农杆菌感受态制备与转化

农杆菌感受态细胞的制备及转化、浸润烟草1）挑取农杆菌单菌落于3 ml Sm（1000倍稀释）抗性的LB液体培养基中，28o C振荡培养过夜；2）取过夜培养菌液500μl加入到50ml的Sm抗性的LB液体培养基中，28o C振荡培养至OD600为0.5；3）5000rpm离心5min，倒掉培养液；4）加入10ml 0.15M NaCl悬浮农杆菌细胞，5000rpm 5min；5）倒掉上清，加入1ml 预冷的20mM CaCl2悬浮细胞，冰浴24h内使用，或者分装成每管200μl，液氮中速冻，保存于-70 o C备用。

取200μl感受态细胞，加入1ug质粒DNA，液氮中速冻1min，37o C水浴5min，加入1ml LB，28o C慢速振荡培养4－6h后，涂布于含有相应抗生素的固体培养基平板上，28o C 培养约48h。

挑取平板上长出的单菌落，接种于LB液体培养基（含有50μg/ml Kan和100μg/ml sm）中，28℃振荡培养过夜，碱裂解法小量提取质粒DNA，进行PCR及酶切鉴定。

用于浸润的菌液制备MMA buffer：10mmol/L MgCl2(95.21)，10mmol/L MES(195.23)，100μmol/L 乙酰丁香酮(196.20)（Acetosyringone）(MgCl2 :2g MES :2g 乙酰丁香酮:50ul)1）取单菌落接种于3ml LB（含有50μg/ml Kan和100μg/ml SM）培养基中28℃振荡培养过夜；2）取1ml活化后的菌液接入50ml LB（含有50μg/ml Kan和100μg/ml SM）中，28℃振荡培养至合适浓度OD600约0.8-1.0；3）4℃，4000rpm离心15min，沉淀用MMA buffer重悬，菌液终浓度为OD600约1.0-2.0；4）室温静置2hr以上，用1ml注射器对合适苗龄的本生烟进行浸润。

农杆菌感受态制备转化
农杆菌感受态制备
1、划平板，单克隆培养
2、放单克隆于5mllb培养基中，挥至饱和状态（1-2day）
3、50m离心管中4500rpm，15min
4、50ml菌体用1ml氯化钙（预冷）悬浮，冰上操作
5、每100ul分装于冷冻管中，
液氮速冻后，-70℃保存
农杆菌转变
1．50ul感受态+5ul质粒，放入液氮速冻2min2．37℃热激5min
3.提1mllb，28℃培育3-4h
3.8000rpm/min去上清，200ullb悬浮，涂板吹干农杆菌抗性：利福平+庆大霉素+载
体抗性。

（gv3101）庆大霉素40mg/ml（0.4g/10ml）；利福平50mg/mldmso溶解
200mllb+200ul母液
农杆菌转回植物
1.植物去顶三天后转化，转前一天交足水
2.摇菌od600=1.2~1.6（先大挥后，挑200ul小挥200ml）
3.室温5000rpm，15min，弃上清，悬浮于等体积渗透培养基中（200ml/转化）每
1000ml渗透培养基：1/2ms2.42g；蔗糖50g；mes0.5g；用1mkoh调ph到5.8/5.7，定容
到1000ml，加10ul1mg/ml6-ba，加200ulsilwetl-7，混匀，将菌液悬浮，od=0.8左右。

不得低于0.7.
4.将菌液放入大平皿中，植株煮沸20s砌上白盆，过夜后掀开正常培育。

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤一、目的及要求了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。

二、实验原理在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。

在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。

感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。

农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。

将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。

制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。

三、实验仪器、材料和试剂仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。

以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。

材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株试剂：YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌；链霉素（Sm）储液：125mg/ml0.15 N NaCl，高压灭菌。

20mM CaCl2，高压灭菌。

四、实验步骤1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜；2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5；3. 5000rpm, 离心5min；4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min；5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。

农杆菌感受态制备和转化：电转法和热击法电转法1）挑取新鲜单菌落接种到10mL YEP培养基（含50ug/ mL利福平）的试管里，28℃、200r/min培养过夜。

