与开发随着现代医学的不断发展,癌症已成为全球公共卫生问题之一。
虽然目前已有一些有效的抗癌药物,但其副作用和耐药性等问题依然存在。
因此,寻找新的抗癌活性物质成为了当今医药领域的重要研究方向之一。
而微生物作为一种重要的资源库,被广泛应用于新药开发中,其中的抗癌活性物质更是备受关注。
本文将探讨微生物源抗癌活性物质的筛选与开发。
I. 微生物源抗癌活性物质的筛选微生物作为一类广泛存在于自然环境中的生物体,具有多样性和广泛的生物活性。
微生物源抗癌活性物质的筛选工作通常是从大量的微生物菌株中进行的。
其筛选过程包括以下几个关键步骤:1. 采集和保存微生物菌株微生物菌株的采集是筛选工作的第一步。
在大自然中,微生物生活在不同的环境中,如土壤、水体、植物表面等。
通过采集来自这些环境的样品,可以获得更多的微生物菌株资源。
采集后,需要进行适当的保存和管理,以确保菌株的长期保存和利用。
2. 筛选方法的选择针对微生物源抗癌活性物质的筛选,可以采用多种方法。
常用的筛选方法包括生物活性测定、高通量筛选等。
生物活性测定是通过对微生物菌株产物进行生物活性测试,如抑菌活性、抗肿瘤活性等,以评估其潜在的抗癌活性。
高通量筛选则是利用自动化设备和技术,对大量的微生物菌株进行快速的筛选和评估。
3. 筛选结果的验证在筛选过程中,需要对筛选结果进行验证。
这包括对具有抗癌活性的微生物菌株进行进一步的鉴定和鉴定其活性物质,以确保其准确性和可靠性。
这一步骤通常需要借助现代生物技术手段,如基因测序、质谱分析等。
II. 微生物源抗癌活性物质的开发微生物菌株筛选出具有抗癌活性的菌株后,接下来的任务是开发这些菌株中的活性物质,以获得更有效和安全的抗癌药物。
微生物源抗癌活性物质的开发包括以下几个主要步骤:1. 活性物质的提取和分离通过适当的方法提取和分离微生物菌株中的活性物质,如溶剂萃取、柱层析、高效液相色谱等。
这些步骤旨在获取高纯度的活性物质,并确保其结构和活性的稳定性。
海洋小单孢菌产生的缩肽类化合物rakicidins抗肿瘤活性研究林风;陈晓明;周剑;赵微;陈丽;江宏磊;方东升;连云阳;江红【摘要】研究海洋小单孢菌产生的缩肽类化合物rakicidins的体内外抗肿瘤活性.RakicidinB1、A和B对人结肠癌(HCT-8)细胞有很强的抑制作用,在乏氧培养条件下的抑制作用更强,分别是各自在常氧条件下的15、26和14倍.在移植了HCT-8肿瘤细胞的斑马鱼模型中,B和B1两化合物能显著抑制肿瘤生长.因此,rakicidinB(包括B1)值得进一步作为抗肿瘤药物加以研发.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2016(041)007【总页数】5页(P516-519,523)【关键词】Rakicidins;缩肽类;小单孢菌;海洋【作者】林风;陈晓明;周剑;赵微;陈丽;江宏磊;方东升;连云阳;江红【作者单位】福建省微生物研究所,福建省新药(微生物)筛选重点实验室,福州350007;福建省微生物研究所,福建省新药(微生物)筛选重点实验室,福州350007;福建省微生物研究所,福建省新药(微生物)筛选重点实验室,福州350007;福建省微生物研究所,福建省新药(微生物)筛选重点实验室,福州350007;福建省微生物研究所,福建省新药(微生物)筛选重点实验室,福州350007;福建省微生物研究所,福建省新药(微生物)筛选重点实验室,福州350007;福建省微生物研究所,福建省新药(微生物)筛选重点实验室,福州350007;福建省微生物研究所,福建省新药(微生物)筛选重点实验室,福州350007;福建省微生物研究所,福建省新药(微生物)筛选重点实验室,福州350007【正文语种】中文【中图分类】Q939自从1990年代后期Bonnet和Dick首次确证白血病癌症干细胞(cancer stem cell, CSCs)以来,CSCs就成为癌症研究的一个焦点。
CSCs普遍存在于肿瘤组织,是癌症转移和复发的起因[1]。
热带太平洋深海微生物抗肿瘤活性的初步研究王祥敏;叶德赞;林文翰;李明;孙佳;黄翔玲【期刊名称】《中国生物工程杂志》【年(卷),期】2007(27)10【摘要】以4个人体癌细胞株为模型、利用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)比色法和磺酰罗丹明(SulfoRhodamine B,SRB)染色法对55株来自热带太平洋深海微生物(细菌和霉菌)的培养液的乙酸乙酯抽提物以及菌体的甲醇提取物进行了细胞毒活性筛选,并主要采用分子生物学方法鉴定了该批菌株。
结果表明,55株微生物发酵样品共110个提取物中,90%样品表现出细胞毒活性;其中13株微生物的活性较强(提取物有效抑制浓度≤16μg/ml),具有较好的开发应用前景。
