重组大肠杆菌生产类人胶原蛋白_的发酵pH优化

第35卷第4期2011年8月南京理工大学学报Journal of Nanjing University of Science and TechnologyVol．35No．4Aug．2011收稿日期：2010－09－20修回日期：2011－06－10基金项目：国家“863”计划资助项目（2008AA12A218）；教育部博士点基金（20093219110013）作者简介：刘斌（1971－），男，博士生，主要研究方向：基因工程技术的应用，E-mail ：goldendays2002@126．com ；通讯作者：杨树林（1953－），男，教授，博士生导师，主要研究方向：微生物代谢调控与基因工程，E-mail ：yshulin@mail．njust．edu．cn 。

基因重组酵母工程菌优化表达人源胶原蛋白刘斌，郭红丽，钮小松，张小霞，杨树林（南京理工大学环境与生物工程学院，江苏南京210094）摘要：通过响应曲面法（RSM ）优化巴氏毕赤酵母基因工程菌GS115/pPIC9KG6表达高亲水性重组人源胶原蛋白的摇瓶培养条件。

采用Box－Behnken 设计（BBD ）考察初始诱导pH 值、温度和甲醇添加量三个主要影响因子对重组人源胶原蛋白表达量的影响，利用DX7Trial 软件设计实验方案，根据该方案设置不同培养条件进行实验并测定相关参数。

响应面分析确定的最优因素水平组合为：初始诱导pH 值为5．0，诱导温度为28ħ，甲醇添加量为2．2%/24h 。

通过响应面法优化发酵的内在因素水平，找出最佳条件，为利用其指导在发酵罐中进行高密度发酵生产人源胶原蛋白奠定基础。

关键词：巴氏毕赤酵母；重组人源胶原蛋白；响应曲面法；Box-Behnken 设计中图分类号：Q815文章编号：1005－9830（2011）04－0558－05Optimization of Fermentation Conditions of Genetically Engineered Pichia pastoris Expressing Recombinant Human-source CollagenLIU Bin ，GUO Hong-li ，NIU Xiao-song ，ZHANG Xiao-xia ，YANG Shu-lin（School of Environmental and Biological Engineering ，NUST ，Nanjing 210094，China ）Abstract ：Response surface methodology （RSM ）is used to optimize the fermentation conditions of ge-netically engineered Pichia pastoris （GS115/pPIC9KG6）expressing highly hydrophilic recombinant human-source collagen．Box-Behnken design （BBD ）is introduced to estimate the impact of initial in-ducement pH ，temperature and addition amount of methanol．An experiment is done by setting differ-ent culture conditions according to the scheme designed through the DX7Trial software ，and the cor-relational parameters are determined．The RSM analysis result shows that the optimal scale of factors is ：initial inducement pH 5．0，temperature 28ħ，addition amount of methanol 2．2%/24h．The ex-periment offers precise conditions for high density fermentation performed in fermenter．Key words ：Pichia pastoris ；recombinant human-source collagen ；response surface methodology ；Box-Behnken design总第179期刘斌郭红丽钮小松张小霞杨树林基因重组酵母工程菌优化表达人源胶原蛋白胶原蛋白具有独特的组织结构和生物学特性，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用，同时胶原蛋白具有低免疫原性、可生物降解、良好的生物相容性和机械性能等特点，作为生物医用材料广泛应用于医药、组织工程和化妆品等领域［1，2］。

重组Ecoli生产类人胶原蛋白发酵调控策略与500L中试规模放大方法优化西北大学博士学位论文重组E.coli生产类人胶原蛋白发酵调控策略与500L中试规模放大方法优化姓名：薛文娇申请学位级别：博士专业：生物化工指导教师：范代娣20090610西北大学博士学位论文中文摘要本研究旨在建立一套完整的重组Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ生产类人胶原蛋白（ｈｕｍａｎ．１ｉｋｅｃｏｌｌａｇｅｎ．ＨＬＣ）的中试规模生产工艺，并通过对各单元操作从实验室规模到中试规模的放大研究，为进一步将该工艺放大到工业生产奠定基础。

