NKCP精制纳豆菌培养物
- 格式：pdf
- 大小：687.06 KB
- 文档页数：12
下载文档原格式
合集下载
日本从2000年起开始展开了21世纪增进国民健康运动(健康...
高纯度纳豆菌培养物 NKCP开发NKCP的背景日本从2000年起开始展开了21世纪增进国民健康运动（健康日本21）。
此运动的理念特征在于，除了强调通过增强体质来延长寿命以外，还提倡要重视提高生命的质量即QOL。
用通俗的话来讲，就是“健康长寿”。
而血栓形成是妨碍“健康长寿”的重大风险因素。
在日本人的三大死因之中，心脑血管疾病占了30%左右。
也就是说，起因于当代日本人生活方式的血栓占了较大的比例。
另外，一旦血栓形成，即使免于死亡也会留下严重的后遗症,有的需要长期卧床，甚至由此导致终身卧床不起。
我们平时经常体验到的肩膀酸痛、习惯性头痛、手脚发冷、头晕等不仅在一定程度上降低了QOL，而且被认为与易形成血栓的血液状态有关。
我们认为，降低血栓形成的风险、稳定血液的凝固和纤溶状态，从而防止血管阻塞，将有利于提高健康质量、延长寿命。
这才是真正有意义的增进国民健康。
开发NKCP的经过我们着眼于日本传统食品“纳豆”中含有的作用于血液纤溶与凝固系统的成分，从而研究开发出了NKCP。
有报告认为，这种成分是由纳豆生产过程中使用的纳豆菌（B. subtilis natto）所产生的、能够分解缩氨酸的一种蛋白质。
由此可见，经常吃纳豆能够降低血栓形成的风险。
但是，如果出于增进健康而摄取纳豆的话，以下几点需要改进：1) 因为纳豆具有独特的风味，所以受个人嗜好的影响较大；2) 有研究证明因其含有大量的促进凝血的维生素K2，所以对血液抗凝剂有拮抗作用；3) 市场上的纳豆制品中的有效蛋白质含量参差不齐。
由此，我们扬长避短，在提高纳豆实用性的基础上开发出了一种新型食品素材，高纯度纳豆菌培养物<NKCP>。
NKCP是在大豆成分构成的液体培养基中对纳豆菌进行培养，然后通过部分精制加工，使纳豆的气味、菌体以及维生素K2的含量减少到没有问题的程度。
同时，NKCP的缩氨酸分解蛋白酶能够控制在一定含量。
本纳豆菌培养物及其制造方法已经作为第3532503号专利登记注册。
纳豆激酶
纳豆激酶纳豆激酶(nattokinase简称NK)是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶。
具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。
1980年在纳豆中被发现，由275个氨基酸按照固定排列方式组成，分子量是27724，有分解血栓的独特功能，活性效果用固有单位Fu表示。
目录1概述医学实验神奇之处作用研究药理作用含量标识2理化特点3选择方法4剂型对比5服用方法服用禁忌注意事项6调控机制7分解血栓8理化特性9分子改造10主要功能概述纳豆激酶的发现来自著名的"两点半实验"须见洋行博士1980年的一天，从事溶解血栓药物研究工作的日本心脑血管专家须见洋行博士，他突然想起纳豆不是纤维蛋白发酵的吗？而血栓最顽固的部分就是纤维蛋白，于是，下午两点半时，须见洋行博士把纳豆中提取的物质加入到人工血栓中。
原本准备第二天看结果的，但5点半的时候，一次偶然的察看，奇迹发生了，血栓居然溶解了2厘米，而平常用尿激酶做溶血栓的实验溶解2厘米需要近两天的时间，也就是说纳豆发酵物溶解血栓的速度是尿激酶的19倍之多。
于是，就将纳豆的这种强力溶栓物命名为纳豆激酶Nattokinase，简称NK，这就是震惊世界的溶血栓药物研究史上有名的“下午两点半”实验。
医学实验日本生物科学研究所与韩国首尔延世大学研究院心脑血管疾病中心共同研究关于纳豆激酶对高血压的效果。
该研究报告的结论是：“总之，纳豆激酶会导致收缩压和舒张压下降。
这个结果表明增加纳豆激酶的摄入，可能对于预防和治疗高血压起着重要的作用。
”该研究报告被国际权威学刊SCI收录(《Japanese society of hypertension》VOL.31NO.8.August，2008ISSN0916_9636)。
日本生物科学研究所与印度孟买市TNMC&BYLNair医院共同进行的急性脑中风患者应用纳豆激酶+低分子肝素+抗凝药物治疗的综合临床研究。
纳豆菌的提取和纳豆的制作
2. 在实验室用普通灭菌锅在充分放汽后，121摄氏 度高温高压处理15~20min，以豆子很容易被用手 捏碎为宜，宜蒸不宜煮，煮的水分太多。
3.在大豆被蒸熟前,在浅盘中铺好锡箔纸，用筷子等 尖细物在锡箔上打多个气孔，灭菌备用。搅拌时 要用的橡胶手套也要用开水灭菌。
4.大豆蒸熟后,不开蒸锅的盖子，直接倾去锅内的水。 将蒸锅的大豆无菌转移到灭菌盆或罐内，立即盖 盖，以免杂菌污染。
实验日程安排
• 第一周：配置牛肉膏蛋白胨培养基，酪蛋白培养基各250ml;100ml无 菌水；包好12个培养皿，6个试管；高压蒸汽灭菌
• 第二周：制备纳豆的稀释液10-2、10-3、10-4，利用涂布平板法对菌进 行培养
• 第三周：对培养出的细菌镜检，将枯草芽孢杆菌进行筛选，接种到酪 蛋白平板上进行筛选
纳豆菌的分离提取步骤
• 菌株分离：取上述品种的纳豆若干粒，放入装有 25mL 无菌水和十余颗玻璃珠的锥形瓶中，室温 下浸提。振荡多次，获得菌悬液，以十倍稀释法 稀释至10-2，10-3，10-4，涂布于牛肉膏蛋白胨 培养基。放入恒温培养箱中，30℃培养24h。
• 镜检：确定培养出的微生物的形态特点。
实验原理
食品纳豆中含有的纳豆菌，主要指枯草芽 孢杆菌（Bacillus natto），在通过其发酵 大豆的过程中，通过枯草芽孢杆菌对蛋白 质和糖类特别的直接利用功能，在枯草芽 孢杆菌的生长过程中，又利用大豆本身的 营养成分，分泌和合成了很多种酶类、维 生素、氨基酸及其它只有纳豆特有的营养 素和生理活性物质，使得发酵后的大豆中 更富营养，称之为纳豆。