同时还发现,菌体中检测到的活性菌株数大于发酵液中检测到的活性菌株数,细菌的筛选得率高于霉菌的筛选得率.鉴定结果显示,50株微生物分属于21属、29种,其中13个较高活性菌株来源于8个属。
【总页数】6页(P81-86)【关键词】深海;热带太平洋;抗肿瘤鉴定;细菌;丝状真菌【作者】王祥敏;叶德赞;林文翰;李明;孙佳;黄翔玲【作者单位】国家海洋局第三海洋研究所;北京大学医学部天然药物及仿生药物国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】Q939.9【相关文献】1.一株海洋微生物产蛋白酶抗肿瘤活性的初步探讨 [J], 姜光域;王斌;闫志勇;宋旭霞2.热带太平洋深海微生物的若干生理生态特征 [J], 骆祝华;裴耀文;黄翔玲;叶德赞3.热带太平洋活性微生物菌株的筛选和鉴定 [J], 王祥敏;李明;骆祝华;孙佳;黄翔玲;叶德赞4.具抗肿瘤活性的海洋微生物菌株的初步筛选 [J], 李根;陈瑞川;林昱因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
第21卷 第1期台 湾 海 峡 Vol.21, No.1 2002年2月J OU RNAL O F OC EANO GRA P H Y IN TAI WAN S TRAI T Feb.,2002具抗肿瘤活性的海洋微生物菌株的初步筛选Ξ李 根1,陈瑞川2,林 昱1(1.国家海洋局第三海洋研究所海洋生物工程重点实验室,福建厦门 361005;2.厦门大学抗癌中心,福建厦门 361005)摘要:本研究采用M TT法对海洋放线菌、细菌、霉菌及极地和大洋细菌进行细胞毒活性物质的筛选,结果有10%放线菌及一株极地细菌具有细胞毒活性.此外利用DNA修复特性在 E.coli343/591和 E.coli343/636之间的差异性,对前面筛得的菌株进行DNA损伤的筛选,结果得到两株活性菌株.采用荧光染色观察得到3株具有诱导肿瘤细胞凋亡的菌株,这些具抗肿瘤活性的菌株可供进一步研究.关键词:M TT分析法;DDR T法;细胞毒活性物质;细胞凋亡中图分类号:Q7 文献标识码:A 文章编号:100028160(2002)0120018205近年来,国内外在海洋生物抗肿瘤活性物质筛选和研究上已取得了初步的成果.NCI每年筛选的3万个新的抗肿瘤化合物中,约有5%来自海洋生物;业已证实,约10%的海洋动物提取物有抗P388白血病细胞及K B细胞活性,3.5%的海洋植物提取物有抗肿瘤活性或细胞毒活性[1].这些化合物绝大多数具有独特的化学结构和明显的抗癌、抗病毒作用,主要包括生物碱、多肽及蛋白质、萜类、大环内酯类、多糖类、脂类等,其作用机理亦呈多样性,有以影响DNA、RNA、蛋白质为主的,也有以干扰有丝分裂或诱导细胞内信息分子的改变为主的,通常这些活性物质作用浓度甚微,而且毒副作用较低[2].目前,国内外寻找海洋药物的研究对象主要是海藻和海洋动物,据报道,到目前为止已成功地分离到5000多种具有生物活性的海洋天然产物,但由于其含量低,生物量有限,分离提取的生产成本较高,使得许多研究成果的应用推广受到限制.因此,人们把注意力转向海洋微生物的培养与发酵技术以及其代谢产物的研究上.由于海洋微生物所处的海洋环境是十分独特的,海洋微生物是产生新的生物活性物质极好来源之一.同时海洋微生物的特点是繁殖快、易培养等,可以结合现代发酵工程技术,使之工业化生产,降低海洋药物的生产成本[3].本文以M TT法、DDR T法及荧光染色法对从极地、大洋、近海大量分离得到的放线菌、细菌和霉菌进行抗肿瘤活性物质的筛选.1 材料与方法1.1 细胞株及试验菌株Ξ收稿日期:2001210217基金项目:由科技部基础性工作项目《海洋药源生物种质资源和基因库的构建》和国家海洋局海洋生物工程重点实验室研究课题资助(No HY9903)作者简介:李根(1978~),男,在读硕士研究生.细胞株 人胃癌细胞M GC 8023,由厦门大学抗癌中心提供.试验菌株 343/591为赖氨酸和生物素营养缺陷型并具有发酵乳糖能力和DNA 修复缺陷的uvrB/recA 菌种343/636为不能发酵乳糖的脯氨酸营养缺陷型菌株并具有紫外线损伤和DNA 修复能力,购自上海医药工业研究院.1.2 待筛菌株363株海洋放线菌,70株极地及大洋细菌,234株海洋细菌及26株霉菌,均由本实验室分离保存.1.3 细胞培养人胃癌细胞M GC 8023于含10%小牛血清、100U/cm 3青霉素、100μg/cm 3链霉素及50μg/cm 3卡那霉素的RPM I 1640培养液中,在37℃,5%CO 2及饱和湿度环境下培养、传代.1.4 菌株发酵及发酵液的预处理菌株接种于发酵培养基,经2d 活化后,补加培养基,28℃摇床培养至对数生长期后期(细菌3d 、放线菌约5d ).