项目8：外界因素对细菌的不利影响【目的要求】1.认识常用的消毒灭菌器和滤菌器。
2. 掌握常用消毒灭菌方法。
3. 初步掌握药敏试验纸片琼脂扩散法的操作。
【实验材料】1. 高压蒸汽灭菌器、干烤箱、滤菌器等。
2. 培养基普通琼脂平板、肉汤培养基、M-H（水解酪蛋白琼脂）培养基、抗生素药敏纸片、常用化学消毒剂等。
3. 菌种枯草芽胞杆菌、大肠埃希菌肉汤培养物，金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌6h或18～24h培养物等。
4. 其他紫外灯、黑纸片、无菌镊子、水浴箱、温度计、无菌棉签、酒精灯、接种环等。
【实验内容与方法】微生物广泛存在于周围环境中，其中有些又是病原微生物，从预防感染出发，医务工作者必须严格执行无菌操作，对所用的物品和工作环境进行消毒灭菌，确保医疗与科研正常进行。
消毒灭菌主要是通过理化因素使微生物的主要代谢发生障碍，或菌体蛋白质变性凝固，或破坏其遗传物质，导致微生物死亡。
这里主要介绍物理因素杀灭微生物的几种方法，以及相关器材的使用。
（一）常用消毒灭菌器和滤菌器的介绍（示教）1. 高压蒸气灭菌器是目前医院常用的灭菌器，高压蒸气灭菌法是一种迅速而有效的灭菌方法。
（1）种类：高压蒸气灭菌器是目前应用最广泛、灭菌效果最好的灭菌器具，其种类有手提式、直立式、横卧式等。
它们的构造及灭菌原理基本相同。
（2）构造及原理：高压蒸汽灭菌器是一个密闭的耐高温和耐高压的双层金属圆筒，两层之间盛水。
外壁坚厚，其上方或前方有金属厚盖，盖有螺栓，借以紧闭盖门，使蒸汽不能外溢。
高压蒸汽灭菌器上还装有排气阀、安全阀、压力表及温度计。
加热后，灭菌器内蒸汽压力升高，温度也随之升高，压力越大，温度越高。
（3）用法与注意事项：使用高压蒸汽灭菌器时，需加一定容量的水于灭菌器内，放入待灭菌物品后，盖好器盖并将螺旋拧紧加热，待压力升至34.47kPa时，打开排气阀，排除器内冷空气，再关闭排气阀。
待蒸汽压力升至所需压力(一般为103.43kPa)时，持续15～20min即可达到灭菌目的。
灭菌完毕，停止加热，缓缓排气，待其压力下降至零时，开盖取物。
灭菌时必须加足量的水；盛物桶内的物品勿置过挤；冷空气必须排尽；切不可突然打开排气阀门排气减压，以免因压力骤然下降而使器内液体外冲。
（4）用途：高压蒸汽灭菌可用于耐高温、高压及不怕潮湿的物品，如普通培养基、生理盐水、纱布、敷料、手术器械、玻璃器材、隔离衣等的灭菌。
2. 干烤箱为干热灭菌器，干热的杀菌作用是通过脱水干燥和大分子变性完成的。
（1）构造：干烤箱是中间夹着石棉的双层金属制成的方形或长方形箱，箱底装有热源，箱内有数层金属架，并附有温度计和自动温度调节器等装置。
（2）用法：将需要灭菌的物品包装后放入箱内，闭门加热。
温度升到160～170 ℃，维持2h，可达到灭菌目的。
灭菌后停止加热，待温度下降至40℃以下方可开门取物，否则其内物品(如玻璃器皿等)会因温度骤然下降而爆裂。
（3）用途：干热灭菌主要用于要求干燥的、耐高温的物品灭菌，如玻璃器材、凡士林、液体石蜡、药粉等的灭菌。
注意事项：（1）温度不可超过180℃以免烧焦棉塞及包装纸。
（2）灭菌后须待温度下降至接近室温时方可打开箱门，否则冷空气骤进而使玻璃器皿破裂。
（3）干烤灭菌主要应用于玻璃、陶瓷制品、凡士林、液体石蜡等的灭菌。
3. 滤菌器是一种用物理阻留的方法将液体中细菌除去达到无菌目的的仪器。
常用于不耐热的培养基、血清、溶液及药品的除菌或分离细菌外毒素及病毒等。
常用的滤菌器有两种：①蔡氏滤菌器：为金属滤菌器。
以石棉为滤板，每次用后换一石棉滤板。
石棉滤板按孔径大小分为K号和EK号两种。
前者可供滤清用，后者能阻止细菌通过。
②玻璃滤菌器：由用玻璃粉制成，用时比较方便，但孔径易堵塞。
孔径大小由0.15～250μm不等，一般分为G１～G６，G５和G６号均可阻止细菌通过。
滤菌器使用法：将清洁的滤液、滤瓶等分别用纸包装后，15磅高压蒸汽灭菌20分钟。
以无菌操作将滤器与滤瓶装妥，并使滤瓶的侧管与抽气机的抽气橡皮管相连（或中间装压力计及缓冲空瓶）。
倒入被滤液体，开动抽气机，使滤瓶中压力减少，滤液流入瓶中的试管内。
滤毕，关闭抽气机，先将抽气橡皮管从滤瓶侧管处拔下，再启开橡皮塞，迅速以无菌操作方法取出瓶中滤液，移放于无菌玻璃器内。
若滤瓶中原装有试管者，则将该盛有滤液的试管取出即可。
（二）煮沸杀菌试验（操作）1. 取六支肉汤培养基，编为1、2、3、4、5、6号，1、2、3三管接种大肠埃希菌(无芽胞菌)，4、5、6三管接种枯草芽胞杆菌(有芽胞菌)。