5. 在已灭菌的杯中用10ml开水溶解盐（约0.1%）、糖（约 0.2%）和0.01%纳豆菌，如果觉得体积太小，不易均匀喷洒于 大豆中，也可用20—30ml的水，注意水的多少会影响纳豆的粘 滞性和嚼感，将混合液喷洒于大豆中搅拌均匀。 6. 把接种好的大豆均匀地平铺于灭好菌的锡箔纸上，厚约2— 3cm，不宜太厚。将锡箔纸折过来（或用另一种锡箔纸）铺盖 于豆层上面。然后在上面再铺接种好发酵剂的大豆，厚约23cm，上面也盖上一层纱。注意：如果发酵中勇气不好，做出 的纳豆会以苦，如果勇气太大，纳豆表面会过干，不利于充分 发酵。发酵环境的湿度要高。 7. 37—42摄氏度培养20—24h。也可以在30摄氏度以上的自 然环境中发酵，时间适当延长。当发酵完时，纳豆基本上做成 了，揭掉锡箔纸或纱时，会看到豆子表面部分发灰折色，室内 漂满纳豆的芳香。稍有氨味是正常的，但氨味过于强烈，则有 可能有杂菌生长了。
3.在大豆被蒸熟前,在浅盘中铺好锡箔纸，用筷子等 尖细物在锡箔上打多个气孔，灭菌备用。搅拌时 要用的橡胶手套也要用开水灭菌。
4.大豆蒸熟后,不开蒸锅的盖子，直接倾去锅内的水。 将蒸锅的大豆无菌转移到灭菌盆或罐内，立即盖 盖，以免杂菌污染。
实验日程安排
• 第一周：配置牛肉膏蛋白胨培养基，酪蛋白培养基各250ml;100ml无 菌水；包好12个培养皿，6个试管；高压蒸汽灭菌
• 第二周：制备纳豆的稀释液10-2、10-3、10-4，利用涂布平板法对菌进 行培养
• 第三周：对培养出的细菌镜检，将枯草芽孢杆菌进行筛选，接种到酪 蛋白平板上进行筛选
纳豆菌的分离提取步骤
• 菌株分离：取上述品种的纳豆若干粒，放入装有 25mL 无菌水和十余颗玻璃珠的锥形瓶中，室温 下浸提。振荡多次，获得菌悬液，以十倍稀释法 稀释至10-2，10-3，10-4，涂布于牛肉膏蛋白胨 培养基。放入恒温培养箱中，30℃培养24h。
• 镜检：确定培养出的微生物的形态特点。
实验原理
食品纳豆中含有的纳豆菌，主要指枯草芽 孢杆菌（Bacillus natto），在通过其发酵 大豆的过程中，通过枯草芽孢杆菌对蛋白 质和糖类特别的直接利用功能，在枯草芽 孢杆菌的生长过程中，又利用大豆本身的 营养成分，分泌和合成了很多种酶类、维 生素、氨基酸及其它只有纳豆特有的营养 素和生理活性物质，使得发酵后的大豆中 更富营养，称之为纳豆。
5. 在已灭菌的杯中用10ml开水溶解盐（约0.1%）、糖（约 0.2%）和0.01%纳豆菌，如果觉得体积太小，不易均匀喷洒于 大豆中，也可用20—30ml的水，注意水的多少会影响纳豆的粘 滞性和嚼感，将混合液喷洒于大豆中搅拌均匀。 6. 把接种好的大豆均匀地平铺于灭好菌的锡箔纸上，厚约2— 3cm，不宜太厚。将锡箔纸折过来（或用另一种锡箔纸）铺盖 于豆层上面。然后在上面再铺接种好发酵剂的大豆，厚约23cm，上面也盖上一层纱。注意：如果发酵中勇气不好，做出 的纳豆会以苦，如果勇气太大，纳豆表面会过干，不利于充分 发酵。发酵环境的湿度要高。 7. 37—42摄氏度培养20—24h。也可以在30摄氏度以上的自 然环境中发酵，时间适当延长。当发酵完时，纳豆基本上做成 了，揭掉锡箔纸或纱时，会看到豆子表面部分发灰折色，室内 漂满纳豆的芳香。稍有氨味是正常的，但氨味过于强烈，则有 可能有杂菌生长了。
纳豆激酶分离纯化及体外溶栓和溶血作用研究
纳豆激酶分离纯化及体外溶栓和溶血作用研究纳豆是日本的传统大豆发酵食品，由纳豆芽孢杆菌发酵而成，在日本已食用近千年。
1987年，须见洋行等经过对上百种食物的筛选，首次发现纳豆含有溶解血栓纤维蛋白的成分，并命名为纳豆激酶(nattokinase,NK)。
研究表明，NK 是纳豆发酵过程中纳豆芽孢杆菌分泌的一种丝氨酸蛋白酶[1]。
进一步的研究表明，NKc具有很强的体内外溶栓作用，与传统的容栓剂相比，NKc具有易提取、成本低廉和能口服吸收溶栓等优点，因而可能成为新一代的溶栓药物[2-4]。
为了对NKc的开发提供理论依据，本实验室在研究NKc纤溶活性之后，进一步对其体外溶栓和溶血作用进行研究。
1 材料与方法1.1 材料菌株：为本实验室自日本纳豆分离纯化菌种，保存于养琼脂斜面，营养琼脂配方为：细菌培养用胰蛋白胨(bacto-tryptone)，1%；细菌培养用酵母抽提物(b acto-yeast extract)，0.5%；NaCl,0.5%；细菌培养用琼脂粉(bacto-agar powd er)，1.5%PH7.2。
纳豆、纳豆提取液：按文献[5]介绍方法制备。
血平板：用生理盐水配制1%琼脂，加入新鲜脱纤兔血，混匀倾注平板，冷却凝固即成。
主要试剂：凝血酶、纤维蛋白原、标准尿激酶（中国药品生物制品检定所）；蚓激酶(30×104 U•粒-1，北京百奥药业有限责任公司)；牛血清白蛋白(上海生化试剂公司)；低相对分子质量标准蛋白质(兔磷酸化酶：Mr97.4×103,牛血清白蛋白：Mr66.2×103,兔肌动蛋白：Mr43.0×103,牛碳酸酐酶：Mr31.0×103,胰蛋白酶抑制剂：Mr20.1×103,鸡蛋清溶菌酶：Mr14.4×103)（上海生化试剂公司）；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法1.2.1 NKc分离纯化纳豆提取液经35%～75%饱和度硫酸铵分段盐析，离心收集沉淀，用50mmol•L-1磷酸缓冲液（PH 7.4）溶解，充分透析后获得纳豆激酶粗酶（NKc），再经Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱（1.0cm×60cm）层析，分管收集纤溶活性较高部分，脱盐，冷冻干燥后获得层析纯纳豆激酶（NKc），SDS-PAGE电泳检测纯度。
纳豆菌的分离筛选鉴定及其特性研究
纳豆菌的分离筛选鉴定及其特性研究纳豆菌的分离筛选鉴定及其特性研究引言：纳豆菌（Bacillus subtilis）是一种常见的芽孢形成细菌，广泛存在于土壤和水环境中。
它是一种重要的生物资源，被广泛应用于食品工业、农业生产、环境保护等领域。
纳豆菌能够分泌多种酶和代谢产物，具有抗菌、抗氧化、生物降解、益生菌等功能。
因此，研究纳豆菌的分离筛选鉴定及其特性对于充分发挥其应用潜力具有重要意义。
一、纳豆菌的分离筛选方法1. 样品收集：采集土壤和水样等样品，需避免污染和持续日晒等因素对采样造成的影响。
2. 纳豆菌的分离：将样品分别加入含适当营养物质的富养培养基中，利用稀释平板法或滤膜法，分离得到单菌落，进一步培养纳豆菌。