重组Ｅｃｏｌｉ的高密度培养是ＨＬＣ生产过程的核心单元，其放大的成功与否直接关系到整个工艺过程。

为了明确影响发酵过程的关键因素，从而选择合适的放大准则和方法，本文对发酵过程中二氧化碳和乙酸的影响进行了系统研究。

尽管有大量文献表明，二氧化碳对重组Ｅｃｏｌｉ发酵有负面影响，然而关于二氧化碳对重组Ｅｃｏｌｉ，特别是重组蛋白表达方面的定量研究却未见报道。

本研究采用二氧化碳脉冲法首次考察了重组Ｅｃｏｌｉ生长不同阶段二氧化碳浓度对重组蛋白生产的影响。

研究结果表明，当在分批培养阶段施加浓度为２０％（ｖ／ｖ）二氧化碳脉冲时，细胞生长明显受到抑制；而在补料阶段引入该脉冲时，却引起了比生长速率的小幅上升；二氧化碳对ＨＬＣ表达的抑制只发生在ＨＬＣ的表达阶段，即在蛋白表达诱导阶段引入浓度为２０％（ｖ／ｖ）二氧化碳脉冲３小时，则最终ＨＬＣ浓度下降３３．９％。

尽管二氧化碳脉冲的浓度越高，作用时间越长，其相应的抑制或促进作用也越明显，但当二氧化碳脉冲浓度小于等于１０％时，对发酵过程却几乎没有影响。

然后，针对重组Ｅｃｏｌｉ发酵过程的关键问题一乙酸抑制作了系统研究。

研究结果表明，在分批培养阶段乙酸对Ｅｃｏｌｉ细胞有明显的抑制作用，但在补料培养阶段，其影响却并不明显；而乙酸对ＨＬＣ表达的抑制只发生在ＨＬＣ的表达阶段。

本文首次建立了这一评价重组Ｅｃｏｌｉ细胞生长不同阶段乙酸影响的方法。

发酵工程工艺原理实验报告小型发酵罐的使用及发酵过程中主要生化指标测定学校：华南农业大学学院：食品学院班级： XX级食品科学与工程X班小型发酵罐的使用及发酵过程中主要生化指标测定摘要 为研究小型发酵罐分批培养过程中大肠杆菌的菌体生长状况，本实验以分批培养法培养大肠杆菌，通过控制发酵过程的温度、溶氧、搅拌速度、空气流量、泡沫水平等参数，并每小时取样测DO 值和还原糖量，制作菌体生长曲线，以此判断大肠杆菌的生长发酵状况。

本实验选用生长迅速的大肠杆菌进行发酵罐的培养，同时定时地取样测定，包括对菌体进行镜检、测定不同时期发酵液的细菌浊度以及残留还原糖的变化。

关键词 大肠杆菌 发酵前言 发酵过程中，微生物的生长呈一定规律，掌握微生物生长曲线，可以防止菌种老化衰退、防止有害产物积累、提高发酵的效率，对生产有指导意义。

通过测定生化指标，可大体了解菌体生长曲线，并在此基础上采取适当措施促进微生物生长。

生长曲线中，微生物产生代谢产物或抗生素多在对数期末期或稳定期，因此可采取方法延长次期，如通过发酵罐等方法，不断调节培养基的pH 值，去除有害物质，增加适量的气体和营养物质，使微生物延迟进入或不进入衰退期，从而生产出大量的有用的代谢产物[1]。

发酵罐是生化、食品、医药、农药、化工等生产领域的常用设备，虽然发酵罐的类型很多,如自吸式、气升式等。

但发酵工厂用得最多的还是传统的通用发酵罐(机械搅拌发酵罐)[2]。

发酵罐配备控制系统，它主要是对发酵过程中的各种参数如温度、pH 、溶解氧、搅拌速度、空气流量、补料、泡沫水平等进行设定、显示、记录以及对这些参数进行反馈调节控制。

