DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤审批稿

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)的分类有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法：blue native（BN-PAGE），clear native （CN-PAGE），quantitative preparative native continuous（QPNC-PAGE）。

在一个典型的native PAGE方法中，复合物被CN-PAGE或BN-PAGE分离。

然后可以用其它分离方法如SDS-PAGE或等电聚焦做进一步分离。

随后切割凝胶，蛋白复合物每一个部分都被分开。

蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。

这样就可以提供一个蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。

1. Blue Native PAGEBlue Native PAGE是最古老的Native-PAGE技术。

是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白质鉴定染料的一种电泳方法。

这种方法的缺点是：考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的作用，可能导致复合物的分离；并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜在的猝灭作用。

Blue Native PAGE在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势，其分离范围在100KDa-10MDa。

在Blue native PAGE过程中，最重要的化合物就是考马斯亮蓝，除了增溶作用以外，蛋白质表面结合了大量的考马斯亮蓝染料而带上负电荷，这会导致即使碱性蛋白在pH7.5条件下也会向阴极迁移。

但是，蛋白质虽然带有大量的负电荷，然而其分离依据的根本还是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减小，蛋白质最终迁移到其自身大小与凝胶孔径相近似的位置而停止。

并且在分离膜蛋白的过程中，由于带有负电荷，而不会引起蛋白聚合，与酸性染料的结合，膜蛋白也由疏水性变成亲水性，溶解性大大提高。

1.2 Clear Native PAGEClear Native PAGE是通过除染色以的其它方法如SLS鉴定蛋白的电泳技术。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验一变性聚丙烯酰胺凝胶电泳配制溶液：1、30% Acrylamide（14.5 g 丙烯酰胺，0.5g 双丙烯酰胺，加水溶解，定容至50 ml，4℃，棕色瓶中储存）2、10% 过硫酸铵（0.5g APS，溶于5ml 去离子水中，4℃可储存数个月）3、10 ×TBE 缓冲液（10.8g Tris,0.744g EDTA,5.5g 硼酸，定容到100ml）4、TEMED5、20-200 DNA marker实验步骤：1、配置10%的胶10ml：5.5 ml water3.3ml 30% Acrylamide1ml 10 ×TBE0.11ml APS（现配现用）0.01mlTEMED2、立即将胶倒入两块板间并插好梳子，放置，待凝固30min，时间可以适当延长。

3、向电泳槽加入1×TBE，拔出梳子并用注射针筒多次洗涤点样孔，尽可能排除未聚合的丙烯酰胺。

4、将DNA marker 加到点样孔中，以120V（10V/cm）进行电泳直到燃料走到靠近底部的三分之一处，大约需要60-90分钟。

二银染实验银染溶液的配置：实验之前准备4℃水1、固定液（10%醋酸）：20ml冰醋酸，180mlddH2O混匀（通风厨中进行）2、染色液：将0.1g AgNO3溶解于100 ml ddH2O中，使用前加0.15ml37%甲醛溶液，必须储存于避光瓶中，防止接触皮肤（通风厨中进行）3、显影液：将6g Na2CO3溶解于200ml ddH2O中，冷却至4℃，使用前加0.3ml37%甲醛溶液（通风厨中进行）30μl0.1M五水硫代硫酸钠；（0.1M Na2S2O3。

5H2O：将1.24g Na2S2O3。

5H2O溶于50ml ddH2O）。

放入冰箱中冷却到4摄氏度。

注意事项：1、染色液和显影液要现用现配；2、显影液必须在4℃使用且必须保存在4℃；3、甲醛蒸汽致癌，在通风厨内操作；4、实验室中柔和的背景光线有利于降低背景颜色；5、显色不能在透光的盒子中进行；6、溶液不能直接倒在胶面上，应使盘倾斜后将溶液倒在盘的角上，或者将每种溶液各方一盘，然后将胶从一个盘转到另一个盘；7、溶液的体积必须足够将胶全部浸没；8、显色过程中盘中须轻轻摇动。

DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳实验（详细参考）Aptamer的稳定性考察—聚丙烯酰胺凝胶电泳Aptamer识别肿瘤细胞若选择4℃识别，则需要提前控温离心机，且样品在上样检测前宜放置于冰中；37℃就不用控温了。