3. 分离纯化：将分离得到的单菌落进行传代培养，并以菌落形态、生理生化特性等为指标，通过不同培养基的筛选纯化纳豆菌。
4. 纳豆菌的形态鉴定：通过显微镜观察纳豆菌的形态特征，包括菌体形状、边缘、表面和内部结构等。
5. 纳豆菌的生理生化特性鉴定：包括产气性、嗜热耐酸性、氨基酸代谢能力、酶活性等指标的检测。
二、纳豆菌特性的研究1. 高抗菌活性：纳豆菌分泌的抗菌物质能够抑制多种病原菌的生长，包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等。
这一特性使得纳豆菌在食品工业中能够被应用于食品保鲜和乳酸菌发酵等领域。
2. 抗氧化能力：纳豆菌的代谢产物具有明显的抗氧化活性，能够清除自由基，减少氧化应激对细胞的损伤。
这一特性使得纳豆菌在化妆品、保健品等领域具有广阔的应用前景。
3. 生物降解能力：纳豆菌能够分解植物纤维素、蛋白质等复杂有机物，具有很强的生物降解能力。
这使得纳豆菌在环境保护方面可以被应用于废弃物处理、土壤修复等领域。
4. 益生菌效应：纳豆菌能够促进人体肠道中有益菌的生长和代谢，改善肠道微生物平衡，提高人体免疫力，对于调节肠道健康具有重要作用。
结论：纳豆菌具有多种重要特性，包括抗菌、抗氧化、生物降解和益生菌等。
通过分离筛选和鉴定纳豆菌的方法，能够为其应用领域的拓展提供有效的技术支持。
2008 纳豆菌高产培养基的成分优化
３．０
２．５
２．０
１％大 豆 蛋 白 胨
１．５
３％大 豆 蛋 白 胨
１．０
５％大 豆 蛋 白 胨
７％大 豆 蛋 白 胨 ０．５
０ ０ ６ １２ １８ ２４ ３０ ３６ 培 养 时 间／ｈ
图 ４ 氮源浓度对菌种生长的影响 Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
一般来说， Ｇ＋对镁离子的需要量比 Ｇ－ 大。本试 验菌株为革兰氏阳性菌（ Ｇ＋） ， 因此， ＭｇＳＯ４ 浓度是 影响菌种生长的因素之一。 ２．５．２ Ｋ２ＨＰＯ４ 和 ＫＨ２ＰＯ４ 浓度 将基础种子培养 基 中 的 ０．５％ ＮａＣｌ 用 不 同 浓 度 比 的 Ｋ２ＨＰＯ４ 和 ＫＨ２ＰＯ４ 代替， 其它 成 分 不 变 ， 接 种 培 养 ， 每 隔 ２ ｈ 测定其生物量并绘制生长曲线 （ 见图 ６） 。由图 ６ 可 知 ， Ｋ２ＨＰＯ４ 与 ＫＨ２ＰＯ４ 的 适 宜 浓 度 比 为 １∶１， 在 培 养 １２ ｈ 时 达 到 最 大 生 长 量 ， 其 ＯＤ６００ 值 为 ２．２２２， 明显优于其它浓度比的， 且提前 ２ ｈ 达到最 大生长量。
豆粕粉
硝酸铵 ０．５
０ ０ ４ ８ １２ １６ ２０ ２４ 培 养 时 间／ｈ
图 ２ 氮源种类对菌种生长的影响 Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｏｗｔｈ
生物量（ ＯＤ６００） 生物量（ ＯＤ６００）
２．３ 碳源浓度对菌种生长的影响 培 养 基 中 大 豆 蛋 白 胨 质 量 分 数 固 定 为 １％，
分不变， 接种培养， 每隔 ２ ｈ 测定生物量并绘制生 长曲线。由图 ２ 可知， 大豆蛋白胨作为种子培养基 的氮源优于其它种类的氮源。菌种对无机氮源利 用 速 度 较 慢 ， 对 豆 粕 粉 的 利 用 速 度 更 慢 ， 其 ＯＤ６００ 一直处于较低的水平。
纳豆菌的分离筛选与鉴定[1]
![纳豆菌的分离筛选与鉴定[1]](https://img.taocdn.com/s1/m/8cd0e5fb04a1b0717fd5dd47.png)
1
沈列的鉴定 .............................................................................................. 20
5.4 本实验的优缺点 ........................................................................................................ 20
第 3 章 实验方法 ................................................................................................................. 9
3.1 菌种分离 ..................................................................................................................... 9 3.2 菌种初筛 ..................................................................................................................... 9 3.3 菌种复筛 ..................................................................................................................... 9 3.4 固态发酵感观评价...................................................................................................... 9
沈列的鉴定 .............................................................................................. 20
5.4 本实验的优缺点 ........................................................................................................ 20