1材料与方法1.1实验流程：菌种斜面一级种子（250mL 摇瓶培养24h 二级种子培养10h 培养12h37℃37℃)(500mL 摇瓶）37℃发酵罐 管路准备 实罐灭菌37℃放罐发酵 8～10h 培养基取样分析测定1.2菌种准备1.2.1配制培养基1)配制种子固体培养基100mL，分装试管，0.1MPa灭菌20min，然后摆成斜面。

重组胶原蛋白多肽在大肠杆菌中的表达优化作者：吴铭，郭立泉，陈光来源：《湖北农业科学》 2014年第10期吴铭１，２，郭立泉１，陈光３（１．吉林工商学院粮油食品深加工吉林省重点实验室，长春１３００６２；２．东北师范大学生命科学学院，长春１３００２４；３．吉林农业大学生命科学学院，长春１３００００）摘要：以Ⅵ型人胶原蛋白Ａ２链基因为模板，ＰＣＲ扩增得到目的基因ＣＰ６，构建了重组胶原蛋白表达载体，然后筛选高效表达的宿主菌，检测重组质粒的不稳定性以及对重组菌培养条件进行优化。

结果表明，重组胶原蛋白在Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）中表达量相对最高，重组质粒稳定性也较高。

较佳的表达条件为接种量４％或５％，３７℃、２００ｒ／ｍｉｎ培养至ＯＤ６００ｎｍ为０．７时，加入０．５ｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ，培养５ｈ，并且纯化的重组蛋白与小鼠抗人ＣＯＬ６Ａ２的单克隆抗体有特异性反应。

关键词：胶原蛋白多肽；大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）；表达；优化中图分类号：Ｑ８１２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）10－2443-05胶原蛋白多肽是运用链酶法水解对胶原蛋白进行提取，将其水解成可溶解性的水解胶原蛋白。

胶原蛋白多肽的功能与胶原蛋白有很多不同，并涉及到生物体内多种细胞功能的活性物质［１］。

目前，研究者已经发现了很多生物体的多肽，而且几乎所有生物过程都受到多肽的调节，如神经传导、细胞增殖和生长等。

因此，在胶原蛋白的研究中，胶原蛋白多肽的研究已经成为一个重要领域。

在胶原蛋白的众多类型中，Ⅵ型胶原蛋白（ＣⅥ）几乎分布在所有结缔组织中，而且它还具有维持组织完整性，能促进增殖和抗凋亡、促进细胞迁移、刺激ＤＮＡ合成，具有生长因子的特性［２，３］。

目前，研究证明Ⅵ型胶原蛋白亚单位的基因突变是导致Ｂｅｔｈｌｅｍ肌病的主要原因，而且Ⅵ型胶原蛋白大量沉积能导致肝纤维化，Ⅵ型胶原蛋白还在细胞增殖和肿瘤转化方面具有一定作用。

本研究构建了含有人的Ⅵ型人胶原蛋白多肽基因的原核表达载体，并将其转化到大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）中进行表达研究，为后续研究奠定了基础。

响应面法优化表达丙酮酸氧化酶重组大肠杆菌培养基姚兵莉;卢俊文;张建国【摘要】本研究利用响应面法优化重组大肠杆菌的培养基提高了其表达丙酮酸氧化酶的产量.首先,单因素优化实验表明pH、甘油浓度、酵母粉浓度、胰蛋白胨浓度分别为pH 7、0.3％、1.2％、0.6％时有利于重组大肠杆菌表达丙酮酸氧化酶.进而,利用Box-Behnken法对甘油、酵母粉、胰蛋白胨设计三因素三水平实验,通过响应面回归分析,得到模型预测的最优培养基条件.在0.6％甘油、3.18％酵母粉和0.44％胰蛋白胨的培养基条件下重组大肠杆菌产丙酮酸氧化酶有最高活力.验证试验结果丙酮酸氧化酶活力达到(17 194.9 ±504.9) U/L,与模型的预测值相近,比未优化前提高了1.7倍.本研究结果为丙酮酸氧化酶的大规模生产和工业化应用提供了基础.【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2018(048)006【总页数】7页(P25-31)【关键词】丙酮酸氧化酶;大肠杆菌发酵;培养基优化;响应面【作者】姚兵莉;卢俊文;张建国【作者单位】上海理工大学食品科学与工程研究所,上海200093;上海理工大学食品科学与工程研究所,上海200093;上海理工大学食品科学与工程研究所,上海200093【正文语种】中文丙酮酸氧化酶是一种十分重要的试剂用酶[1]，能够用于人体内血清中天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶指标的测定[2]。

