蛋白互作PPT

锌指结构(Zinc finger motif)
由约30个氨基酸组成， 含两个胱氨酸和两个组氨酸 或有时是4个胱氨酸与锌原 子构成四部分复合物将氨基 酸链拉成指头状的环 （loop），可伸展到DNA大 槽上的碱基边缘产生互作。 含锌指结构的调节蛋白通常 有2-10个锌指，与相邻DNA 区段互作。大约有200多种 调节蛋白含锌指基序是最普 遍的DNA结合结构，锌亦可 稳定其它DNA结合蛋白。
非特异性DNA结合蛋白的结合
Proline-rich peptide 很多DNA结合蛋白结合结构域含脯氨酸及碱性氨基酸，如组蛋 白H1和H2B等的Ser/Thr-Pro-Lys/Arg-Lys(SPKK)多次重复为组蛋白末端 结合DNA的功能单元(结合小沟)； 染色质结合蛋白HMG-1结合富含A-T对的DNA小沟内(富含A-T 对DNA片段的小沟较窄)，其含两个PRGRP序列。 α-螺旋结构式样 结合DNA的α-螺旋其碱性氨基酸残基的分布有差异，如E.coli 的RecA蛋白α-螺旋一侧带4个碱性氨基酸残基，而另一侧为3个酸性氨 基酸残基，倾向于结合单链DNA； 蛋白质磷酸化 结合蛋白结合结构域的Ser或Tyr磷酸化作用影响其结合DNA， 主要是减少蛋白质中的净正电荷，中和能力下降。
同源异形基因均有一同源异形盒顺序（homeobox sequence），长约180核苷酸编码60个氨基酸，该区段折叠成 同源异形域（homeodomain）可识别并结合同源异形基因控 制的所有基因的5’侧翼区。同源异形域含四个α螺旋，第2、 3螺旋形成helix-turn-helix基序结合到DNA上8个碱基组成的 八聚体顺序（octamer sequence）由第3螺旋插入DNA大槽中。
蛋白质－DNA特异性识别的模型
普遍性结合→特异性识别 碱基对－ α-螺旋侧链的接触变化； Arg和Lys残基的数量和要求改变； DNA螺旋轴和α-螺旋轴的距离变动－分子挠性； 静电作用→ 氢键、范德华力(DNA沟槽内)； DNA大沟的特异性识别信息 DNA序列：决定大沟形成氢键的方向、范德华力大小→ 决定潜在氢键供体和受体的种类、数量和排布； DNA沟槽：双螺旋沟槽的宽窄、深浅直接影响不同蛋白 质的匹配、结合能力：A-DNA－大沟极深、小沟宽而浅，碱基 对在小沟一侧较暴露；B-DNA－大沟宽而略深、小沟窄而浅，大 沟的碱基对暴露于螺旋表面；Z-DNA－大沟消失、小沟窄而深。
蛋白质与DNA的普遍性结合
Type I －含碱性氨基酸α-螺旋与B-DNA的接触 α-螺旋侧链基团(碱性氨基酸残基Lys/Arg，1/2、1/5位) 处于伸展或弯曲状态与DNA大沟边缘(磷酸基，两条单链或单链 同侧)接触(形成氢键/中和电荷)而不与碱基直接接触，或碱性氨 基酸残基弯曲插入小沟内； Type II －反平行β-折叠与DNA的接触 反平行β-折叠与DNA主链骨架小沟匹配，可以是同向或 反向平行，由0.7nm重复产生碱性氨基酸残基-磷酸基电荷中和达 到稳定接触； Type III －伸展肽链与DNA的接触 伸展肽链相邻残基(Lys/Arg)与小沟两侧的磷酸基/戊糖形 成氢键或产生电荷中和。
DNA结合蛋白的基本结构域
螺旋-转折-螺旋(Helix-turnhelix, HTH) 含两个α-螺旋由一 段大弯曲连接(15~20个氨基 酸残基)，其一称识别螺旋 正好与DNA特异顺序上的大 沟或小沟吻合可结合到DNA 的沟槽中，而另一螺旋与部 分DNA序列互作起支持和稳 定识别螺旋的作用。调节蛋 白中通常有两个Helix-turnhelix形成二聚体（dimers） 正好插入DNA上相邻的两个 大小槽内，多数是大槽。
蛋白质与DNA结合的特性
普遍性结合 蛋白质与DNA的主链骨架接触，多数碱性或中性侧链与 磷酸二酯键的氧接触，短的极性侧链和-NH与DNA骨架接触提 供更多的立体接触特异性。 特异性结合 蛋白质识别DNA的特定序列，与碱基直接接触：直接氢 键、水分子介导氢键、疏水接触，多数发生在大沟内(碱基顺序 表面)。 1)DNA碱基顺序出现二度对称性结合蛋白质二聚体； 2)蛋白质-DNA结合发生在DNA分子的一侧； 3)结合蛋白质由识别螺旋结合DNA特定部位； 4)蛋白质-DNA分子发生构象变化达到相互作用； 5)蛋白质碱性氨基酸残基与DNA磷酸基形成离子键。
亮氨酸拉链结构 30~40个氨基酸残基每7个出现Leu的重复，二聚体形成 两个α-螺旋(每3.5个残基一圈)由Leu疏水平行结合，端部碱性 α-螺旋(30个残基)与DNA大沟结合(不结合时为无规则状态)。