第 3 章 实验方法 ................................................................................................................. 9
3.1 菌种分离 ..................................................................................................................... 9 3.2 菌种初筛 ..................................................................................................................... 9 3.3 菌种复筛 ..................................................................................................................... 9 3.4 固态发酵感观评价...................................................................................................... 9
纳豆激酶发酵培养基的优化
纳豆激酶发酵培养基的优化姓名: 黄江坤班级：制药132学号：201304040225纳豆激酶发酵培养基的优化一、菌种选择选用纳豆枯草杆菌为发酵菌种二、纳豆菌的特性纳豆菌，通常为（0.7-0.8）um×(2.0-3.0)um,革兰氏阳性。
生长在葡萄糖琼脂的细胞原生质染色均匀。
芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，有鞭毛，能运动。
生长温度最高为45-55℃，最低为5-20℃。
孢子耐热性强。
三、纳豆激酶基因的表达NK基因起始密码子为GTG,其上游1b7p处为核糖体结合位点AAAGGAG,SD序列上游为刀T含量高达2%的转录调控区域,1143bp的阅读框架编码29个氨基酸的信号肚,77个氨基酸的前导肽及275个氨基酸的成熟肽。
结构基因的3末端为连续3个终止密码子TAA、TAG、TAA,终止密码子之后一段序列可形成茎环结构,即因子非依赖性终止顺序。
NK的最初产物是381氨基酸的蛋白前体。
其中N端的1一23氨基酸残基是信号肽,24一106氨基酸残基是前导肽。
蛋白前体切除N 端的106个氨基酸残基成为275氨基酸残基的成熟纳豆激酶;而去掉信号肽的产物(含前导肽和成熟肽)称为纳豆激酶酶原。
信号肽包含一个带3个正电荷的亲水氮端以及一段不带电荷的疏水残基序列,其功能是使NK正常分泌出胞外,其切割位点位于Ala一Glu一Aal保守序列之后。
信号肽与成熟肽之间具有的前导肽具有帮助NK正常折叠形成活性构象的功能,目前己发现一些与NK基因同源的枯草杆菌素蛋白及链激酶有与此相似的前肽区域。
四、纳豆激酶的蛋白质结构及生化性质：纳豆激酶（NK）是一种丝氨酸蛋白酶，由275个氨基酸组成的单链多肽结构。
NK肽链无二硫键,活性中心在Asp32,His64和Ser221,与底物结合部位在Serl25,Lenl26和Glyl27处。
NK与大多数枯草杆菌蛋白酶在核苷酸序列上和肽链链氨基酸组成上具有高度同源性,它与B.subtilis1168产生的枯草杆菌蛋白酶E仅有13个核苷酸不同,在肽链组成上仅有2个氨基酸不同,它们成熟肽链一级结构的相同性为99.5%;纳豆激酶等电点为pH8.6,纳豆激酶在pH6.0一12.0范围内稳定,pH低于5.0则不稳定。
纳豆激酶的生产提取工艺
纳豆激酶的生产提取工艺纳豆激酶(nattokinase简称NK)是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶，属于胞外酶。
具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。
一、发酵液生产1、菌种活化无菌室内用无菌环挑取保存的纳豆杆菌，连续划线于平板培养基上，盖上培养皿盖，倒置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。
2、种子液的制备种子培养基成分无机离子：MgSO4 0.5 g/L，K2HPO4 1 g/L其它成分：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L（pH=7.0-7.2）挑取斜面种子接入种子培养基，种龄8 h，装液量50 mL/250 mL，接种量2%，在37 ℃，200 r/min下摇床培养24 h。
3、发酵培养无机离子：MgSO4 2 g/L，Na2HPO4 9 g/L，NaH2PO4 0.5 g/L，CaCl2 0.4 g/L其它成分：麦芽糖15 g/L，大豆蛋白胨20 g/L，豆油2 g/L（pH=7.0）按照2% (V/V)的接种量转接种子液于发酵培养基中，装液量100 mL/500 mL，于30 ℃，200 r/min 摇床振荡培养72 h。
二、预处理和固液分离采用离心的方法。
将所得到的发酵液立即分装在的离心管内,冷冻离心10 min,转速5000 r/min。
收集上清液，弃去沉淀，调pH值到7.0，即得粗酶液。
三、提取1、分级盐析法使用分级盐析法，分段将杂蛋白和目的蛋白沉淀，达到分离的目的。
将粗酶液倒于锥形瓶内，利用蛋白质盐析原理,加入研细的固体(NH4)2SO4，使其浓度达到40%，4 ℃过夜，使其析出杂蛋白。
再将过夜的发酵液转移到干净的离心管内，然后离心，弃去沉淀，再次得到上清液，调节上清液pH值到8.6，后转移到锥形瓶内，加入研细的固体（NH4）2SO4，使其浓度达到65%，4 ℃过夜，使目的蛋白沉淀下来。
纳豆菌的抗菌作用研究
纳豆菌的抗菌作用研究