但是野生型产生丙酮酸氧化酶的菌株主要来自于绿色气球菌和植物乳杆菌，其丙酮酸氧化酶的产量只有120 U/L[3]。

基因工程构建重组微生物能显著提高外源酶产量[4]。

大肠杆菌是最早用于表达外源酶的系统，具有遗传背景清晰、发酵周期短、营养需求简单等优点[5,6]。

ZHAO 等利用基因工程技术在大肠杆菌中表达丙酮酸氧化酶，活力高达1 748.3 U/L[7]，是天然发酵的14.6倍。

为了获得高密度菌体和高表达的外源酶量，培养基优化是提高发酵产量的重要步骤[8]。

重组胶原蛋白技术研究
胶原蛋白是一种重要的结构蛋白，广泛存在于人体的结缔组织中，包括皮肤、骨骼、血管和软骨等部位。

由于其独特的生物相容
性和生物降解性，胶原蛋白在医学领域中具有广泛的应用前景，包
括组织工程、药物传递系统和伤口愈合等方面。

然而，传统的胶原蛋白提取方式受到限制，因为它们可能含有
致敏原和病原体。

为了克服这些问题，科学家们开发了重组胶原蛋
白技术，这一技术利用基因工程方法将胶原蛋白基因导入到细胞中，通过细胞的表达和分泌来获得高纯度和高质量的胶原蛋白。

重组胶原蛋白技术的研究涉及到多个方面。

首先，科学家们需
要选择合适的宿主细胞，如大肠杆菌、酵母菌或哺乳动物细胞，来
表达胶原蛋白基因。

其次，他们需要设计有效的表达载体，以确保
胶原蛋白基因能够在宿主细胞中得到高效表达。

此外，还需要优化
发酵条件和纯化工艺，以获得高纯度和高产量的重组胶原蛋白。

重组胶原蛋白技术的研究不仅可以为医学领域提供高质量的胶
原蛋白材料，还可以为相关产业的发展提供新的技术支持。

例如，
重组胶原蛋白可以用于制备生物材料，用于组织工程和再生医学研
究。

此外，它还可以用于开发新型的药物传递系统，提高药物的稳定性和生物利用度。

总之，重组胶原蛋白技术的研究具有重要的科学意义和应用前景。

随着技术的不断进步和完善，相信重组胶原蛋白将会在医学和生物工程领域发挥越来越重要的作用。

重组人胶原蛋白肽在大肠杆菌中的高效表达陈光;吴铭;王刚;孙旸【摘要】目的:构建含有胶原蛋白基因的原核表达载体pET32a-CP6,并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行高效表达,为获得大量可溶的胶原蛋白肽提供可靠依据.方法:将重组表达载体pET32a-CP6转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG为诱导剂,对温度、接种量、诱导时机、IPTG诱导浓度等各种发酵参数进行优化,筛选高效表达的发酵条件,并通过Ni-NTA亲和层析进行纯化分析.结果:菌株在37℃、接种量为2%、摇瓶培养约2.5h后,加入终浓度为0.5mmol· L-1的IPTG,37℃诱导5h,收获的蛋白产量最高为31.52 mg· L-1,Western blotting分析该表达产物与人COL6A2单克隆抗体有特异结合能力.结论:优化工程菌高效表达重组人胶原蛋白,纯化重组蛋白.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(037)004【总页数】5页(P656-660)【关键词】重组胶原蛋白肽;重组蛋白纯化;大肠杆菌【作者】陈光;吴铭;王刚;孙旸【作者单位】吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118【正文语种】中文【中图分类】Q78胶原蛋白是由动物的成纤维细胞合成的一种生物高分子，广泛存在于动物骨、韧带、软骨、皮肤及其他结缔组织中，是细胞外基质的主要成分[1]。