2）稀释2 mL培养过夜的农杆菌到含200 mL YEP培养基的500 mL三角瓶里，28℃、200r/min培养至OD600达0.5。

4℃、5000 r/min离心5分钟收集细胞。

3）用适量体积的 10%的甘油（用去离子水配置）重悬洗涤沉淀2次，洗涤时一定要轻柔地把细胞悬均匀，每次4℃、5000 r/min离心5分钟收集细胞，小心将上清倒掉。

4）将细胞重悬于1 mL 10%的甘油里，细胞可以立即使用，也可分装成每管40μL（质粒连接产物体积不能超过感受态细胞体积的1/10，否则容易爆杯），经液氮速冻后，-70℃冰箱保存备用。

5）取一管感受态细胞放在冰上融化，加入100ng DNA样品混匀，将样品放入冰上的电击杯中，按照电击仪厂商说明进行电击转化，之后涂布在含有相应抗生素的YEB平板上培养（质粒抗性+农杆菌菌株抗性）。

热击法1）挑单菌落于2 mL YEP培养基（含Rif 50mg/ mL）中28℃过夜活化；2）取2 mL过夜菌液接种于200 mL YEP培养基中28℃振荡培养生长至OD600约等于0.5左右；3）冰上放置30 min左右，5000 rpm离心5 min；4）在60 mL冰水浴预冷的无菌0.1M CaCl2溶液中中悬浮细胞；5） 5000 rpm离心5 min，悬浮细胞加入20 mL冰水浴预冷的含15%甘油的0.1M CaCl2，轻敲管壁使菌体悬浮均匀，每管200 µL 进行分装，液氮速冻后保存于-80℃待用；6）取200 µL感受态细胞，加入0.5 µg质粒DNA，液氮中速冻5 min，37℃水浴热击5min，之后迅速置于冰水浴中冷却2 min，然后加入1 mLYEB 空白培养基，28℃低速振荡培养4 hr；7） 6000 rpm离心2 min，弃部分上清，留约200 µL溶液，重悬细胞，涂布于含有相应抗生素的YEB 平板上，28℃倒置培养约36 hr。

农杆菌感受态制备
1、划平板，单克隆培养
2、挑单克隆于5ML LB培养基中，摇到饱和（1-2day）
3、50m离心管中4500rpm，15min
4、50ml菌体用1ml氯化钙（预冷）悬浮，冰上操作
5、每100ul分装于冷冻管中，液氮速冻后，-70℃保存
农杆菌转化
1．50ul感受态+5ul质粒，放入液氮速冻2min
2．37℃热激5min
3. 加1mlLB，28℃培养3-4h
3. 8000rpm/min去上清，200ulLB悬浮，涂板吹干
农杆菌抗性：利福平+庆大霉素+载体抗性。

（GV3101）
庆大霉素40mg/ml （0.4g/10ml）；利福平50mg/ml DMSO溶解
200ml LB + 200ul母液
农杆菌转植物
1.植物去顶三天后转化，转前一天交足水
2.摇菌OD600=1.2~1.6 （先小摇后，取200ul大摇200ml）
3.室温5000rpm，15min，弃上清，悬浮于等体积渗透培养基中（200ml/转化）
每1000ml渗透培养基：1/2 MS 2.42g；蔗糖50g；MES 0.5g；用1M KOH调PH到5.8/5.7，定容到1000ml，加10ul 1mg/ml6-BA，加200ul silwet l-7，混匀，将菌液悬浮，OD=0.8左右。

不得低于0.7.
4.将菌液倒入大平皿中，植株浸泡20s盖上白盆，过夜后揭开正常培养。

质粒转化农杆菌感受态制备感受态制备1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif或Str；EHA105：Rif或 Str；GV3103：庆大霉素。

如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。

28℃培养。

3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。

2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。

使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。

4、DNA直接转化农杆菌：1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。

2天左右菌落可见。

（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）。

农杆菌感受态制备转化
农杆菌感受态制备
1.平板，单克隆培养
2、挑单克隆于5mllb培养基中，摇到饱和（1-2day）
3、50m离心管中4500rpm，
15min
4.用1ml氯化钙（预冷）悬浮50ml细菌，并在冰上操作。

5.每100微升分装在冷冻
管中。

用液氮快速冷冻后，将其储存在-70℃下
农杆菌转化
1.50ul活性质粒+5ul质粒，置液氮中速冻2min，
2.37℃热休克5min
3.加1mllb，28℃培养3-4h
3.8000rpm/min去除上清液，用200ullb悬浮，吹干涂布板。