为了寻找天然生物防腐剂,对纳豆菌的抗菌作用及其发酵液的抗菌成分进行了研究.纳豆菌经培养取其上清液,用Sevage法提取蛋白,无水乙醇提取多糖,制备蛋白及多糖水溶液.采用管碟法测定培养物上清液、蛋白及多糖水溶液的抗细菌和真菌能力.研究发现培养物上清液、蛋白及多糖水溶液均具有广谱抗菌作用,对细菌、真菌皆有一定的拮抗作用,特别是对志贺氏菌、金黄*葡萄球菌、啤酒酵母具有较强的抗菌作用,其中以志贺氏菌最为敏感;同时经比较分析发现,抗菌作用的主要组分是蛋白;纳豆菌的抗菌物质可起到杀菌作用,而非抑菌作用.。
纳豆激酶液态发酵条件的优化及基因工程菌的制备
ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎＬｉｑｕｉｄＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｏＰｒｏｄｕｃｅＮａｔｔｏｋｉｎａｓｅａｎｄＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＢａｃｔｅｒｉｕｍｏｆＮａｔｔｏｋｉｎａｓｅＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＳｕｂｍｉｔｔｅｄｔｏＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｐａｒｔｉａｌｆｕｌｆｉｌｌｍｅｎｔｏｆｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒｔｈｅｄｅｇｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅＢｙＦｅｉｆｅｉＺＨＡＮＧＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．ＱｉａｎｇＸＩＯＮＧＭａｙ２０１２摘要摘要纳豆（Ｎａｔｔｏ）是大豆经纳豆枯草芽孢杆菌（ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＮａｔｔｏ）发酵而成的日本传统食品。
在纳豆的发酵过程中，发现一种具有高溶纤维活性的丝氨酸蛋白酶，须见洋行博士将其命名为纳豆激酶（Ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ，ＮＫ）。
纳豆激酶以直接及间接的方式作用于纤维蛋白，从而达到溶栓目的。
另外，纳豆激酶在自然条件下酶活性质比较稳定，安全性高，无毒副作用，半衰期长，分子量小，易被人体吸收，可作口服，作用直接迅速，且药效发挥持续时间长，可由微生物发酵生产，或基因工程技术制备，是一种很有潜力的新型溶血栓药物。
本课题对纳豆激酶的液态发酵条件做了进一步的优化研究，在此基础上，又进行了基因工程制备的研究，为改变纳豆激酶的传统发酵工艺做一定的基础。
首先，研究了摇瓶培养和发酵罐培养时培养基组分和培养条件对纳豆枯草芽孢杆菌产酶的影响。
采用摇瓶液体发酵时，利用单因素实验对碳源、氮源、金属离子、起始ｐＨ、温度、时间、接种量进行研究，运用ｓｔａｎｄａｒｄ．ｄｅｓｉｇｎｓ设计实验获得显著影响因子，以及采用响应面分析实验确定关键因素的最佳水平；之后应用７．５Ｌ发酵罐对搅拌转速、发酵过程的温度、ｐＨ、补料的添加、发酵时间等进行了实验研究。
结果表明：最佳发酵培养基为可溶性淀粉１９ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ：０．２４ｇ／Ｌ、豆粕粉１３．５ｇ／Ｌ、酵母膏１３．５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰ０。
纳豆菌の培养方法
【発明の名称】納豆菌の培養方法【発明者】【氏名】増井勝信【氏名】柴山裕治【氏名】原高教【氏名】淡谷耕蔵【氏名】山内勲【目的】納豆菌の培養方法を、粘性物質のみを選択的に効率よく培養することができる方法とし、また、納豆菌産生の粘性物質の製造方法を、プロテアーゼ活性の高い粘性物質を効率よく抽出できる方法とする。
【構成】シュクロースを炭素源とし、大豆ペプトン又は大豆粉砕物を窒素源とし、ＰＨ値６～８の緩衝液を添加した液体培地に、納豆菌（ＢａｃｉｌｌｕｓＮａｔｔｏ）を接種し、３０～４０℃の温度で培養した後、これを遠心分離して液相部分を分取し、この液体をアセトン中に混合して粘性物質を分離沈澱させ、これに緩衝液と水を加えた粘性物質水溶液をエチルアルコールに混合し、沈澱した粘性物質にさらにエチルアルコールを加えて粉砕し静置した後、沈殿した粘性物質を分取する。
【特許請求の範囲】【請求項１】シュクロースを炭素源とし、大豆ペプトンまたは大豆粉砕物を窒素源としてＰＨ６～８の緩衝液を添加した液体培地に、納豆菌（ＢａｃｉｌｌｕｓＮａｔｔｏ）を接種し、３０～４０℃の温度で培養することからなる納豆菌の培養方法。
【請求項２】シュクロースを炭素源とし、大豆ペプトン又は大豆粉砕物を窒素源とし、ＰＨ値６～８の緩衝液を添加した液体培地に、納豆菌（ＢａｃｉｌｌｕｓＮａｔｔｏ）を接種し、３０～４０℃の温度で培養した後、これを遠心分離して液相部分を分取し、この液体をアセトン中に混合して粘性物質を分離沈澱させ、これに緩衝液と水を加えた粘性物質水溶液をエチルアルコールに混合し、これを粉砕し冷暗所に静置した後、沈殿した粘性物質を分取することからなる粘性物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】【０００１】【産業上の利用分野】この発明は、納豆菌の培養方法、および食品や化粧料として用いられる納豆菌産生の粘性物質の製造方法に関するものである。
【０００２】【従来の技術】一般に、食用納豆は、大豆を水に浸漬して吸水させ蒸煮するか水煮にするかした後、稲わらに包み、４０～４３℃の温度で１２～１６時間放置して、豆粒の表面が灰白色の菌膜で覆われた状態で得られるものである。
纳豆菌液态发酵荞麦产纳豆激酶及其发酵产物中抗氧化活性物质的鉴定
纳豆菌液态发酵荞麦产纳豆激酶及其发酵产物中抗氧化活性物质的鉴定纳豆激酶(nattokinase简称NK)是一种由纳豆菌(Bacillus natto)产生的丝氨酸蛋白酶。
