扫描电镜微生物样品的处理

扫描电镜样品制备方法一、取材组织块小于3立方毫米（单细胞培养或收集展片于盖玻片或滤膜上）。

二、固定前固定：2.5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）固定2小时或更长时间。

用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。

后固定：1% 锇酸固定液，固定1-2小时。

用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。

三、脱水＊脱水在4度冰箱内进行，所有脱水步骤建议在专用的冷冻干燥杯中进行，冷冻干燥杯请于实验前一天到电镜室领取。

＊整个过程，样品不要暴露于空气。

1.乙醇脱水，每一级10-20分钟：30%乙醇—50%乙醇—70%乙醇—90%乙醇—95%乙醇—100%乙醇；2.然后从乙醇逐步过渡到叔丁醇，纯叔丁醇每次10分钟，3次以上；此系列操作均在25度环境中进行；3.纯叔丁醇4度冰箱过夜，样品结晶。

四、冷冻干燥＊需事先预约冷冻干燥时间；第二天上午八点半讲冷冻结冰的样品用冰盒送至电镜室进行冷冻干燥。

五、喷金附件1：细菌类样品的前处理方法1.盖玻片泡酸，清洗，烘干。

用剪刀剪碎，挑出5mm*5mm大小玻片备用。

玻片过大或者过厚影响观察效果。

2.菌液或样品悬液离心，需要可进行清洗，加入固定液，吹散固定，于4度冰箱固定2小时左右。

3.固定结束后，去固定液，加入PBS浸泡清洗，10分钟。

离心去PBS，固体沉淀根据量多少，加入适量PBS，制成浓度较高的悬液（目测较混浊）。

样品浓度对后期吸附有较大影响，浓度过低可能吸附量会很少。

4.取鸡蛋清，稀释3-5倍（一定要稀释！蛋清过浓会包裹样品），之前准备好的玻片放入液体内蘸一下，取出晾干至触摸感觉有点黏的状态（快干的状态）。

将第3步取得的悬液滴在玻片上，吸附30秒到1分钟，用滤纸吸去多余液体。

（样品悬液在玻片上停留时间过长将导致样品被蛋清完全包裹而无法观察）。

5.在玻片上滴加固定液，固定10分钟，固定后用PBS浸泡清洗10分钟，放入干燥杯开始进行脱水。

扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。

而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。

因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。

扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。

例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。

我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。

此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。

主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。

此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。

如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。

另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。

对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。

但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。

∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。

∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。

样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。

而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。

但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。

扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。

一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。

扫描电镜
1、收集培养好的新鲜菌体，用1×PBS（pH7.0）或0.9% NaCl漂洗样品2-3次，每次15min ，5000rpm离心3min,去上清；
2、加2.5%的戊二醛溶液1ml,轻摇充分混匀，重悬菌液，4℃固定4h或过夜；
3、5000rpm离心3min,去上清，加入500ul PBS漂洗样品三次，每次15min （可用枪轻轻吹打，然后离心再加入新鲜PBS，混匀离心）；
4、加1%锇酸500ul或适量,摇动充分混匀，固定1-2h；
5、5000rpm离心3min,去上清，加入PBS 500ul漂洗样品三次，每次15min；
6、用梯度浓度（包括20%，50%，80%，100%五种浓度）的乙醇溶液脱水，每种浓度处理10min，5000rpm离心3min；
7、用纯丙酮或100%叔丁醇转换100%乙醇2-3次，即乙醇菌液离心的后，去上清，加200ul纯丙酮4℃放置20-30min,5000rpm离心3min，再加入新鲜纯丙酮。

8、自然风干，密封4℃保存，等待上样。

扫描电镜
1、收集培养好的新鲜菌体，用1×PBS（pH7.0）或0.9% NaCl漂洗样品2-3次，每次15min ，5000rpm离心3min,去上清；
2、加2.5%的戊二醛溶液1ml,轻摇充分混匀，重悬菌液，4℃固定4h或过夜；
3、5000rpm离心3min,去上清，加入500ul PBS漂洗样品三次，每次15min （可用枪轻轻吹打，然后离心再加入新鲜PBS，混匀离心）；
4、加1%锇酸500ul或适量,摇动充分混匀，固定1-2h；
5、5000rpm离心3min,去上清，加入PBS 500ul漂洗样品三次，每次15min；
6、用梯度浓度（包括20%，50%，80%，100%五种浓度）的乙醇溶液脱水，每种浓度处理10min，5000rpm离心3min；
7、用纯丙酮或100%叔丁醇转换100%乙醇2-3次，即乙醇菌液离心的后，去上清，加200ul纯丙酮4℃放置20-30min,5000rpm离心3min，再加入新鲜纯丙酮。