农杆菌耐药性：利福平+庆大霉素+携带者耐药性。

（gv3101）庆大霉素40mg/ml（0.4g/10ml）；利福平50mg/ml
二甲基亚砜溶解200mllb+200ul母液
农杆菌转植物
1.打顶后三天进行改造，前一天送足够的水
2.摇菌od600=1.2~1.6（先小摇后，取200ul大摇200ml）
3.室温5000rpm，15min，丢弃上清液并将其悬浮在等体积渗透介质中（200ml/转化）：1/2ms2/1000ml渗透介质42g；蔗糖50g；梅斯0。

5g；用1mkoh调节pH至5.8/5.7，定容至1000ml，加入10ul 1mg/ml 6-BA和200ul SIL wetl-7，充分混合，以OD=0.8左右悬
浮细菌溶液。

不少于0.7
4.将菌液倒入大平皿中，植株浸泡20s盖上白盆，过夜后揭开正常培养。

双元载体的农杆菌转化
1.1农杆菌感受态细胞的制备
1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。

1.1.
2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。

1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。

1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。

1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。

4℃5000rpm离心5min，去上清。

1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。

1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。

1.
2. 双元载体转化农杆菌EHA105
取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min(液氮一分钟)。

再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。

28℃培养到形成单菌落。

其中YM 可以用LB 代替，第一次的CaCl2溶液可用溶液（0.1MCaCl2
0.01Tris-HCl（7.0）0.01 DTT）替代。

1.农杆菌感受态的制备感受态制备溶液:8% PEG 4000, 4% DMSO,50mM CaCl220Mm重悬细胞效果更好？挑取农杆菌(EHA105和LBA4404)单菌落接种于含氯霉素或链霉素和利福平5mLYEB液体培养基中,28℃,200～250r/min振荡培养30～36h,转入100mLYEB液体培养基中(1:20比例接种),在相同条件下培养至菌液OD600=0.4-0.6(约10h)。

然后冰上放置菌液15min，4℃,4000r/min离心10min,用适量50mmol/L冰浴CaCl2溶液重悬后在相同条件下离心,再用1/10原体积50mmol/L冰浴感受态制备溶液重悬,用1.5mL离心管分装成50μL小份,置于冰上，液氮速冻之后现用或-80℃保存备用。

Not Iike E.coli cells, fresh A.bacterium competent cells had higher transformation efficiency . As time went on . the transformation efficiency was decreased. When the storage time was longer than7 days and the temperature is higher than 4℃, A. bacterium lost the competent ability.2.冻融法转化农杆菌50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），与质粒混合均匀之后, 放置冰上30 min，然后置于液氮速冻3-5min,28℃水浴热激5min,然后加入无抗生素的LB培养基，28℃，200～250r/min振荡培养2h，涂布抗性平板，28℃静置培养36小时后挑菌落鉴定。

1. 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备1) 挑取单菌落GV3101，接种于5mL附加有50mg/L的利福平的液体LB培养基中，28℃，200rpm，过夜；2) 取2mL培养物至50mL液体LB培养基中，继续培养至OD600为0.5左右；3) 将培养物冰浴30min，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；4) 用l0mL 0.lmol/L冷的NaCl悬浮菌体；5) 4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；6) 1 mL 20mmo1/L冷的CaCl2悬浮，分装成50uL/管，液氮速冻后，-80℃保存。

农杆菌感受态制备与转化普通农杆菌感受态制备与转化：方案一1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。

2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。

3. 5k rpm离心5分钟。

4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。

5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。

如不是马上使用，可以将之按200ul分裝储存于-80℃待用。

6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。

7. 液氮中冷冻1分钟。

8. 37℃水浴溶化细胞。

9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。

10. 离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。

11. 涂板，28℃培养2-3天。

电转农杆菌感受态细胞制备与转化方案二1．挑取单克隆接种于2mlYEP（含50mg/l链霉素）液体培养基，28℃，250rpm，振荡培养过夜。

（如用5mlYEP，需培养36h）2．将菌液按1:100转移至200mlYEP（含50mg/l链霉素）培养液中，28℃，250rpm，振荡培养至OD=0.3(约4~5h)。

