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1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试剂与仪器材料：ZEN、玉米赤霉醇（ZEL）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）、DMEM 培养基、HAT、HT、PEG、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶（HRP）标志物、抗体亚类检测试剂盒（Sigma 公司）和胎牛血清（Gibco公司）；酶标仪MK3、CO 2培养箱（Thermo 公司）、洁净台（天津科学仪器厂）和生物倒置显微镜（日本欧林巴斯光学株式会社）；BALB/c 小鼠购于军事医学科学院；SP2/0骨髓瘤购于中国农业大学实验室；其他试剂均为分析纯。
1.1.2 ELISA 溶液体系包被液：0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液，pH 9.6；洗涤液：PBST，含0.05 ％ Tween-20的0.01 mol/L PBS ；封闭液：0.6 ％明胶溶液；抗体稀释液：含抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及ELISA 检测试剂盒的研制王 雄１，３荣 钊1 蒙海超2 吴继宗３ 陈冰君1 王彦斐1 果 旗11.北京中检维康技术有限公司2.长江大学生命科学学院3.中国原子能科学研究院质量分数为0.1 ％BSA 的0.01 mol/L PBS；终止液：2 mol/L 硫酸。
1.2 方法1.2.1 抗原的合成玉米赤霉烯酮-6-羧甲氧肟的合成方法：5 mg 的ZEN 溶于4 mL 吡啶中，加入3 mg 的O-羧甲基羟胺，在室温下搅拌24 h，之后真空干燥，水溶解，调pH 到8，乙酸乙酯提取3次，去水，结晶。
利用碳二亚胺法将玉米赤霉烯酮-6-羧甲氧肟与BSA 偶联：将结晶物溶于二氧六环中配成5 mmol/L 溶液，称取30 mg BSA 溶于2 mL，0.05 mol/L （pH 7.4）的PBS 中。
4 ℃下，将二者混合，再缓慢滴加3 mg 的N-羟基琥珀酸亚胺（NHS）和6 mg 的N、N ，-二环己碳二亚胺（DCC）溶于0.5 mL 二氧六环的溶液，混合物于室温下搅拌反应24 h，透析，离心，冷冻备用。
赤羽病病毒N蛋白单克隆抗体的制备王冰【摘要】为制备赤羽病病毒(AKAV)N蛋白的单克隆抗体(MAb),本实验利用原核表达系统表达、纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,三免后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,并以纯化的重组N蛋白为包被抗原,通过间接ELISA筛选出1株稳定分泌抗AKAV N蛋白的MAb杂交瘤细胞株ⅡG5,检测结果显示ⅡG5为IgG1/κ链.间接免疫荧光结果显示,ⅡG5与AKAV感染细胞呈阳性反应,与茨城病病毒、中山病病毒以及蓝舌病病毒1型均呈阴性反应,特异性较好.Westemblot结果显示,ⅡG5能够识别重组的以及AKAV感染细胞中的N蛋白.本研究结果为AKAV检测方法的建立及相关研究奠定基础.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2019(041)003【总页数】4页(P309-312)【关键词】赤羽病病毒;N蛋白;原核表达;单克隆抗体【作者】王冰【作者单位】黑龙江农垦职业学院,黑龙江哈尔滨151025【正文语种】中文【中图分类】S852.65赤羽病又名阿卡斑病(Akababe disease)，是由布尼病毒科、布尼病毒属、辛波病毒群的赤羽病病毒(Akabane virus，AKAV)所引起的牛、绵羊和山羊的一种多形性传染病，以牛、羊的流产、早产、死产及先天性关节弯曲和积水性无脑症(Arthrogryposis Hydraencephaly，AH 综合症)为特征[1-2]。
该病首次于1949年在日本群马县赤羽村发现，1959年才首次从该地采集的金色库蚊和三带缘库蚊体内分离到病毒，因此命名为 AKAV，此后澳大利亚、肯尼亚、南非、以色列、日本等地相继暴发该病[2-3]。
我国科学家自1994年开始进行该病流行病学调查，至今已证实陕西、内蒙、湖南、河北、北京、上海、山东、安徽、吉林、甘肃、江苏、浙江、福建、湖北、广东等部分地区均有该病的流行[1]。
目前，已经证实赤羽病广泛分布于澳大利亚、东南亚、亚洲东部、中东和非洲的热带和温带地区，主要由蚊虫、库蠓、螨类等节肢动物传播[1-3]。
赤羽病ELISA检测方法的建立及试剂盒的研制作者：王玉瑾吴雯娟张婷等来源：《养殖与饲料》 2013年第11期王玉瑾1 吴雯娟2 张婷2 吴绍精2 陈勇2 仲建忠2 詹爱军2*1.江苏省新沂市畜牧兽医站,江苏新沂221400;2.广东省深圳市检验检疫科学研究院,广东深圳518010摘要为了提高赤羽病的检测速度与效率,建立双抗夹心ELISA 检测方法并进行试剂盒的研制。
试验用纯化的AKV免疫BALB/c小鼠,细胞融合后用ELISA方法筛选出3株分泌抗AKV 特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞(1D1、1B12和2G1),各杂交瘤细胞株均可以稳定地分泌特异性单克隆抗体,且其单克隆抗体亚型测定的结果均为IgG1、轻链均为κ链。