高活力的纳豆激酶产品开发成为具有溶栓功效的功能性食品领域的研究热点。
选择特色的发酵底物,并对发酵培养基及发酵条件进行优化,是降低纳豆激酶生产成本的重要途径。
本文以荞麦为底物通过液态发酵同时获得高活性纳豆激酶、富含多酚的发酵产物,为利用纳豆菌开发具有显著溶栓、抗氧化活性的功能性食品提供理论和方法的指导。
研究结果如下:(1)通过单因素法优化基础培养基,蛋白酶活从423.38 U/mL 提升至1340 U/mL,纳豆激酶酶活从340.45 U/mL提升至630U/m L。
在基础培养基中添加糙米和荞麦可显著促进纳豆菌产纳豆激酶、蛋白酶。
采用浸泡蒸煮处理四种谷物、延长发酵时间可显著提高其发酵产物的蛋白酶酶活、纳豆激酶酶活。
添加谷物(尤其是荞麦)发酵,可显著提高纳豆菌液态发酵产物抗氧化活性。
谷物多酚、肽类物质与微生物代谢产物是发酵产物发挥抗氧化活性重要的物质基础。
(2)以荞麦为原料,通过常温浸泡、加水打浆、联合耐高温α-淀粉酶的前处理方法,获得以荞麦为底物的发酵培养基。
采用酶法制备大豆蛋白酶解产物,作为补充氮源添加至发酵培养基,并对比其与商业大豆蛋白胨作为补充氮源时菌体生长规律以及代谢物质(酶、可溶性蛋白、还原糖、多酚及抗氧化物质)变化规律,通过优化纳豆菌液态发酵荞麦产纳豆激酶揺瓶、2.5 L发酵罐条件,可制备具有高纳豆激酶活性(152.5 FU/mL,与商业大豆蛋白胨组相比,酶活提升了38%)、富含谷物多酚(0.109 mg/mL)且具有强抗氧化活性的发酵产物(27.43μmol Trolox equiv/mL)。
本研究所制备的加脱脂乳粉的纳豆冻干粉的酶活及稳定性显著高于国产纳豆冻干粉,可以与著名进口商品媲美。
(3)从发酵产物中共分离鉴定出8种多酚类化合物:咖啡酸、原儿茶酸、丁香酸、绿原酸、儿茶素、芦丁、牡荆素、金丝桃苷。
一种纳豆菌培养基及其优化方法[发明专利]
![一种纳豆菌培养基及其优化方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/3b7096c8bcd126fff6050bec.png)
专利名称：一种纳豆菌培养基及其优化方法专利类型：发明专利
发明人：王国栋,刘书梅,杜磊
申请号：CN201710586418.9
申请日：20170718
公开号：CN107129956A
公开日：
20170905
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及纳豆食品开发领域，特别是涉及一种纳豆菌培养基及其优化方法。
本发明提供了一种纳豆菌培养基的配方，由以下成分组成：4％蔗糖、3％酵母浸粉、5％菠萝皮汁、
0.2％MgSO、0.1％KHPO、0.2％KHPO。
本发明对目前培养效果较好的培养基进行优化，选择更为高效的常见碳源和氮源作为基础培养基中的碳源和氮源的替代物，添加常见的水果蔬菜汁作为纳豆菌的生长因子，采用单因素试验筛选出最适宜浓度的碳源、氮源、生长因子，利用正交试验进行进一步筛选，最终选出最适合纳豆菌生长、增菌效果最好的培养基。
申请人：安阳工学院
地址：455099 河南省安阳市黄河大道安阳工学院
国籍：CN
代理机构：北京权智天下知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：王新爱
更多信息请下载全文后查看。
纳豆杆菌活性菌粉制备工艺研究
优化，对冻干保护剂进行了筛选，最终获得了活菌 数量较多、存活率较高的冻干菌粉。本研究可为 纳豆杆菌活性菌粉的制备提供参考。
１ 试验材料与仪器
１．１ 试验材料 纳豆杆菌 ＮａＧ１：济宁学院生命科学实验中 心分离；尿 素 （分 析 纯 ），北 京 奥 博 星 生 物 技 术 责 任有限公司；葡萄糖、氯化钠、氢氧化钠、蔗糖、可 溶性淀粉、氯化钙、氯化铵、硫酸锰、磷酸二氢钾、 甘露醇（分 析 纯 ），天 津 市 红 岩 化 学 试 剂 厂；脱 脂 奶粉（食品级），安佳乳品（广州）有限公司；β－环 糊精（分析纯），天津市瑞金特化学品有限公司。 固体 培 养 基：蛋 白 胨 １％，牛 肉 膏 ０．５％， ＮａＣｌ０．５％，琼脂 ２％，ｐＨ７．５；种子培养基：固体 培养基不加琼脂；基础碳源培养基：蛋白胨 １％， ＮａＣｌ０．５％，ｐＨ ７．５；基 础 氮 源 培 养 基：牛 肉 膏 ０．５％，ＮａＣｌ０．５％，ｐＨ７．５。 １．２ 仪器 可见分光光度计（７２２Ｓ），上海菁华科技科技 仪器有限公司；离心机（ＴＧＬ－２０Ｂ），上海安亭科
（１．济宁学院 生命科学与工程系，山东 曲阜 ２７２１５５； ２．山东龙大肉食品股份有限公司，山东 莱阳 ２６５２００）
摘 要：为了获得高活性纳豆杆菌冻干菌粉，研究采用单因素试验和正交试验对纳豆杆菌液态发酵培养
基进行了优化，并对冷冻保护剂进行了筛选。结果表明，纳豆杆菌最佳发酵培养基为：葡萄糖 １．５％、酵母膏
第 ４０卷第 ２期 济宁学院学报 Ｖｏｌ．４０ Ｎｏ．２ ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉｎｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
文章编号：１００４ １８７７（２０１９）０２ ０００１ ０５
２０１学１，李 涛１ ，徐樱丹１ ，刘信宏２
１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ＣａＣｌ２０．３％；选 取 浓 度 为 １０％ 的 脱 脂 奶 粉 作 保 护 剂，制 备 的 活 性 菌 粉 菌 体 存 活 率 达 ７３．５％。
纳豆菌文档
纳豆菌纳豆菌是一种常见的微生物，属于植物发酵菌的一类。
它以其特殊的产物纳豆而闻名，纳豆以其特殊的口感和丰富的营养素受到了广泛的关注和喜爱。
纳豆菌的分类与特征纳豆菌属于革兰氏阳性菌，菌株多样性较大，在微生物分类中被归类为葡萄球菌科。
它是一种厌氧发酵菌，在适宜的温度和湿度条件下可以迅速繁殖。
纳豆菌的孢子形态较为特殊，呈枝杆状或脆弱丝状。
纳豆菌具有以下特征：•擅长在富含碳水化合物的环境中生长繁殖，如大豆中的淀粉。