由于其特有的生理活性和丰富的营养价值，被广泛地应用于医学、美容、化妆品、食品等领域。

目前胶原蛋白的制备大多采用常规方法，通常以含有结缔组织的屠宰陆生动物废弃物为原料，对其进行酸、碱和酶处理来提取胶原蛋白，但该方法提取的蛋白具有非水溶性、病毒传染性、异体免疫排斥性等缺点，限制了胶原蛋白许多潜在用途的开发[2]。

丙酮酸论文：通过增大丙酮酸节点的代谢流量来提高类人胶原蛋白Ⅱ的产量【中文摘要】本文主要研究通过在基因重组Escherichia coli BL 21发酵生产类人胶原蛋白Ⅱ的表达蛋白阶段添加丙酮酸来提高类人胶原蛋白Ⅱ的产量。

并运用响应面优化法对丙酮酸添加过程中影响类人胶原蛋白Ⅱ的产量的因素(丙酮酸的添加量、丙酮酸的添加时间和磷酸缓冲液浓度)进行了摇瓶实验优化。

最终,在磷酸缓冲液浓度是0.17mol/L的发酵培养基中,在诱导时添加8.23mmol/L的丙酮酸得到类人胶原蛋白Ⅱ的产量为0.29g/L,相对于对照实验组增长了11.54%,细胞的OD60¨0也比对照组提高了28.72%。