Aptamer浓度：荧光标记的是50μM，没有标记的是100μMDNA提取-----注意实验中戴好橡胶手套，穿好实验服，以防苯酚粘到皮肤上。

1. 取7.3μl aptamer（100μM）于1460μl小鼠血清（无需过滤）中，在37℃细胞培养箱中孵育；2. 于不同时间点（6h, 5h, 4h, 3h, 2h, 1h, 1min）取200μl该小鼠血清到新的EP管中，加入200μl（等体积）的苯酚-氯仿（取苯酚-氯仿之前先将苯酚-氯仿混匀），混匀，管中溶液变浑浊；3. 用15000转/分离心10分钟，管中出现3层：上清、白色变性蛋白层、苯酚层；4. 取上清到新的EP管中。

在原EP管（变性蛋白层和苯酚层）中加入200μlTE溶液，混匀（该步进一步提取残留的DNA）；5. 用15000转/分离心10分钟，收集上清；6. 重复4、5步直到上清澄清；7. 在上清中加入等体积的氯仿（用于去除苯酚），混匀，用15000转/分离心10分钟，取上清到新的EP管中；8. 加入等体积乙醚（用于去除氯仿），混匀后静置10分钟，弃上层乙醚（乙醚比水轻，在上层）；9. 重复步骤8，敞开管盖15分钟，待乙醚挥发；10. 加入1/10体积的3M NaAc、2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃冰箱中30分钟（DNA沉淀）；11. 用16500转/分（转速不宜再高，EP管容易破裂！）离心30分钟；12. 将管中溶液吸出，转移至新的EP管中。

原管中保留约30μl溶液，打开管盖，待管中溶液蒸发；（我通常将EP管敞开，封上封口膜，再扎7、8个孔，放在通风橱中过夜。

）（管底看不到沉淀，因为DNA含量太低。

）13. 在管中加入16μL 1*TE溶液；14. 进行电泳分析前，将样品在95℃水浴中加热10分钟（小心管盖冲开或进水），在冰上骤冷（使DNA成单链），上样或保存在-20℃冰箱中。

聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤(总2页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤一、制胶前的准备1、玻璃板的准备用洗涤剂将玻璃板反复擦洗，然后用清水冲洗干净，待玻璃板晾干后，将1mm塑料薄片沾少许清水，使其贴在玻璃板上，然后将另一块凹行玻璃板与原玻璃板紧贴。

2、垂直平板支架的安装将准备好的玻璃板，放入垂直支架内，两侧用钢夹使其固定，钢夹的高度不要超过凹行玻璃的凹口处为宜，两侧选用力度大小适中、对称的钢夹。

3、玻璃板的密封将1%琼脂糖用微波炉加热融化后，倒入支架板底槽中，使其密封即可，然后用吸管吸取少量琼脂溶液，沿玻璃板两边的缝隙内加入，使其密封，待其冷却凝固后备用。

二、凝胶的制备1、30%的丙烯酰胺溶液的配制（1L）配方：丙烯酰胺（Acr）290g 甲叉双丙烯酰胺（Bis）10g步骤：称取样品，倒入烧杯中用蒸馏水定容至1 L将烧杯置于搅拌器上，使溶液充分溶解至透明将完全溶解的溶液分多次过滤到棕色容器中保存备用2、10ｘTBE溶液的配制（1L）配方：Tris：108g；硼酸：55g ；EDTANa２：步骤：称取各成分至烧杯用蒸馏水定容至1L用玻璃棒搅拌至溶剂完全溶解分瓶倒装待用3、PAGE凝胶的制备（一块胶为例）配方：30%的丙烯酰胺溶液10ml ; 10ｘTBE溶液4ml；双蒸水16ml;20%的过硫酸铵（AP）200ul;TEMED溶液20ul步骤：将各成分称量好之后混合好以备灌胶4、灌胶把垂直支架倾斜30°，将配好的PAGE凝胶溶液沿凹形玻璃平口处缓缓倒入至距平口7mm处为宜，倒入过程中要避免气泡的产生，发现有气泡产生时，要待气泡消失后再倒入。