•能够通过产生纤维素酶和蛋白酶等酶类分解大豆中的复杂营养物质。
•在固定氮的过程中，纳豆菌能够将空气中的氮转化为植物可吸收的形式。
纳豆是一种将大豆经过纳豆菌的发酵而制成的传统食品。
下面是纳豆的制作过程：1.大豆的处理：将干燥的大豆浸泡在水中，使其吸收足够的水分，然后蒸煮至熟软。
2.纳豆种子的添加：在热的大豆中加入含有纳豆菌的纳豆种子。
3.发酵过程：将加入纳豆种子的大豆放置在适宜的温度和湿度下，让纳豆菌进行发酵。
在该过程中，纳豆菌产生的酶分解大豆中的复杂营养物质，并产生特殊的口感和气味。
4.成熟和保存：经过一定的发酵时间，大豆会转变为黏糊状物，即纳豆。
将纳豆存放在适宜的温度下，让其继续发酵并保持新鲜。
纳豆作为一种传统的日本食品，不仅因为其独特的风味受到人们的喜爱，更因其丰富的营养价值而备受推崇。
纳豆含有以下营养物质：•蛋白质：纳豆是一种优质的植物蛋白质来源，含有丰富的氨基酸，尤其是赖氨酸。
•纤维素：纳豆富含膳食纤维，有助于促进消化和预防便秘。
•维生素：纳豆富含维生素K、维生素B2和维生素E 等。
•矿物质：纳豆含有丰富的钾、钙、铁等矿物质，有助于维持人体健康。
•富含益生菌：纳豆中的纳豆菌是一种有益的菌群，可以促进肠道健康。
纳豆的食用方法纳豆可以单独食用，也可以作为其他食物的添加剂。
以下是几种常见的纳豆食用方法：•单独食用：将纳豆与调味料搅拌均匀后，直接食用。
•混合饭和面食：将纳豆与米饭或面食混合翻炒，增添口感和营养。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
NKCP精制纳豆菌培养物精制纳豆菌培养物＜NKCP ＞是我们着眼于日本传统发酵食品纳豆的健康增进作用所研发的一款功能性食品素材。
通过对纳豆菌培养物进行精制，基本去除了纳豆特有的气味及维生素K2，使其成为一种食用方便、且具有高度通用性的功能性食品素材。
NKCP中含有可发挥功效的纳豆菌所分泌的蛋白质（纳豆菌生成蛋白质）。
动物及人体试验结果均表明，持续摄取NKCP可有效维持健康的血液状态。
同时，其安全性也已得到验证。
在日本人的死亡原因中，因心脏病及脑血管疾患而死亡的比率约占30%，所以预防心脏病与脑血管疾患就显得非常重要，这对实现壮年期死亡减少也不例外。
此外，一旦患上此类疾患，即使最终能够免于死亡，也依然可能留下严重的后遗症，从而导致健康寿命缩短、生活质量极度下降。
研究结果表明，此类缺血性心脏病及脑血管疾患多起因于现代日本人生活方式所导致的血栓形成。
近年来的研究进一步发现长时间乘坐飞机后发病的、被称为“经济舱综合症”的“旅客血栓症”是由静脉血管产生的血栓堵塞了肺动脉而造成的“肺动脉血栓栓塞症”所致，且该病症除了乘坐飞机以外，还会在长时间驾车等行为后发病。
此外，就日常生活事例而言，肩部酸痛、脚部浮肿等可能也是因血液粘度上升而造成的末梢循环不良所致。
因此，若能保持血液凝固与纤溶的平衡、预防血栓形成，将会有助于延长健康寿命。
NKCP是我们着眼于日本传统食品“纳豆”所开发的食品。
据报告表明，纳豆中含有可作用于血液纤溶系统，发挥溶解血栓作用的物质，该些物质是纳豆菌（B. subtilis natto）所产生的、具有蛋白分解效能的蛋白质。
在另一方面，在最近的研究中发现，纳豆菌除了产生作用于纤溶系统的物质，还产生抑制血液凝固的物质。
这一发现表明，经常食用纳豆就有可能降低血栓形成的风险。
但是，由于纳豆具有独特的风味、摄取量也会因个人嗜好而异，且因与凝血相关的维生素K2的含量高，对血液抗凝剂有拮抗作用，加上市场上出售的纳豆产品中所含的人体有益物质的量也是大相径庭，要长期保持适当的摄取量存在着相当大的难度。
我们扬长避短，在提高纳豆实用性的基础上开发了食品素材、精制纳豆菌培养物＜NKCP＞。
NKCP 采用含有大豆成分的液体培养基，通过自行开发的方法对纳豆菌进行培养和精制加工，在浓缩有效成分的同时不但彻底去除了纳豆菌，还将纳豆特有的气味及维生素K2含量去除至可正常摄取的范围。
此外，将NKCP 中作用于抗凝及纤溶系统的成分的含量调配在一定范围内。
血液凝固、纤溶系统由复杂的生化反应构成，具有即使活化一个因子也不会导致系统失衡的结构。
这表示血液凝固、纤溶系统不易发生异常，但反之，若一旦失衡则易于形成血栓，再要将失衡的系统恢复至平衡状态则极其困难。
换言之，这意味着一旦形成血栓就非常难以溶解。
由此可见，有效预防血栓形成较溶解血栓更为重要。
NKCP 具有以下目前已知的作用。
① 已确认NKCP 在体外及体内均具有抑制血栓形成的作用。
② 已确认NKCP 在体外及体内均具有降低血液粘度的作用。
③ 已确认NKCP 在体外具有溶解血栓的作用。
NKCP 通过抑制血栓形成及血液粘度上升，将易于凝固的血液维持在正常状态，帮助血液在体内各个部位畅通无阻地循环流通。
同时，口服NKCP 可为血栓创造一个易于溶解的体内环境。
连续摄取NKCP 的效果凝固活性凝固活性纤溶活性纤溶活性连续摄取NKCP恢复原有的凝固 纤溶系统的平衡（1）关于NKCP所具有的功能要降低血栓形成的风险，以下几点至关重要。
1）使血液不易凝固、2）保持正常的血液粘度、3）溶解已凝固的血液（血栓）。
我们在纳豆菌（B. subtilis natto）所分泌产生的物质NKCP中发现了具有以上3大功能的物质。
（2）功能性相关学术数据１）使血液不易凝固的作用①NKCP对人体血液的抗凝作用在从签署了知情同意书的健康志愿者身上抽取的3ml静脉血中添加30μL的对象物质并翻转混合，然后在37℃的温度条件下加热250秒钟，使用乳胶免疫测定装置，对其离心上清中表示血栓形成程度的纤维蛋白单体（FM）进行了测定。
结果表明，添加用于对照的生理盐水时的FM值为160±29.3μg/mL，添加肝素钠（0.5IU/mL）时的FM值为6.0±1.1μg/mL。
NKCP自最终浓度0.005mg/mL起出现剂量依赖性FM减少的现象，FM 值在浓度为0.05mg/mL时显示较低数值，之后未发现FM随NKCP的浓度增加而减少的倾向。
NKCP与纳豆激酶含有物质的抗凝作用NKCP纳豆激酶含有物质浓度(mg/ml)2006年第54 届流变学研讨会独协医科大学法医学教室②NKCP 对大鼠血栓形成模型的抗凝作用我们通过血栓形成模型对NKCP 的抗凝作用进行了研讨。