建立DAS-ELISA检测方法,确定抗AKV 单克隆抗体1B12株的最佳包被浓度为4μg/mL,多克隆抗体最佳稀释比为1∶500,二抗最佳工作浓度为1∶5000,阴性/阳性结果判定临界值为0.238,具有较好的特异性,检测极限为10-4。
表明该方法及试剂盒具有较强的实用价值。
关键词赤羽病;阿卡斑病毒;单克隆抗体;DAS-ELISA;试剂盒赤羽病是由布尼病毒属辛波病毒群的阿卡斑病毒(AKV)引起的牛、绵羊、山羊和其它多种野生动物的以流产、早产、死产、畸形产以及先天性关节弯曲-积水性无脑综合征(AH 综合征)为特征的病毒性传染病。
此病可给畜牧业造成巨大经济损失,是国际动物贸易中检疫的重点疫病之一[1]。
20世纪30年代,该病最早在澳大利亚暴发,随后在日本、美国、韩国、沙特阿拉伯、苏丹等地区也分离到该病毒[2-3]。
该病在我国很多地区都有发生,是目前对我国养牛业和养羊业危害较为严重的疫病之一,也是我国从国外进口牛、羊时必须检测的7种疫病之一。
因此,研究并制备高特异性、可与相关病毒相区别的快速检测方法是AKV 检疫中亟待解决的问题。
目前AKV 的血清学诊断方法有补体结合试验(CF)、间接荧光抗体法(IFNT)[4]、血凝抑制试验(HI)[1]、琼脂扩散试验(AGDP)[5]、微量血清中和试验(VN)[6]和ELISA[7-8]。
单克隆抗体的研制一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。
常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。
即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。
由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。
因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。
随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。
1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。
这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗抗体，即所谓单克隆抗体（），简称单抗。
与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。
单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。
Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。
二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。
1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。
玉米赤霉醇单克隆抗体的制备及鉴定王鹤佳;曹振;沈建忠;史为民【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2004(040)010【摘要】将玉米赤霉醇(α-zearalanol, ZER)琥珀酰化得到ZER-7-半琥珀酸酯,再利用混合酸酐法与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原,以此免疫原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术得到两株稳定分泌ZER单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C12和9B4,经鉴定两株单抗亚型均为IgG1,间接ELISA测定腹水效价为1:3.2×105.该抗体与同系物β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮的交叉反应率分别为36.25%,52.73%,0.67%,74.36%,53.70%;与己烯雌酚、雌二醇、睾酮、克伦特罗的交叉反应率均小于0.1%.该细胞株体外传代和冻存复苏后抗体分泌稳定.【总页数】3页(P3-5)【作者】王鹤佳;曹振;沈建忠;史为民【作者单位】中国农业大学动物医学院,北京,海淀,100094;农业部兽医诊断中心,北京,海淀,100094;中国农业大学动物医学院,北京,海淀,100094;中国农业大学动物医学院,北京,海淀,100094【正文语种】中文【中图分类】S859.83【相关文献】1.2种不同方法制备玉米赤霉烯酮单克隆抗体适配子的ssDNA文库的比较 [J], 邹绮;王元凯;毛紫微;杜斌;王恒安;孙建和;严亚贤2.抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备 [J], 祭芳;曹欢;徐剑宏;史建荣3.玉米赤霉醇完全抗原的制备及质量鉴定 [J], 胡骁飞;邓歌;柴书军;姚静静;孙亚宁;王方雨;邓瑞广;张改平4.基于结构类似物的交叉反应性制备高灵敏度玉米赤霉醇单克隆抗体 [J], 胡骁飞; 李青梅; 姚静静; 胡思宇; 孙亚宁; 邢云瑞; 邓瑞广; 张改平5.玉米赤霉醇特异性单克隆抗体及其胶体金检测试纸的研制 [J], 刘媛;文孟棠;张霄;徐重新;杨晶祎;张留娟;王恒;何鑫;梁颖;郑勤;夏兴霞;刘贤金因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