在摇瓶实验数据的基础上,用发酵罐实验对丙酮酸的添加量、丙酮酸的添加时间这两因素对类人胶原蛋白Ⅱ的产量的影响作了研究。

结果显示：能显著提高类人胶原蛋白Ⅱ的产量的丙酮酸的添加量为15.84mmol/L,丙酮酸的添加时间为诱导后1小时。

在此条件下,细胞干重和蛋白产量分别达到69.6g/L和11.87g/L。

【英文摘要】Recombinant Escherichia coli BL21 is used to produce human-like collagen.To improve human-like collagen production, pyruvate was added to the zymotic fluid at the phase of expression of human-like collagen. And response surface methodology (RSM) was adopted to optimize the adding time and dosage of pyruvate and the concentration of phosphate buffer.Finally, the adding time of pyruvate was at the point of induction, the optimal dosage of pyruvate and the concentration of buffer were 8.23 mmol·L-1 and 0.17 m...【关键词】丙酮酸类人胶原蛋白重组大肠杆菌响应面优化法发酵【英文关键词】Pyruvate Human-like collagen Recombinant Escherichia coli Response surface methodology Fermentation 【索购论文全文】138113721 139938848 即付即发【目录】通过增大丙酮酸节点的代谢流量来提高类人胶原蛋白Ⅱ的产量摘要3-4Abstract4第一章绪论8-20 1.1 类人胶原蛋白Ⅱ8-9 1.2 增加外源蛋白的表达9-15 1.2.1 发酵工艺条件优化9-11 1.2.2 减少抑制外源蛋白表达的抑制物11-15 1.3 类人胶原蛋白Ⅱ的氨基酸含量及其表达15-17 1.3.1 大肠杆菌和类人胶原蛋白Ⅱ的氨基酸含量15-16 1.3.2 蛋白质负担16-17 1.4 应用Design-Expert7.0软件进行响应面优化17-18 1.4.1 响应面优化法17-18 1.4.2 用Design-Expert7.0软件响应面优化法简介18 1.5 本研究的目的、意义及内容18-20第二章实验材料及方法20-31 2.1 菌种20 2.2 仪器和试剂20-22 2.3 试验方法22-24 2.3.1 菌种活化22 2.3.2 种子培养22 2.3.3 摇瓶实验22-23 2.3.4发酵罐分批-补料培养23 2.3.5 菌体收集23-24 2.3.6 目标蛋白的分离24 2.4 分析方法24-31 2.4.1 菌体浓度(OD)测定方法24 2.4.2 菌体干重测定24 2.4.3 残糖测定24-25 2.4.4 乙酸含量的测定25 2.4.5 有机酸检测(HPLC法)25-26 2.4.6 类人胶原蛋白Ⅱ含量测定26-31第三章添加丙酮酸的摇瓶优化31-52 3.1 引言31 3.2 单因素实验31-32 3.2.1 丙酮酸添加量对类人胶原蛋白产量的影响31-32 3.2.2 丙酮酸添加时间对类人胶原蛋白产量的影响32 3.2.3 磷酸缓冲盐(K_2HPO_4-NaH_2PO_4)浓度对类人胶原蛋白产量的影响32 3.3响应曲面优化法32-33 3.3.1 Planckett-Burman实验32-33 3.3.2 最陡爬坡实验33 3.3.3 中心复合实验33 3.3.4 验证实验33 3.4 实验结果与分析33-51 3.4.1 单因素实验33-36 3.4.2 Planckett-Burman实验结果与分析36-38 3.4.3 最陡爬坡实验结果与分析38 3.4.4 中心复合实验结果与分析38-41 3.4.5 丙酮酸的添加对生物量的影响41-47 3.4.6 丙酮酸的添加对乙酸的影响47-50 3.4.7 验证实验50-51 3.5 本章小结51-52第四章发酵罐培养52-60 4.1 发酵实验设计52-55 4.1.1 发酵参数及发酵方式的选择52-55 4.1.2 添加丙酮酸的实验设计55 4.2 实验结果与分析55-59 4.2.1 丙酮酸的添加量55-58 4.2.2 丙酮酸的添加时间58-59 4.3 本章小结59-60参考文献60-66攻读硕士学位期间取得的学术成果66-67致谢67。

重组大肠杆菌生产核苷磷酸转移酶的发酵条件优化沈爱萍。

何宝龙。

孙丽慧。

郑裕国(浙江工业大学生物工程研究所，浙江杭州310014)摘要：核苷磷酸转移酶能够特异地将无机焦磷酸(PPi)的磷酸根转移到核苷5’一位的羟基上，该过程并不需要A T P的参与，且具有选择性高和反应条件温和等特点。

以实验室前期构建的重组大肠杆菌E．∞f f B L21(D E3)／pE T28b—A P／P T为茵株，进行了5L发酵罐中的培养条件优化，确定了以乳糖作为诱导剂时，最佳诱导时机oD鲫为7左右，诱导剂乳糖的浓度为10g／L；确定了最适通气量为1．5L／m i n。