灌胶完成后，用枪吸取少量水密封胶口，压平胶面。

当胶面与水之间有一条明显的界限时，表示凝胶已凝固，可以开始点样电泳。

三、点样及电泳1、ｘTBE缓冲溶液的配制量取950ml的蒸馏水，然后加50ml的10ｘTBE溶液至1000ml处，装瓶摇匀，备用。

D N A非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤Hessen was revised in January 2021DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂：1、30％聚丙烯酰胺(29:1)丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。

2、10％过硫酸胺过硫酸胺1克，水10ml。

3、TEMED4、5xTBETris 27克，硼酸克， EDTA(pH 10ml，定容至500ml。

二、银染试剂1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。

2、% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。

3、% NaOH：NaOH 克，水500ml。

4、37％甲醛。

三、配胶(6%)：30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；TEMED 20ul。

室温凝固时间>1小时。

四、银染：1、固定液固定10m。

2、水洗2m x3次。

3、% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。

4、水洗 20秒x2次。

5、% NaOH 100ml，加37％甲醛，混匀，显色3～10m。

6、水洗若干次，终止显色。

电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。

银染后胶面积将膨胀10％。

在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。

显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。

我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。

因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，厚。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶制备4.1 清洗玻璃板、灌胶用量筒和烧杯，玻璃板气干(制胶用玻璃板为硫化玻璃，灌胶面必须干净无水分，否则灌胶时容易产生气泡；烧杯、量筒和玻璃板如果有水，由于胶与水不相溶，易使胶不能牢固粘在玻璃板上)；4.2将平口玻璃板和凹口玻璃板放在桌面的支撑物（瓶盖等）上，给玻璃板滴少量100%乙醇，用质量好的纸均匀擦洗制胶面，气干；4.3 平口玻璃板和凹口玻璃板的三个边均匀的涂抹适量凡士林（凡士林太多不容易清洗）；放上需要厚度的板条，此步应注意密封好板条的相接处，用手将三边和接茬处按牢固，否则容易漏胶；然后用夹子（夹子夹在板条中间）将玻璃板固定于灌胶架上；4.4 配胶（8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，Acr:Bis=37.5:1）、灌胶;将以下母液按量混合均匀保存于4℃，一般一周内用完，溶液 120ml 240ml40%Acr 24ml 48ml2%Bis 12.84ml 25.68ml10XTBE(8.3) 12ml 24mlddH2O 70.8ml 141.6ml针对所选用的胶的大小和厚度量取适量以上混合液倒入干净烧杯，加入适量10%APS（催化剂）和TEMED（加速剂），摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固；（注：1 聚丙烯酰胺凝胶在凝固以前有毒，凝固后无毒，因此操作时应戴上手套； 2 板条和梳子厚度必须一致，否则将在点样孔中产生胶膜，影响点样和最后电泳质量）对于20cm x 17cm的玻璃板，除去板条尺寸，胶为16.5cm(宽) x 15.5cm(高) x 1mm(厚)，配制如下：胶混合液10%APS TEMED一板胶30ml 180μL 80μL两板胶60ml 360μL 160μL制胶及电泳（1）胶板的准备：首先确定两块玻璃板是否平整，用去污剂和清水将玻璃板洗涤干净，并用蒸馏水冲洗，晾干后用95%乙醇擦拭。

1 用1～2 ml 95%的乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭干净、均匀；（以平整、光滑的一面为正面）（第一次用的玻璃板最好擦2～3次）2 用加样枪取1ml配置好的亲和硅烷均匀分布于长玻璃的正面，用纱布涂抹均匀；（第一次用的玻璃板最好用亲和硅烷擦2～3次）3 用加样枪取0.5～1ml配置好的剥离硅烷均匀分布于长玻璃的正面，用纱布涂抹均匀；（擦至感觉特别光滑为止）4 用1ml 95%的乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭均匀；（可使亲和硅烷和剥离硅烷分布更未均匀，也可擦去多余部分）5 检查玻璃板正面有误纱布绒毛之类的异物，若有，可吹走；取0.4mm的边条，用纱布擦净，置于长玻璃板的左右两侧，靠边放置，将短玻璃板压于长玻璃板上，调整边条和短玻璃板的位置，使边条刚好处于边缘位置，但不突出，且长短玻璃板刚好对其，用夹子固定住玻璃板的两侧；以1×TAE配制1%琼脂糖凝胶并封住玻璃板底部，待凝胶凝固后用医用胶带密封；将玻璃板凹槽向上小角度倾斜放置，准备灌胶。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤实验原理：SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。