通过损伤大鼠腹部降主动脉血管内皮细胞引发血小板凝集，由此诱发血栓形成。
采用in situ loop 法制成血栓模型2小时后，将NKCP注入十二指肠内，在注入6 小时后抽取腹主动脉血液，然后分别测定活化部分凝血活酶时间（APTT）及凝血酶原时间（PT）以作为内因性和外因性凝血功能的指标。
测定结果是，注入生理盐水的Control组的APTT为33.5±2.4秒，而NKCP100mg/kg组为52.0±4.5秒、250mg/kg组为63.3±2.9秒，结果表明，NKCP的注入显著地延迟了凝血时间。
PT的测定结果是，Control组为16.7±0.5 秒、NKCP100mg/kg 组为20.6±0.9秒、250mg/kg组为21.3±1.7秒，与APTT 相似，通过PT的结果也同样观察到了凝血时间的显著延迟。
由此可见，NKCP 具有抑制血栓形成的作用。
NKCP对大鼠血栓形成的抑制效果大和药品株式会社研究开发部2）防止血液粘度上升的作用关于NKCP 对人体血液粘度相关作用的研讨我们将已签署知情同意书的8名健康成人男子作为试验对象，让其单次服用1250mg 的安慰剂及 NKCP ，然后在摄取后的240分钟内按时间推移进行采血，由此测定血液粘度的变化。
血液粘度是采用一杉等人的方式，通过振动式粘度计进行测定的。
结果表明，NKCP 组在摄取105及180分钟后的血液粘度较摄取前均呈现出显著下降的变化。
此外，与安慰剂组相比，NKCP 组的血液粘度在摄取180分钟后也呈现出显著下降的变化。
摄取NKCP 时血液粘度的时间推移变化#： 采用邓肯多重比较法得出的与基准线间的差异，p<0.05 *： 采用配对t 检验得出的NKCP 与安慰剂间的差异，p<0.05独协医科大学 法医学教室血液粘度NKCP(n=8) 安慰剂(n=6)45分钟 105分钟 180分钟 240分钟3）溶解血栓的作用①NKCP 对人工血栓的溶解作用在含有人工血栓的生理盐水中加入少量NKCP，几分钟后血栓即开始溶解，3小时后血栓几乎完全被溶解。
(各枚照片的左侧为作为对照的生理盐水，右侧为加入了NKCP的生理盐水)10分钟后1小时后3小时后(取出至培养皿中的状态)J.Pharmacol Sci 99, 247-251(2005)②口服NKCP 对体内血栓溶解模型的作用在食饵中分别加入0.2%及1%的NKCP，然后使用激光照射大鼠肠系膜微血管使其形成人工血栓以建立实验性动脉血栓模型，用此模型研究摄取14周后的血栓溶解作用。
从形成人工血栓起，随着时间的推移测定血栓的大小，对血栓溶解作用进行了评估。
结果表明，与非投与组相比，NKCP经口投与组对内在性血栓溶解活性具有显著的剂量依赖性促进作用。
该作用相当于0.2mg/kg的组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）的功效。
根据用于试验的大鼠体重及摄取量，摄取含有0.2%及1%NKCP的饲料分别被推算为相当于约160mg/kg/天及800mg/kg/天的剂量。
NKCP的血栓溶解作用标准饲料值对相的小大栓血经过时间(分)*p<0.05Pathophysiol Haemost Tromb 2003;33：138-143③血栓溶解相关的源自纳豆菌的蛋白酶我们认为，NKCP对血栓的溶解作用主要源自纳豆菌所产生的蛋白质（Bacillopeptidase F）。
Bacillopeptidase F由与纳豆菌同属一个种的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产生，并已被确定为分泌于菌体外的5种蛋白酶之一（表1）。
表1 Bacillus subtilis向细胞外分泌的酶1）Journal of Bacteriology, Vol. 172, pp. 1019-1023, 1990.2）The Journal of Biological Chemistry, Vol. 265, pp. 6845-6850, 1990.3）Journal of Bacteriology, Vol. 172, pp. 1470-1477, 1990.4）Experientia, Vol. 43, 1110-1111, 1987.5）The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, pp. 24690-24696, 2001.6）Mol Gen Genet 1990 May; 221(3)：486-90（3）临床试验实绩①关于纳豆菌由来蛋白质对人体血液凝固纤溶系统的影响我们请23名包括存在血栓症危险的代谢性疾病患者在内的普通成人连续2个月摄取NKCP250mg，然后分别对第1个月及第2个月的凝血、纤溶系统参数进行了测定，同时也对试验对象的自觉症状进行了调查。
结果表明，ELT在第1个月及第2个月较摄取前显著减少，同时，t-PA在摄取2个月后的测定时显著上升，虽然纤溶系统出现了亢进，但ELT及t-PA的测定值均在正常范围内。
此外，尽管FDP在开始摄取的1个月后出现了显著减少，但在2个月后的测定时又回到了摄取前的相同数值。
在自觉症状方面，与摄取前相比，肩部酸痛症状在第1个月及第2个月均得到显著改善。
摄取NKCP后的纤溶·凝固参数的变化（23名）数据表示的是平均值±标准偏差采用邓肯多重比较法对显著性差异进行检验：*p<0.05，**p<0.01摄取NKCP后的自觉症状的变化数值表示的是患者数。
采用多重比较法对显著性差异进行检验日本生物流变学学会杂志第18卷（1）2004①肽酶活性测定法（合成基质法）将发色合成基质S-2251（H-D-缬氨酰-L-亮氨酰-L-赖氨酰-对-硝基苯胺二盐酸盐）作为基质，在37℃的温度条件下反应后，测定405nm的吸光度。
将1分钟游离出对硝基苯胺1nmol时的酵素活性定义为1unit。
②纳豆菌生成蛋白质测定法（ELISA法）采用ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）法对具有肽酶活性的纳豆菌生成蛋白质进行定量测定。