碱性α-螺旋 两个两性α-螺旋(每个约12~15氨基酸)， α-螺 旋一些部位存在密集的碱性氨基酸，一侧是疏水氨基 酸，利于形成二聚体。 β-折叠 反平行β-折叠与DNA大沟结合，亦多数是二 聚体。 HLH 即helix-loop-helix, 由60个氨基酸组成，两个α螺旋富含疏水氨基酸残基，HLH上游区一般有碱性氨 基酸残基(10~20)。亦形成二聚体。
蛋白质与DNA特异性结合的复合物
DNA结合蛋白的二聚体 许多转录因子形成二聚体结构域，包括亮氨酸拉链、HTH和HLH 等，可以是同型二聚体或异型二聚体。 HTH复合物 为二聚体，一对识别螺旋－识别和结合DNA的大沟形成最佳的氢 键、盐键和范德华力作用，由稳定螺旋与DNA螺旋表面形成非特异性结合 (λCro蛋白)。 同源盒(homeobox)结构域复合物 真核生物中控制主要发育途径的主导基因－同源异形基因 (homeotic genes)的表达产物－homeobox蛋白，可结合多种DNA序列：保 守的N端(MSSLYYXN)-可变区(富含ASGPD)-N端同源盒肽(IYPWMC)-同 源盒结构域(2、3螺旋为HTH结构)-偏酸性C端。
DNA双螺旋碱基对的潜在氢键供体－受体 大沟和小沟表面碱基对氢键供体－受体与蛋 白质分子的氨基酸残基氢键供体－受体相互识别是 特异性识别的重要基础；
H
H
H3C
H
O T N O N H
H
N N A
H
N N N
H
H
N N
O N H N N H
H
H
N N
H H
C C
N O
C
C
识别氨基酸与碱基对共平面 α-螺旋1、4残基Cδ原子与碱基对共平面：识别一碱基对； 反平行β-折叠一对Cβ原子与碱基对共平面：形成氢键； 氨基酸残基与碱基对形成氢键 每个碱基对在大沟内显露3个潜在的氢供体或受体，特定的碱基 序列因而可以与特定的氨基酸残基形成匹配的氢键。 这可从碱基对的突变、修饰等的生物学作用得到了解。 小沟的“二元码”识别 小沟内TA/AT、GC/CG对形成潜在氢键的差异不大，即只识别 “二元码”，而大沟内TA/AT、GC/CG对分别形成潜在氢键的差异较大即 为“四元码”。
足迹法分析DNA上蛋白质结合位点
即DNA footprinting, DNA结合蛋 白质后不被 DNase酶 切，标记一 条链末端， 电泳分析可 鉴定DNA蛋 白质结合部 位。
亲和层析法纯化结 合蛋白 足迹法和序列测 定DNA的蛋白质结 合部位后人工合成 结合部位顺序，结 合到不溶性琼脂糖 等介质(凝胶柱)， 细胞蛋白提取物通 过时被结合而进一 步得到纯化。
第四章 蛋白质与DNA的相互作用
DNA结合蛋白的检测和纯化 DNA结合蛋白的基本结构域 蛋白质与DNA结合的特性 蛋白质与DNA的普遍性结合 蛋白质-DNA特异性识别的模型 非特异性DNA结合蛋白的结合 蛋白质与DNA特异性结合的复合物
DNA结合蛋白的检测和纯化
亦称凝胶移动变化测定(gel mobility shift assay-GMSA or band shift assay), 可以鉴定DNA与蛋白质结合的情况，将标记的DNA 小片段与蛋白质混合进行PAGE电泳，不结合蛋白质的DNA泳动 较快，结合蛋白质的DNA则滞留而缓慢移动。
亮氨酸拉链(Leucine zipper) 由两条相同或不同的肽段上两个α螺旋（helix）组 成的卷曲螺旋（coil），由一系列间隔7个氨基酸的亮氨酸残 基靠疏水作用形成，端部的两个α螺旋由leucine zipper将其 插入DNA的两个大槽内。含leucine zipper调节蛋白在正常细 胞中行使重要功能，其也在一些非调节蛋白中存在。Leucine zipper可将含helix-turn-helix和zinc finger的调节蛋白连接在白 含锌指基序是最普遍的DNA结合 结构，锌亦可稳定其它DNA结合 蛋白。锌指蛋白为两条反平行β折叠和一个α-螺旋组成， β-折 叠的两个Cys残基于α-螺旋的两 个相近His残基与Zn配位结合形 成锌指结构。一些非保守的残基 决定每一区域的特异性。多数蛋 白含多锌指结构域。 锌指结合于DNA大沟，与 5bp序列呈平行结合。
蛋白质与DNA的普遍性结合
蛋白质-DNA相互作用的结构因素：磷酸-戊糖骨架的结构互 补，旋转对称，相反电荷，氢键匹配，范德华力等 1)蛋白质、DNA螺旋的0.7nm重复：反平行β-折叠相间(1、3残 基)交替酰胺N原子、α-螺旋侧链距离(第1、5残基)、DNA双螺 旋相邻磷酸基相距0.7nm，基团间空间可容性、匹配性是蛋白 质-DNA相互识别、结合的基础； 2)蛋白质、DNA螺旋对称性: 多聚体蛋白亚基的对称性－平移 对称、二重轴对称、二重旋转对称、旋转对称，其中平移、二 重旋转对称与DNA序列对称性(反向重复序列)相匹配，以二重 旋转对称性为主。