赤羽病胶体金免疫层析试纸条的研制杨素;陈博文;沙才华;廖秀云;秦爱建;王继华;彭运平;刘晓云【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2009(036)003【摘要】采用双抗体夹心免疫层析技术,研制了适合田间快速试验的赤羽病胶体金免疫层析试纸条.纯化赤羽病毒单克隆抗体3A和2C,用柠檬酸钠还原法制备胶体金标记纯化后的单抗作为标记抗体.分别将羊抗鼠IgG和纯化后的单抗包被于NC膜上作为质控带和检测带,以检测被检样品中的赤羽病毒(akal)ane virus,AKAV).试验结果表明,所研制的试纸条敏感性较高(为10 TC1D50),特异性较强,还具有快速、稳定、简便等特点,适合基层动物防疫检疫部门尤其是进出境动物检疫机构进行赤羽病大批量、田间快速初筛,对赤羽病快速诊断具有重要的意义.【总页数】3页(P42-44)【作者】杨素;陈博文;沙才华;廖秀云;秦爱建;王继华;彭运平;刘晓云【作者单位】扬州大学兽医学院,扬州,225009;珠海出入境检验检疫局,珠海,519015;珠海出入境检验检疫局,珠海,519015;珠海出入境检验检疫局,珠海,519015;珠海出入境检验检疫局,珠海,519015;扬州大学兽医学院,扬州,225009;广州万孚生物科技有限公司,广州,510641;广州万孚生物科技有限公司,广州,510641;广州万孚生物科技有限公司,广州,510641【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.赤羽病ELISA检测方法的建立及试剂盒的研制 [J], 王玉瑾;吴雯娟;张婷;吴绍精;陈勇;仲建忠;詹爱军2.检测4种有机磷农药胶体金免疫层析试纸条的研制 [J], 朱亮亮; 王琳琛; 王兆芹; 崔海峰; 张坤; 冯才伟; 万宇平3.马铃薯S病毒胶体金免疫层析试纸条的研制 [J], 张微; 李志新; 付春江; 刘卫平4.牛β-乳球蛋白胶体金免疫层析试纸条的研制及检测应用 [J], 薛海燕;吴剑;张颖;宋宏新;贺宝元5.非洲猪瘟病毒胶体金免疫层析试纸条的研制 [J], 邬旭龙;刘波;王印;张鹏飞;江地科;肖璐因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
专利名称：一种抗赤羽病病毒单克隆抗体及其制备方法与应用专利类型：发明专利
发明人：陈冬杰,魏方,袁向芬,孔玉方,林祥梅,吴绍强
申请号：CN202110466130.4
申请日：20210428
公开号：CN112979797B
公开日：
20220401
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种抗赤羽病病毒单克隆抗体及其制备方法与应用，属于生物技术领域。
其包括单克隆抗体2D3、5F10，其中，所述单克隆抗体2D3包括重链如SEQIDNO：1所示序列和轻链如SEQIDNO：2所示序列；所述单克隆抗体5F10包括重链如SEQIDNO：5所示序列和轻链如SEQIDNO：6所示序列。
本发明制备的单克隆抗体2D3单抗仅特异性识别AKAV‑N蛋白，5F10、1F4和5D4单抗可同时与AKAV‑N和SBV‑N蛋白反应，这为AKAV‑N蛋白的相关研究以及牛羊赤羽病的治疗提供支持，同时还能为抗牛羊赤羽病的药物研发提供理论基础。
申请人：中国检验检疫科学研究院
地址：100176 北京市大兴区荣华南路11号
国籍：CN
代理机构：北京东方盛凡知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：张换君
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赤羽病间接ELISA检测方法的建立和标化李健;李树清;王巧全;胡永强;陈沁【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2003(025)006【摘要】应用赤羽病病毒(AKV) OBE-1株和牛标准阴阳性血清,以蔗糖密度梯度离心纯化细胞毒为包被抗原,在国内首次建立了检测AKV抗体的间接ELISA方法.该方法与中和试验相关系数0.7614,特异性和重复性良好.应用此方法对南京、上海附近奶牛抽样检测,阳性率分别为26.7 %和32.7 %.对澳大利亚、加拿大、美国进口牛13 600头份进行检测,全部阴性.【总页数】4页(P483-486)【作者】李健;李树清;王巧全;胡永强;陈沁【作者单位】上海出入境检验检疫局,上海,200135;上海出入境检验检疫局,上海,200135;上海出入境检验检疫局,上海,200135;上海出入境检验检疫局,上海,200135;上海大学,生命科学学院,上海,200436【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.赤羽病病毒囊膜糖蛋白G1基因的截短表达、纯化及间接ELISA诊断方法的建立[J], 徐树兰;童铁钢;白宇;辛九庆;王群;张维军;孙庆歌;吴东来2.赤羽病病毒RT-LAMP检测方法的建立 [J], 张吉红;潘登;黄素文;黄绍棠;李如松;王建峰;倪健波3.牛传染性鼻气管炎和赤羽病基因芯片检测方法的建立和应用 [J], 陈圣军;孔繁德;徐淑菲;张吉红;唐泰山4.一种基于重组截短Gcaa407～614蛋白的赤羽病病毒抗体间接ELISA方法的建立 [J], 王建华; 赵丹; 陈本龙; 张俊哲; 王玉玲; 肖妍5.赤羽病病毒核衣壳蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立 [J], 徐树兰;李少英;辛九庆;尹训南;孟庆文;吴东来因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