2. 将1、4两管同时放入100℃水浴内煮沸5min，取出置37℃温箱培养18～24h观察细菌生长情况。
3. 将2、5两管同时放入100℃水浴内煮沸1h, 取出置37℃温箱培养18～24h观察细菌生长情况。
3、6两管不加热作对照，置37℃温箱培养18～24h观察细菌生长情况。
结果：3、6两对照管有细菌生长；1、2、5管无细菌生长；4号管有细菌生长。
（三）紫外线杀菌试验（操作）紫外线中波长为200~300nm者具有杀菌能力，其中265~266nm的杀菌作用最强。
日光中含有一部分紫外线，而医学上使用的常以人工紫外线灯产生。
常用的是水银灯，灯管由石英制成，管内充满压强为2mmHg的氩和几滴水银。
封入两端的电极是螺旋形的钨丝，其表面涂碱土族元素的氧化物。
当电极被烧热时，钨丝上氧化物就放出大量电子。
因而交流电流，故两端灯丝交互成为阴极，使用时按上电键，先将钨丝烧红，这时在钨丝附近形成很多电子。
经2~3秒钟后，打开电键，截断电路（有的水银灯装有起动器（Star），以替代电键的开关），此时由于扼流圈的存在，发生脉冲高电压；同时在管内的氩气开始辉光放电，使管略发热，水银蒸汽压变为0.lmmHg时，即在其蒸汽内产生电弧，而这种电弧里含有大量的紫外线。
[原理] 其杀菌作用主要是因为DNA吸收了紫外线引起胸腺嘧啶形成二聚体，从而干扰了DNA的复制，轻则发生突变，重则导致死亡。
紫外线杀菌力强而稳定，但穿透力弱，不能透过普通玻璃和有色纸张，因此，只适用于直接照射的物体表面消毒或空气消毒。
[使用方法] 将涂有细菌的平皿放置在距紫外线60～100cm处，直接受紫外线照射30min后，37℃孵育24h后观察生长情况。
1. 用无菌接种环取大肠埃希菌肉汤培养物，密集划线接种于普通琼脂平板。
2. 用无菌镊子把经灭菌的黑色纸片贴于平板表面中央部分。
3. 打开皿盖的2/3，置于紫外灯下距离约20～30cm处照射30min。
4. 除去纸片，盖好平皿盖，置37℃温箱培养18～24h观察细菌生长情况。
结果：纸片及平皿盖遮盖处有细菌生长，未遮盖处无细菌生长。
（四）细菌对药物的敏感试验-纸片琼脂扩散法（亦称K-B法）(操作)【材料】普通琼脂平板、葡萄球菌培养液、大肠杆菌培养液、灭菌棉签、灭菌滤纸片、琼脂平板、尖头镊子、青、氯霉素纸片。
【方法】1. 取M-H琼脂平板一个，用蜡笔在平皿底部标出贴药敏纸片的位置。
各纸片中心距离应大于24mm，纸片中心距平板边缘距离应大于15mm。
2. 用无菌棉拭子蘸取6h的大肠杆菌或葡萄球菌培养物(菌液)，在管内壁旋转挤去多余菌液，均匀涂布在M-H培养基表面，反复涂布3次，每次旋转平板60度角度，最后沿平板内缘涂抹一周。
3. 待稍干后，用无菌镊子取药敏纸片，按标记位置贴于培养基表面。
4. 将贴上纸片的平板置37℃温箱培养18～24h后观察结果。
结果：对抗生素敏感的细菌在药敏纸片的周围形成抑菌环，抑菌环直径标准判断因抗生素及细菌种类不同而异，根据抑菌环直径的大小，结合药物的性质，报告细菌对药物的敏感性。
一般以敏感、中度敏感、耐药来判定药敏实验结果。
判定标准：实验条件不同判定标准可有所不同。
一般抑菌环直径在15mm以上者为高度敏感，10～15mm为中度敏感，10mm以下为低度敏感，无抑菌环者为耐药。
附：抑菌环解释标准及相应的最低抑菌浓度环丙沙星 5 ≤1516-20 ≥21诺氟沙星10 ≤1213-16 ≥17利福平 5 ≤1617-19 ≥20万古霉素30 ≤910-11 ≥12【附录】药物纸片的制备：取普通滤纸用打洞机打成直径6mm的圆形纸片，浸于一定浓度的抗生素中，每枚纸片的药物含量：青霉素1u，其它抗生素10μg，磺胺100μg。
（五）皮肤消毒试验(操作)【材料】无菌棉签、镊子、2%碘酒、75%酒精、普通琼脂平板【方法】1．将普通琼脂平板底部用记号笔分成二等分，分别注明“消毒前”与“消毒后”。
2．将一手指，在注明“消毒前”的平板表面，轻轻地来回涂抹；然后将此手指用2%碘酒消毒，再用75%的酒精脱碘，待干后，再在注明“消毒后“的平板表面轻轻涂抹。
将琼脂平板置37℃孵箱中培养24小时，观察结果。
【实验报告】1. 列出常用消毒灭菌器和滤菌器的种类，说明其使用方法、用途及注意事项。
2.记录并分析煮沸杀菌试验的实验结果。
3.记录并分析紫外线杀菌试验的实验结果。
4. 记录药物敏感试验的方法及结果，分析其实际意义。
5. 记录皮肤消毒试验的实验结果。