3．转入50ml的无菌离心管，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。

4．用20ml冰浴的HEPES(1mM，PH-7.0)重悬。

5．4℃，4000rpm离心10min，弃上清。

6．重复4、5步骤2~3次。

7．用2ml冰浴的10％甘油重悬。

8．每管100μl分装于1.5ml无菌的Eppendorf管中，-70℃保存。

1mM HEPES的配制：称取0.119gHEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500ml，用NaOH调pH至7.0，灭菌后待用。

注：HEPES需现用现配。

电击法转化农杆菌感受态细胞1．取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融。

2．加2μl质粒DNA于100μl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀。

农杆菌的转化流程方案一1.农杆菌的培养及感受态的制备①农杆菌菌株划YM平板，26-28℃培养48 h；②挑取单菌落接种到40 ml 无抗生素的YM液体培养基中，250 r/min，26-28℃悬浮培养12-16 h；③将菌液转入灭过菌的50 ml离心管中，4℃，8000 r/min,离心8 min；④弃上清，加入用100 mM NaCl (4℃预冷)重悬收集的农杆菌；⑤4℃，8000 r/min, 离心8 min；⑥弃上清，加入原始菌液1/50体积（800μ l/管（此时的感受态农杆菌可以直接用于转化）并分装成100μ l）的20 mM CaCl2重悬菌体；⑦置液氮中10 s，放入-20℃冰箱中保存备用。

2.农杆菌的转化（冻融法）将感受态农杆菌置于冰上，加入1μg质粒DNA（体积不宜超过10 μ l），充分混匀，冰上放置30 min；②置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中，待其融化；③加1 ml 无抗生素的YM 液体培养基于28℃，230 r/min 培养2-4 h；（或直接用1 mlμl，留500 μ l于管中④3000 r/min 离心2 min收集菌体，将上清吸去500 培养菌直接涂布含抗生素的YM平板）；⑤重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的YM平板上吹干, 28℃培养48 h；⑥挑取单菌落接种到筛选液体YM培养基中，28℃，250 r/min 培养48 h，将菌液用于保存或转化；注：EHA105抗利福平霉素，LBA4404抗硫酸链霉素。

在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素，以防止杂菌污染。

以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行。

3．转基因烟草体系的建立⑴烟草无菌苗的培养：①70%乙醇消毒烟草种子30 s后，用无菌水清洗两次，更换NaClO处理25-30 min，无菌水清洗四次；②将灭菌后的种子移至1/2 MS固体培养基（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、1.0 mg/L 维生素、2.0 mg/L 苷氨酸、3% 蔗糖、0.6-0.7% 琼脂（KOH 调至pH 5.7-5.8），于25-26℃，14 h光照/10 h黑暗条件下萌发；③14天后，将萌发出的烟草幼苗转移至含有相同1/2 MS培养基的组织培养盒中，同样条件下继续培养4-6周，小苗长出后可用于叶盘转化。

农杆菌感受态的制备及电击转化（1）将农杆菌EHA105菌株在含有50 mg/l 利福平的LB固体培养基上划线，28℃培养36~48 h；（2）挑取单克隆，于10 ml 含50 mg/l 利福平的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；（3）当OD600达到0.5~0.7时，6 000 r/min 4℃离心10 min收集菌体；（4）用预冷的10%无菌甘油洗菌体3次后用2 ml预冷的10%无菌甘油重悬沉淀，分装后于-70℃保存备用；（5）取重组质粒（pROK2-LbDREB）1 μl，加入100 μl EHA105感受态细胞，混匀后冰上放置；（6）将混合液放入预冷的电击杯中，1 800 V电击；（7）电击完成后迅速取出，加入500 μl LB液体培养基，迅速吸打混匀，尽可能多的将混合液移入无菌的离心管中，28℃摇菌1 h复苏；（8）取适量菌液涂布于含50 mg/l 卡那、50 mg/l 利福平的LB固体培养基上，28℃培养36~48 h；①农杆菌感受态细胞制备a. 在新活化的农杆菌EHA105/GV3101平板上，挑取单克隆于LB液体培养基（含利福平50mg/l）中，28℃，220r/min振荡培养至OD600达到0.6-0.7；b. 取1.5ml无菌离心管，每管分装1ml菌液，6000r/min离心10min；c. 去除上清，用1ml 10%无菌甘油重悬菌体，6000r/min离心10min，重复此过程3次，充分洗涤菌体以去除残留的培养基；d. 向洗好的菌体用100μl 20%无菌甘油重悬，-70℃保存备用。