8、自然风干，密封4℃保存，等待上样。

扫描电子显微镜的设计思想和工作原理，早在1935年便已被提出来了。

1942年，英国首先制成一台实验室用的扫描电镜，但由于成像的分辨率很差，照相时间太长，所以实用价值不大。

经过各国科学工作者的努力，尤其是随着电子工业技术水平的不断发展，到1956年开始生产商品扫描电镜。

近数十年来，扫描电镜已广泛地应用在生物学、医学、冶金学等学科的领域中，促进了各有关学科的发展。

一．扫描电镜的特点和光学显微镜及透射电镜相比，扫描电镜具有以下特点：(一) 能够直接观察样品表面的结构，样品的尺寸可大至120mm×80mm×50mm。

(二) 样品制备过程简单，不用切成薄片。

(三) 样品可以在样品室中作三度空间的平移和旋转，因此，可以从各种角度对样品进行观察。

(四) 景深大，图象富有立体感。

扫描电镜的景深较光学显微镜大几百倍，比透射电镜大几十倍。

(五) 图象的放大范围广，分辨率也比较高。

可放大十几倍到几十万倍，它基本上包括了从放大镜、光学显微镜直到透射电镜的放大范围。

分辨率介于光学显微镜与透射电镜之间，可达3nm。

(六) 电子束对样品的损伤与污染程度较小。

(七) 在观察形貌的同时，还可利用从样品发出的其他信号作微区成分分析。

二．扫描电镜的结构和工作原理(一) 结构1．镜筒镜筒包括电子枪、聚光镜、物镜及扫描系统。

其作用是产生很细的电子束(直径约几个nm)，并且使该电子束在样品表面扫描，同时激发出各种信号。

2．电子信号的收集与处理系统在样品室中，扫描电子束与样品发生相互作用后产生多种信号，其中包括二次电子、背散射电子、X射线、吸收电子、俄歇(Auger)电子等。

在上述信号中，最主要的是二次电子，它是被入射电子所激发出来的样品原子中的外层电子，产生于样品表面以下几nm至几十nm的区域，其产生率主要取决于样品的形貌和成分。

通常所说的扫描电镜像指的就是二次电子像，它是研究样品表面形貌的最有用的电子信号。

检测二次电子的检测器(图15(2)的探头是一个闪烁体，当电子打到闪烁体上时，1就在其中产生光，这种光被光导管传送到光电倍增管，光信号即被转变成电流信号，再经前置放大及视频放大，电流信号转变成电压信号，最后被送到显像管的栅极。

扫描电镜基本操作扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）是一种高分辨率的显微镜，可以对样品表面进行扫描，获得高清晰度、高放大倍数的图像。

下面将介绍扫描电镜的基本操作流程。

1.准备工作：a.打开电镜室门，确保电镜室的温度和湿度处于适宜范围内。

b.穿戴好实验室所需的个人防护装备，如手套、护目镜和实验服等。

c.打开电镜主机的电源，等待电镜系统启动完成。

2.样品制备：a.选择适当的样品，并将其切割成小块，大小约为2-5毫米。

b.将样品固定在样品架上，并使用导电胶固定好。

c.将样品架放入样品台的样品仓中，并调整好样品的位置。

3.调节参数：a. 调节电子束对准仪（Electron Beam Alignment）：使用电子束对准仪对电子束进行调节，使其准直，并使束斑圆形对称。

b.调节电镜放大倍数：根据样品的大小和需要的分辨率，选择合适的放大倍数。

c. 调节工作距离（Working Distance）：调节样品与电子枪的距离，以获得最清晰的图像。

4.图像获取：a. 打开电子枪（Electron Gun）和电子镜（Objective Lens），调节电子束的亮度和对比度，使图像清晰可见。

b.调节扫描线圈和透镜电流，根据需要调整图像的聚焦和深度。

c.使用电子束扫描样品表面，通过检测电子的散射信号，生成图像。

d.调整扫描速率和扫描模式，以获得更多的图像细节。

5.图像处理：a.将图像转移到计算机上，进行存储和分析。

b.使用图像处理软件对图像进行增强、增加对比度、调整亮度等操作，以改善图像质量。

c.使用测量工具对图像中的尺寸、表面形貌等进行检测和分析。

6.清洁和保养：a.使用真空泵或气体吹枪等清理系统内的灰尘和杂质，以保持显微镜的清洁。

b.对电子枪和电子镜等关键部件进行定期维护和清洁，以保证其正常运行和寿命。

以上是扫描电子显微镜的基本操作流程。

在实际操作中，还需要根据具体的样品和要求进行一些细微的调整和处理。

扫描电镜高真空模式微生物样本的前处理一、取材将菌株接种中液体培养基中，培养至一定时间后，离心收集菌体，弃上清，留沉淀。

二、固定戊二醛固定向沉淀中加2.5 %（v/v）戊二醛（将25%的戊二醛母液用pH值6.8的磷酸缓冲液（PBS，配置方法见文后）稀释十倍）1ml，4℃固定12 h，用pH值6.8磷酸缓冲液洗涤3次，离心收集回收菌体，弃上清。

