共聚焦显微镜简介及免疫荧光染色

共聚焦显微镜从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。

共焦显微镜[confocallaserscanningmicroscope(clsm或lscm)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(dichroicmirror)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔(pinhole)的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管(photomultipliertube，pmt)。

可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。

于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。

其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。

激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%--40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如ca2+、ph值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。

激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。

能够进行活体细胞中离子和ph值变化研究（ratio），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（fish），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时pcr产物分析，荧光漂白恢复研究（frap），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和三维重建等分析。

.b ž激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。

它是在荧光ž显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像, 成为形态学﹑分子细胞生物学﹑神经科学﹑药理学﹑遗传学等领域新一代强有力的研究工具。

同时,激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。

不仅可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的“光学切片”; 进行单标记或双标记细胞及组织标本的荧光定性定量分析; 还可用于活细胞生理信号, 离子含量的实时动态分析监测, 粘附细胞的分选, 细胞激光显微外科和光陷阱技术等。

可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。

- www 生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o mIntroductionžLSCM 是一种高科技显微镜ž荧光显微镜成像为基础，加装了激光扫描装置, 计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。

ž无损伤的“光学切片”ž细胞三维立体机构ž实时动态分析监测激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。

生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž光学显微镜部分ž激光发射器ž扫描装置ž光检测器ž计算机系统( 包括数据采集, 处理, 转换, 应用软件)ž图像输出设备LSCM 的基本组成生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mLSCM 的原理激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源, 普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源, 标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。

而LSCM 以激光为光源, 激光具有单色性强﹑方向性好﹑高亮度﹑相干性好等优点, 可以避免普通显微镜的缺点。

共聚焦显微镜从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。

共焦显微镜[confocallaserscanningmicroscope(clsm或lscm)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(dichroicmirror)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔(pinhole)的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管(photomultipliertube，pmt)。

可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。

于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。

其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。

激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%--40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如ca2+、ph值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。

激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。

能够进行活体细胞中离子和ph值变化研究（ratio），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（fish），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时pcr产物分析，荧光漂白恢复研究（frap），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和三维重建等分析。

共聚焦显微镜
共聚焦显微镜，最常见的是共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）或激光共聚焦扫描显微镜（LCSM），是一种光学成像技术，可通过使用空间针孔来阻挡散焦光来提高显微图像的光学分辨率和对比度。

在图像形成中。

捕获样品中不同深度的多个二维图像可重建三维结构（此过程称为光学切片）。

该技术广泛用于科学和工业界，典型的应用是生命科学、半导体检查和材料科学。

共聚焦显微镜利用照明点与探测点共轭特性，可有效yi 制同一焦点平面上非测量点的杂散荧光及来自样品中非焦平面的荧光，从而获得普通光镜无法达到的分辨率。

共聚焦显微镜是激光共聚焦扫描显微镜LCSM 的简称，它显微成像主要采用3D 捕获的成像技术，使其具有较高的三维图像分辨率。

这些都是通过构建显微照片来实现的。

在荧光显微镜使用过程中，由于需要高强度紫外光辅助成像，所以显微镜内的汞弧灯产生的强光可能会导致令人不安的背景噪音，甚至会导致光漂白。

共聚焦显微镜以一个微动步进马达控制载物台的升降，可以逐层获得高反差、高分辨率、高灵敏度的二维光学横断面图像，从而对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的系列“光学切片”，得到各个层面的信息。

这种功能也被称为细
胞CT或显微CT。

荧光显微镜及激光扫描共聚焦显微镜使用可以参照相关参考资料
荧光显微镜是一种放大显微镜，它可以用于观察单个细胞或多个细胞，甚至是单个分子。

它的工作原理是，激发光通过荧光技术和特定的滤色片
将被观察物体的荧光分子特定波长的光波吸收，然后通过精密的放大镜头
进行放大，并通过荧光镜板分别输出激发光和发射光，最后将多波长波段
的发射光通过摄像机捕捉，从而形成的荧光图像。

荧光显微镜的优势之一
是它可以用于检查细胞和其内部的结构，可以检测不同的细胞特性，包括
活性、基因型、蛋白质含量和其他蛋白质表达。

激光扫描共聚焦显微镜是一种表面观察技术，它通过光学系统将多束
激光（称为共聚束）聚合到一个点，从而使能量集中到一个空间仅仅几微
米的点上，引起形成激发光，它可以精确地显示表面的形貌、表面缺陷和
细节。

此外，它还可以在极低的功率下，提供精确的材料成分和表面化学
分析，包括成分的化学结构、光谱以及深度分析，同时还能提供室温下的
探针定量分析。

一、激光扫描共聚焦显微镜简介激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，简称CLSM）是近代生物医学图像仪器。

它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针。

利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。

二、激光扫描共聚焦显微镜原理在普通宽视野光学显微镜中，整个标本全部都被水银弧光灯或氙灯的光线照明，图像可以用肉眼直接观察。

同时，来自焦点以外的其他区域的荧光对结构的干扰较大，尤其是标本的厚度在2um以上时，其影响更为明显。

激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。

组织样品中如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管（PMT）探测收集，并将信号输送到计算机，处理后在计算机显示器上显示图像。

在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。

因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。

由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。

以激光作光源并对样品进行扫描，在此过程中两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜。

三、激光扫描共焦显微镜的优点1.动态连续扫描及三维图像重组。

LSCM可以对对活细胞和组织或细胞切片样品的不同层面进行连续逐层扫描,来获得各个层面的图像，即所谓的“无损伤的光学切片”。

激光扫描共聚焦显微镜扫描的每个层面之间的间距可以达到0.1um甚至更小。

获得的图像通过计算机重组，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。

不激光共聚焦扫描显微镜简介一、激光共聚焦显微镜的基本组成激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。

激光共聚焦显微镜利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，以及通过针孔的选择和PMT的收集，并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。

与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。

所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。

激光共聚焦显微镜主要有四部分组成：1、显微镜光学系统。

2、扫描装置。

3、激光光源。

4、检测系统。

整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。

1.1 显微镜光学系统显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成象质量。

显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插人光学选件而不影响成象质量和测量精度。

物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成象的清晰。

物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。

1.2 扫描装置LSCM使用的扫描装置在生物领域一般为镜扫描。

由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围，图象采集速度大大提高，512×512（26万色）画面每秒可达4帧以上，有利于那些寿命短的离子作荧光测定。

扫描系统的工作程序由计算机自动控制。

1.3 激光光源LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。

多激光器系统在可见光范围使用多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光，氦氖绿激光器提供发射波长为543nm的绿光，氦氖红激光器发射波长为633nm的红光，新的405nm半导体激光器的出现可以提供近紫外谱线，但是小巧便宜而且维护简单。