②根癌农杆菌的电击转化a. 取-70℃保存的农杆菌感受态细胞，加入100ng重组质粒（pCAM-EG），吸打混匀后移入预冷的电击杯中；b. 1800V电压电击后迅速取出电击杯，加入500μl LB液体培养基，迅速吸打混匀；c. 尽可能多的吸出电击杯中的培养基，移入到无菌1.5ml无菌离心管中，28℃，振荡培养1h；d. 取转化的菌液200μl涂布于LB固体培养基（含利福平50mg/l和卡那霉素50mg/l）平板，28℃倒置培养24-48h。

农杆菌感受态细胞的制备［实验原理］在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。

在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。

感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。

农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。

将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。

制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。

［实验仪器、材料和试剂］一、仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，-70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，1.5ml离心管，冰浴，微量进样器及吸头。

以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。

二、材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株三、试剂：YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。

利福平（Rif）储液：50mg/ml20mM CaCl2，高压灭菌。

［实验步骤］1、挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；2、取过夜培养菌液1ml接种于50mlYEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；3、取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；4、加入1000µl 20mM CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；5、13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入500µl预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24hr内使用，或液氮中速冻1min，置-70℃保存备用。

质粒DNA直接导入农杆菌［实验原理］在低温下，外源DNA（质粒）可吸附到感受态细胞表面，诱导细胞吸收DNA。

一、目的及要求了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。

二、实验原理在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。

在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。

感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。

农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。

将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。

制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。

三、实验仪器、材料和试剂仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。

以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。

材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株试剂：YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌；链霉素（Sm）储液：125mg/ml0.15 N NaCl，高压灭菌。

20mM CaCl2，高压灭菌。

四、实验步骤1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜；2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5；3. 5000rpm, 离心5min；4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min；5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。

农杆菌的转化流程方案一1. 农杆菌的培养及感受态的制备①农杆菌菌株划YM平板，26—28℃培养48 h;②挑取单菌落接种到40 ml 无抗生素的YM液体培养基中，250 r/min，26-28℃悬浮培养12-16 h；③将菌液转入灭过菌的50 ml离心管中，4℃，8000 r/min，离心8 min;④弃上清，加入用100 mM NaCl （4℃预冷）重悬收集的农杆菌；⑤ 4℃，8000 r/min，离心8 min;⑥弃上清，加入原始菌液1/50体积（800μ l/管（此时的感受态农杆菌可以直接用于转化）并分装成100μ l)的20 mM CaCl2重悬菌体；⑦置液氮中10 s，放入—20℃冰箱中保存备用。

2。

农杆菌的转化(冻融法)将感受态农杆菌置于冰上，加入1μg质粒DNA（体积不宜超过10 μ l），充分混匀，冰上放置30 min；②置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中，待其融化；③加1 ml 无抗生素的YM 液体培养基于28℃，230 r/min 培养2—4 h;(或直接用1 mlμl，留500 μ l于管中④ 3000 r/min 离心2 min收集菌体,将上清吸去500 培养菌直接涂布含抗生素的YM平板）；⑤重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的YM平板上吹干，28℃培养48 h；⑥挑取单菌落接种到筛选液体YM培养基中,28℃,250 r/min 培养48 h，将菌液用于保存或转化；注：EHA105抗利福平霉素，LBA4404抗硫酸链霉素.在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素，以防止杂菌污染.以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行.3．转基因烟草体系的建立⑴烟草无菌苗的培养:① 70%乙醇消毒烟草种子30 s后,用无菌水清洗两次,更换NaClO处理25—30 min，无菌水清洗四次;②将灭菌后的种子移至1/2 MS固体培养基（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4)、1。

实验一农杆菌感受态细胞的制备［目的及要求］了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。

［实验原理］在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。

在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。

感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。

农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。

将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。

制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。

［实验仪器、材料和试剂］一、仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，-70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。

以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。

二、材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株三、试剂：YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。

利福平（Rif）储液：50mg/ml20mM CaCl2，高压灭菌。

［实验步骤］1、挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；2、取过夜培养菌液1ml接种于50mlYEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；3、取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；4、加入1000µl 20mM CaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；25、13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入500µl预冷的20mMCaCl，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24hr内使用，或液氮中速冻1min，置-70℃2保存备用。