发酵结束后,将发酵液转移至10cm 3的管子中,超声波破碎2min ,104r/min 离心10min ,小心吸出上清液.上清液用0.22μm 的微孔滤膜过滤除菌,分装于小管中,于-20℃冻存,使用时以RPM I 1640培养液作适当稀释.1.5 M TT 分析法根据文献[4]作适当修改,步骤如下:细胞培养至90%铺底(处于对数生长期),用胰酶消化液(0.25%胰酶/D 2Hank ’s 液)消化收集细胞,吹打制成单细胞悬液,苔芬蓝染色计算活细胞数,接种细胞于96孔板中,每孔加200mm 3悬浮细胞液,在37℃CO 2培养箱培养过夜.第二天加入各稀释度的菌株发酵液20mm 3,继续培养3d ,倒去培养液,PBS 洗1遍,加入M TT (0.2mg/cm 3)100mm 3,在37℃培养4h ,然后去除M TT ,加DMSO 与甘氨酸NaOH 缓冲液(9∶1)200mm 3,摇床摇0.5~1h ,酶标仪测定570nm 吸光值.其中四孔做全培液空白对照,四孔做细胞悬浮液对照,每样平行测试3孔,以阿霉素为标准参照.抑制率计算式为:抑制率=100%×(OD 对照-OD 实验)/OD 对照发酵液活性以ID 50衡量,ID 50为抑制率为50%时,发酵液所稀释的倍数;抗癌药物的活性以IC 50衡量,IC 50为抑制率为50%时,样品的浓度.1.6 DDRT 法(diff e re n t DNA re p air t e s t )根据文献[5]作如下修改:343/636和343/591菌株(通常一个菌落)分别接种于含5cm 3蛋白胨-肉汤培养基中,在37℃振荡培养16h ,用分光光度计测450nm 处的343/591和343/636的OD 值,用蛋白胨-肉汤培养基稀释343/636菌液使其OD 值与343/591相同,在100cm 3中性红琼脂培养基中加入1cm 3菌液后倒入平皿中静置1h ,将所要测定的放线菌发酵液和受试物滴加在覆盖于琼脂培养基上直径为8mm 的滤纸片上,37℃培养24h ,以丝裂霉素为标准药物对照,根据发酵液产生的抑菌圈大小的差异来判定其对DNA 造成损伤的大小及是否有抗肿瘤活性.1.7 荧光显微镜观察细胞凋亡根据文献[6]作适当修改,步骤如下:M GC 8023细胞按2cm 3/瓶接种于10cm 3细胞培养瓶中,37℃过夜,每瓶加10mm 3菌株发・91・ 1期 李 根等:具抗肿瘤活性的海洋微生物菌株的初步筛选 酵液,对照组仅加同量培养液,37℃继续培养1~2d 后,收集细胞,细胞涂片,以细胞固定液[甲醇∶冰乙酸(3∶1),现配]4℃固定5min ,蒸馏水稍洗后,滴加Hoechst 233258染色液(5μg/cm 3Hoechst 233258)染色10min.蒸馏水洗片后,用滤纸沾去多余液体,吹干.封片剂(封片液:20mmol/dm 3柠檬酸,50mmol/dm 3磷酸二氢钠,50%甘油,p H5.5)封片后荧光显微镜观察.2 实验结果与分析2.1 M TT 分析法本文采用M GC 8023细胞,以M TT 分析法为筛选模型,对363株海洋放线菌,70株极地及大洋细菌,234株细菌和26株霉菌的发酵液进行细胞毒活性筛选.初筛以550倍的稀释度为标准,当其ID 50大于550的时候,再进行复筛,以确定菌株发酵液的ID 50.筛选结果(表1)表明,约有10%的海洋放线菌及一株极地细菌ID 50大于或等于550,其中最大ID 50可达22000.表1 具有细胞毒物质的海洋微生物筛选结果Tab.1 Screening result of marine microorganism having cell toxicity样 号ID 50样 号ID 50S 2511650S 2350600S 2521650S 2351550S 2601100S 2357650S 2621320S 2363550S 264660S 2385550S 2651650S 23901650S 2731650S 2431550S 2921650S 2448600S 295880S 2459600S 2153550S 2467550S 21761650S 2468550S 2182550S 247715000S 2183880S 2478780S 21963300S 2492770S 2233550S 2494700S 22361650S 2502550L 243000S 25055500L 214550S 251322000J 27550S 2515680 注:其中作为标准药物的阿霉素的IC 50在0.025~0.03μg/cm 3之间.2.2 DDRT 法利用DDR T 法对M TT 粗筛得到的38株放线菌和细菌进行DNA 损伤的检测,结果得到A 2132、A 2442两株放线菌对DNA 