该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。

SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。

SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。

在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。

蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。

试剂和器材：试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。

可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。

2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。

过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。

3. pH8.9分离胶缓冲液：Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。

4. pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。

5. TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。

置4℃保存，临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。

器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶制备清洗玻璃板、灌胶用量筒和烧杯，玻璃板气干（制胶用玻璃板为硫化玻璃，灌胶面必须干净无水分，否则灌胶时容易产生气泡；烧杯、量筒和玻璃板如果有水，由于胶与水不相溶，易使胶不能牢固粘在玻璃板上）；将平口玻璃板和凹口玻璃板放在桌面的支撑物（瓶盖等）上，给玻璃板滴少量100临醇，用质量好的纸均匀擦洗制胶面，气干；平口玻璃板和凹口玻璃板的三个边均匀的涂抹适量凡士林（凡士林太多不容易清洗）；放上需要厚度的板条，此步应注意密封好板条的相接处，用手将三边和接茬处按牢固，否则容易漏胶；然后用夹子（夹子夹在板条中间）将玻璃板固定于灌胶架上；配胶（8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，Acr:Bis=:1 ）、灌胶；将以下母液按量混合均匀保存于4C, 一般一周内用完，溶液120ml 240ml40%Acr 24ml 48ml2%Bis10XTBE 12ml 24mlddHO针对所选用的胶的大小和厚度量取适量以上混合液倒入干净烧杯，加入适量10%AP（催化剂）和TEME（加速剂），摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固;（注：1聚丙烯酰胺凝胶在凝固以前有毒，凝固后无毒，因此操作时应戴上手套；2板条和梳子厚度必须一致，否则将在点样孔中产生胶膜，影响点样和最后电泳质量）对于20cm x 17cm的玻璃板，除去板条尺寸，胶为（宽）x （高）x 1mm厚），配制如下：胶混合液10%APS TEMED制胶及电泳（1）胶板的准备：首先确定两块玻璃板是否平整，用去污剂和清水将玻璃板洗涤干净，并用蒸馏水冲洗，晾干后用95%L醇擦拭。

1用1〜2 ml 95%勺乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭干净、均匀；（以平整、光滑的一面为正面）（第一次用的玻璃板最好擦2〜3次）2用加样枪取1ml配置好的亲和硅烷均匀分布于长玻璃的正面，用纱布涂抹均匀；（第一次用的玻璃板最好用亲和硅烷擦2〜3次）3用加样枪取〜1ml配置好的剥离硅烷均匀分布于长玻璃的正面，用纱布涂抹均匀；（擦至感觉特别光滑为止）4用1ml 95%勺乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭均匀；（可使亲和硅烷和剥离硅烷分布更未均匀，也可擦去多余部分）5检查玻璃板正面有误纱布绒毛之类的异物，若有，可吹走；取的边条，用纱布擦净，置于长玻璃板的左右两侧，靠边放置，将短玻璃板压于长玻璃板上，调整边条和短玻璃板的位置，使边条刚好处于边缘位置，但不突出，且长短玻璃板刚好对其，用夹子固定住玻璃板的两侧；以1X TAE配制1%琼脂糖凝胶并封住玻璃板底部，待凝胶凝固后用医用胶带密封；将玻璃板凹槽向上小角度倾斜放置，准备灌胶。

聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤如下：
1.清洗电泳仪和电泳板。

2.准备实验用液，将需要的磷酸缓冲液和聚丙烯酰胺溶液以及添加的阳离子
表面活性剂混合均匀。

3.调节电泳仪的温度、电压、时间等参数。

4.垂直安装电泳板，将电泳板安装在电泳支架中，保证其处于垂直位置。

5.将溶液添加到电泳板，并将电泳板放入电泳仪中进行实验，注意实验过程
中溶液的变化，以便及时调节电泳仪参数。

6.实验完毕后取出电泳板，用纸巾擦拭干净，重复上述实验步骤，直至所有
实验完毕。

7.染色及脱色，电泳后的凝胶条在1%氨基黑10B在7%醋酸溶液中固定并染
色1小时以上。

染色后的凝胶条用7%醋酸洗涤数次。

置于脱色玻管中，在同一电泳装置中电解脱色。

此时改用7%醋酸充装在液槽中。

通电后过剩凝胶之上再加一层大孔凝胶，样品聚合在最后的另一层凝胶中。

在我们的试验中省略的染料泳向正极。

脱色时电场强度25V/cm，电流10-15mA/管。

3-4小时脱色完毕。

有色的醋酸溶液通过盛有活性炭的漏斗过滤，即可除去染料，重新使用。

聚丙烯酰氨凝胶电泳配方与步骤（精华）储备液：1、丙烯酰胺浓缩液（30%T、2.7%C）:将29.2 g丙烯酰胺与0.8 g双丙烯酰胺溶解于70 ml去离子水中。

当丙烯酰胺完全溶解后，定容至100 ml。

采用0.5微米滤膜将溶液进行真空抽滤。

4℃保存于棕色瓶中。

保存时间不能超过1个月。

2、1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，浓缩的分离胶缓冲液：将18.2 g Tris-base溶解于约80 ml水中，HCl调节pH至8.8，加水定容至100 ml。

4℃保存。

3、0.5 mol/L Tris-HCl，pH 6.8，浓缩的积层胶缓冲液：将6.1 g Tris-base溶解于约80 ml水中，HCl调节pH至6.8，加水定容至100 ml。

4℃保存。

4、10%（m/V）SDS：将10 g SDS溶解于100 ml水中。

5、样品储备缓冲液[0.06 mol/L Tris-HCl，pH 6.8，2% SDS，10%甘油，0.025%溴酚蓝]:水 4.8 ml0.5 mol/L Tris-HCl，pH 6.8 1.2 ml10% SDS 2.0 ml甘油 1.0 ml溴酚蓝痕量室温下保存。

SDS-还原缓冲液通过在使用样品储备液前，每0.95 ml储备液中加入50微升2-巯基乙醇而制备。

催化剂1、10%过硫酸铵，现配现用。

2、TEMED: 使用瓶中未经稀释的TEMED。

阴凉干燥避光保存。

电泳缓冲液每100 ml中加入0.3 g Tris碱，1.4 g甘氨酸，1ml 10% SDS。

凝胶制备积层胶（10 mL）：水6.1 ml0.5 mol/L Tris-HCl，pH 6.8 2.5 ml10% SDS 0.1 ml丙烯酰胺储备液 1.3 ml电泳：常规电泳采用恒流模式：16-24 mA/mm凝胶厚度迷你电泳设备采用恒压模式：20-30 V/cm凝胶长度通常电泳持续到溴酚蓝到达凝胶底部。

染色与脱色：1、染色液: 将0.1%考马斯亮蓝R-250（m/V）溶解于40%甲醇（v/v）、10%乙酸中（v/v）。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA基本步骤与药品配方PAGE步骤1、清洗：1）戴上胶手套，将事先用NaOH溶液浸泡2—4h后的亲水板取出，用热水及洗涤剂刷洗需要使用的一面。