三、脱水乙醇梯度脱水将沉淀依次在30 %、50 %、70 %、80 %、90 %、95 %、100 %、100 %乙醇中浸泡10 min进行梯度脱水，每个梯度乙醇脱水后离心收集菌体，再进行下一个梯度的脱水处理。

最后再离心收集菌体。

四、媒介剂置换（临界点干燥法此步可省略）乙酸异戊酯置换乙醇乙酸异戊酯置换乙醇两次，每次20 min，每次置换后8000 rpm，离心5 min回收菌体。

五、干燥方法一：空气干燥法（效果不好）将样品从醋酸异戊酯中取出，放置于干燥钵中干燥2~4 h。

方法二：临界点干燥法将样品从乙醇中取出，充入液体二氧化碳，液体二氧化碳置换乙醇，20－60分钟，升温升压达到二氧化碳临界点(31℃, 72.8大气压)，维持4分钟，保持温度和压力并缓慢放出二氧化碳，大约持续30分钟。

方法三：冷冻干燥法将样品从醋酸异戊酯中取出，分别于-20℃、-40℃、-80℃冷冻12 h，于冷冻干燥仪中干燥12 h备用。

六、导电处理离子溅射镀膜法将样本固定到导电胶布上，竖直放置到离子溅射仪的样品台上，按照抽真空1 min，离子溅射30 s对样本进行离子溅射镀膜。

七、电镜观察将样品从离子溅射仪中取出，放入扫描电镜中，高真空模式观察。

扫描电镜检测的步骤及方法一、技术简介扫描电镜是1965年发明的较现代的细胞生物学研究工具，它具有制样简单、放大倍数可调范围宽、图像的分辨率高、景深大等特点。

近年来，扫描电镜已广泛地应用在生物学、医学、等学科的领域中。

主要是通过发射电子聚焦光束来扫描样品的表面形态.电子束与样品表面的样子发生作用，产生多种能够被检测的信号，这些信号就包含了样品的表面形态和组成染色。

二、实验流程1. 样品的初步处理a. 取材样品面积可达8mm×8mm，厚度可达5mm。

对于易卷曲的样品如血管、胃肠道粘膜等，可固定在滤纸或卡片纸上，以充分暴露待观察的组织表面。

b. 样品的清洗(1)用等渗的生理盐水或缓冲液清洗；(2)用5%的苏打水清洗；(3)用超声震荡或酶消化的方法进行处理。

c. 固定：固定所用的试剂和透射电镜样品制备相同，常用戊二醛及锇酸双固定。

由于样品体积较大，固定时间应适当延长。

也可用快速冷冻固定。

d. 脱水：样品经漂洗后用逐级增高浓度的酒精或丙酮脱水，然后进入中间液，一般用醋酸异戊酯作中间液。

2. 样品的干燥a. 空气干燥法空气干燥法又称自然干燥法，就是将经过脱水的样品，让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥。

这种方法的最大优点是简便易行和节省时间；它的主要缺点是在干燥过程中，组织会由于脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。

因此，该方法一般只适用于表面较为坚硬的样品。

b. 冷冻干燥法(1)置于冷冻保护剂中：将样品置于冷冻保护剂中浸泡数小时。

常用的冷冻保护剂为10%～20%二甲基亚砜水溶液，或15%-40%甘油水溶液。

(2)骤冷：将经过保护剂处理的样品迅速投入用液氮预冷至(150℃的氟利昂冷冻剂中，使样品中的水分很快冻结。

(3)干燥：将已冻结的样品移到冷冻干燥器内已预冷的样品台上，抽真空，经几小时或数天后，样品即达到干燥。

本方法不需要脱水，避免了有机溶剂对样品成分的抽提作用，不会使样品收缩，也是较早使用的方法。

扫描电镜样品制备流程
1.样品准备与固定（实验室完成）
a)固体培养样品：在固体琼脂平板上培养至合适阶段，用刀片切5mm*5mm大小样
品2至4块，置于预冷的2.5%戊二醛-PBS溶液中，4℃固定2小时以上或过夜；
b)液体培养样品：在液体培养基中摇培至合适阶段，离心去上清，加入预冷的2.5%
戊二醛-PBS溶液，轻轻弹起混匀，4℃固定2小时以上或过夜；
2.样品梯度脱水（实验室或平台）
a)准备50%，70%，85%，95%，100%乙醇溶液；
b)梯度脱水操作：
i.固体样品可以直接置于2ml EP管中操作，液体样品离心后去上清，将样品取
出置于滤纸中包好；
ii.分别用50%，70%，85%，95%乙醇脱水15分钟；
iii.用100%乙醇脱水3次；
3.样品超临界流体干燥（平台）
4.样品喷金（平台）
5.扫描电镜观察（平台）。