产生损伤,其在343/591和343/636平板上的实验结果(表2)如下:表2 放线菌和丝裂霉素对照对两个菌株的抑菌活性比较Tab.2 Bacteriostastic activity of actinomycetes and mitomycin towards two strains受试物343/591抑菌圈直径(mm )343/636抑菌圈直径(mm )S 218213-S 249213-丝裂霉素0.5μg 23-2.3 荧光染色显微镜观察・02・ 台 湾 海 峡 21卷经S 2176、S 295和L 243株放线菌发酵液(终稀释度均为1∶200)处理后,荧光染色显微镜下观察,M GC 803细胞核内可见浓染致密的颗粒或块状蓝色荧光,荧光亮度明显增强,染色质多集中于结构完整的核膜边缘,形成环状、新月状、僧帽状的浓染带,部分细胞的核固缩、碎裂,成为细小的碎片.而对照组M GC 803细胞的细胞核呈均匀弥散荧光,核的大小、形态一致.表明上述3个菌株可产生具有诱导肿瘤细胞凋亡的活性物质.3 讨论3.1 M TT 分析法M TT 法是一种检测细胞生存和增殖状态的方法,该方法以其简单、快速、准确等优点被用于细胞毒和淋巴因子生长抑制的定量检测,尤其在肿瘤化疗药敏实验中广泛使用.其原理是M TT 可被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为蓝色的甲 化合物,再经适当溶剂溶解后,其吸光度与活细胞数相关,从而可作为检测活细胞数的指标.因此M TT 法可用于细胞毒活性物质的筛选.3.2 DDRT 法DDR T 法是一种利用两个菌株对DNA 损伤修复的差异性建立的方法,可以用来检测试物的DNA 毒性.343/591为DNA 修复缺陷菌株,而343/636菌株具有紫外线损伤和DNA 修复能力,因而通过两个菌株的修复能力不同可以检测出受试物的DNA 毒性.从抗肿瘤药物的作用机理来看,多数抗肿瘤药物的作用机制主要是作用于DNA ,因而DDR T 法可用于筛选得到作用于DNA 的抗肿瘤活性菌株.3.3 荧光染色显微镜观察细胞凋亡是一种不同于坏死的死亡形式,其特点之一是细胞在凋亡过程中细胞核内的染色质通常会发生凝聚作用,形成块状、致密的染色质.因此,加入荧光染料Hoechst 33258后,凋亡细胞由于膜通透性的改变.可摄取Hoechst 染料,后者与DNA 结合,在紫外光下呈浓度致密的颗粒块状蓝色荧光.正常细胞也可摄取少量Hoest 荧光染料,而坏死细胞则不能摄取,故在荧光显微镜下,可观察到正常细胞的细胞核呈弥散均匀蓝色荧光.4 小结通过以上几种方法的筛选,我们得到了两株通过对肿瘤细胞的DNA 产生损伤从而抑制肿瘤细胞生长繁殖的菌株及3株对肿瘤细胞具有诱导凋亡作用的菌株,可以提供作为进一步的分离研究.我们对海洋放线菌抗肿瘤活性物质的筛选和初步研究表明,海洋放线菌中蕴藏着丰富的抗肿瘤活性物质,进一步的筛选和研究有望从中筛选出独特结构及作用机理的抗肿瘤活性物质.参考文献:[1] 廖辉南,戴建凉.海洋生物抗肿瘤活性物质的研究进展[J ].生物工程进展.1995,15(1):8~14.[2] 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screening model of M TT was used to identify antitumor active material from ma 2rine actinomycetes ,bacterials ,molds and extreme bacterials.The results showed about 10per 2cents of actinomycetes and one polar bacterial strain have cell toxicity.Further more ,according to the DNA repair test vitality different between E.coli 343/591and E.coli 343/636,two positive strains were identified.By fluorescence dyeing ,we observed that three strains had the ability to induce cell apoptosis.These strains can be further researched for antitumor drug study.Ke y w ords :M TT assay ;DDR T assay ;cell toxicity agents ;cell apoptosis・22・ 台 湾 海 峡 21卷。