用试管刷轻刷，一般洗三次左右，直至干净，洗净后，置于通风橱风干。

取疏水板洗净后，置于通风橱风干。

（注意：洗的时候亲水板和疏水板要分开，所用刷子也要分开。

）2）用无尘纸沾取少量无水乙醇，擦净亲水版和疏水板，分别2次，风干。

2、硅化：倒亲水硅烷与亲水版上，轻涂，使其均匀涂抹（可先画圈然后上下刮擦），倒疏水硅烷与疏水板上，轻涂，使其均匀涂抹。

将两板置于通风橱中硅化15min以上。

3、装板：将疏水板置于下方，两边置隔离带，亲水版扣上，使端部齐平，立放；卡好两边卡子，固定好，取底座，上好板子，旋紧，平放。

手动调节水平。

4、制胶：1）准备好梳子、针筒、枪和枪头，在量筒中加入适量PAG，加入适量TEMED和APS。

立即混匀，迅速吸入针筒，注射器垂直注入胶板，倒插梳子，排除气泡，等待其凝固，大约需时20—30min。

（期间可向PCR产物中加入SGB）2）取出倒插的梳子，刮去废胶，用热水冲洗，前后上好电泳槽。

3）1×TBE缓冲液于电泳槽中预热半个小时，排除气泡。

插梳子，点样3.5ul。

5、电泳：45℃,75W，1h左右。

电泳完后取板，取胶，取梳子。

6、染色：1）固定：3L蒸馏水，20ml冰乙酸，400ml乙醇，在摇床上震荡5min。

2）漂洗：2L蒸馏水，10s钟内拿出。

3）染色：2L蒸馏水，5gAgNO3(可反复利用)，在摇床上震荡12min。

4）漂洗：2L蒸馏水，10s钟内拿出。

5）显色：2L蒸馏水，60gNaOH，8ml甲醛，在摇床上震荡直至显色，但是显色时间最好在15min以内。

6）用弱水冲洗3—5min，晾干观察，最后统计记录。

6﹪ PAGESGB 10ml (棕色瓶存放)去离子甲酰胺10ml二甲苯氰（FF）10mg溴酚蓝（含蔗糖）10mgEDTA（0.5mol/L，PH=8.0）200ulAPS(2.5﹪)2.5gAPS(过硫酸铵)，100ml水（一周之内用完）亲水硅烷（100ml 0.5﹪Bind-Silane）500ul Bind-Silane+500ul冰乙酸+99.5ml无水乙醇剥离硅烷（50ml 2﹪Repel-Silane）49ml氯仿+1mlRepel-Silane,混合后室温保存PAGE上样Loading Buffer(3×SGB)98﹪甲酰胺、0.025﹪二甲苯氰、0.025﹪溴酚蓝、10mmoL/L EDTA0.5mol/L EDTA29.225gEDTA溶于200mlddH2O中。

SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测技术实验报告自查报告。

实验名称，SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测技术实验。

实验日期，2022年10月15日。

实验地点，实验室。

实验目的，掌握SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测技术，了解其原理和操作流程。

实验过程，实验中，我们首先准备了样品DNA，并进行了PCR 扩增反应。

接着，我们将PCR产物与加载缓冲液混合，并将混合物加入到聚丙烯酰胺凝胶槽中。

随后，我们进行了电泳分离，并将凝胶进行银染处理。

最后，我们观察了凝胶上的条带，并进行了分析和记录。

实验结果，通过实验，我们成功地分离出了SSR的DNA条带，并进行了银染检测。

我们观察到了清晰的条带，并进行了相应的测量和分析。

实验结论，本次实验使我们掌握了SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测技术，加深了对其原理和操作流程的理解。

同时，我们也发现了实验中可能存在的一些问题，如电泳条件的控制和银染处理的技巧等，需要在今后的实验中加以改进。

自查情况，在实验过程中，我们严格按照操作流程进行实验，并且及时记录了实验数据和结果。

在实验结束后，我们对实验过程进行了回顾和总结，发现了一些可以改进的地方，并制定了相应的改进措施。

同时，我们也对实验设备和试剂进行了清理和整理，确保实验室的整洁和安全。

存在问题，在实验中，我们发现了一些操作不够规范和技术不够熟练的地方，需要加强相关知识的学习和实践。

同时，我们也对实验结果的分析和解释还有待进一步完善，需要加强相关知识的学习和积累。

改进措施，为了提高实验操作的规范性和技术水平，我们决定加强相关知识的学习和实践，提高实验技能。

同时，我们也将加强实验结果的分析和解释，积极参与讨论和交流，提高自己的科研能力。

总结，通过本次实验，我们对SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测技术有了更深入的了解，同时也发现了自己在实验操作和数据分析方面的不足之处。

我们将认真总结本次实验的经验教训，不断提高自己的实验技能和科研能力，为今后的实验工作打下坚实的基础。