在该条件下，核苷磷酸转移酶酶活达221．4U／L，O D600为20．4。

关键词：重组大肠杆茵；核苷磷酸转移酶；发酵；条件优化O pt i m i zat i on of f e r m e nt a t i on condi t i ons f or t he pr oduct i on ofphosphot r ansf e r as e by E sc her i chi a col iS H E N A i—pi ng，H E B ao—l ong，SU N L i—hui，Z H EN G Y u—guo(I nst i t ut e of B i oengi neer i ng，Zhej i ang U ni vers i t y of t e chnol ogy，H angzhou310014，C hi na)A bst r ac t：P hos phot r ans f e r as e，poss ess ed hi gh r egi o s peci f i ci t y of t he nucl eosi de phosphor yl at i ng act i vi t y t o t he C-57posi t on，i s of hi gh pot ent i al f or t he pr oduct i on of i nos i ne-5'-m onophosphat e due t o m i l d r eact i on condi t i ons．I n t hi s pa pe r，r ecom bi nant E c ol iB L21(D E3)／pE T28b-A P／PT w hi ch has e xpr e ss ed ac i d phos phat a se s w as use d，and t he ef fect s of cul t ur e condi t i ons o n ce l l gr ow t h and enzy m e act i vi t y w e r e i nves t i gat ed i n5L f e r m e nt er．T he opt i m al condi t i ons of cul t ur e w e r e as f ol l o w i ng：i ndu ct i on t i m e w as at O D c劬o=7，t he l act os e concent r a t i on w as of10g／L，vent i l at i on vol um e w as of1．5L／m i n．U nder t he cul t ur e condi t i ons，t he enzym e act i vi t y and O D600c oul d r ea ch221．4U几and20．4．r es pect i vel y．K ey w or ds：r ec om bi na nt E．col i；phosphot r ansf er ase；f er m ent at i on；opt i m i zi ng condi t i ons以57一肌苷酸(5'-I M P)为代表的呈味核苷酸，是新一代食品增鲜剂，常与5’一鸟苷酸(5’一G M P)按1：1混合而成。

重组人胶原蛋白肽的表达及纯化工艺的优化摘要:将重组大肠杆菌pC6-BL21活化后,用IPTG诱导表达,探讨了大肠杆菌中重组胶原蛋白肽的最佳表达及纯化条件｡结果表明,菌株在37 ℃,接种量为2%,摇瓶培养3.0 h后,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,30 ℃诱导5.0 h,收获的蛋白产量最高,经Ni-NTA柱亲和层析纯化,用梯度咪唑缓冲液洗脱蛋白,150 mmol/L咪唑缓冲液洗脱蛋白为纯蛋白,Western blotting分析显示该表达产物与人COL6A2单克隆抗体有特异结合能力｡关键词:重组人胶原蛋白肽;纯化;表达Optimization of Expression and Purification Procedure of Recombinant Human Collagen PeptideAbstract: To optimize the fermentation and purification conditions of recombinant human collagen peptide(CP6) in E. coli pC6-BL21, the temperature, opportunity and time for induction as well as inducer concentration for CP6 expression in recombinant E. coli was optimized. The optimal induction and expression conditions were as follows, after inoculating at an amount of 2%, the bacteria were fermented for 3.0 h at 37 ℃; then 0.5 mmol/L IPTG was added as inducer; and the peptide was expressed under 30 ℃for 5.0 h. After fermented under the optimal conditions, the lysate of bacteria was purified by nickel ion affinity; and purity of target protein was determined by SDS-PAGE. Results showed that pure protein could be obtained if eluted by 150 mmol/L imidazole buffer after being purified, and western blotting showed that the expressed protein could specifically bind with human monoclonal antibody COL6A2.Key words: recombinant human collagen peptide; expression; purification胶原蛋白是一类广泛分布于动物结缔组织的蛋白质[1],对维护机体的正常生理功能和损伤修复有重要作用｡目前胶原蛋白的生产主要是用酸､碱水解法从动物结缔组织提取,提取过程中会或多或少地丧失胶原蛋白的生物活性,应用于人体时还可能会产生排异反应,且存在着极大的病毒隐患[2,3]｡鉴于胶原蛋白有广阔的应用前景,特别是医用材料､保健品领域迫切需要大量优质的胶原蛋白,寻找新的安全可靠的手段制备胶原蛋白十分重要,利用基因工程手段重组表达人胶原蛋白成为研究热点[4-6]｡本实验以LB培养基为基础,采用单因素实验对重组人胶原蛋白在大肠杆菌中诱导表达的一系列条件,如接种量､诱导时机､诱导物浓度､诱导温度和表达时间等进行了优化[7],并对所得的胶原蛋白进行了纯化和鉴定,为进一步研究发酵工艺提供了实验基础｡1材料与方法1.1材料和试剂实验菌种为重组大肠杆菌pC6-BL21(DE3),由吉林农业大学生物物理实验室构建并保存｡质粒提取试剂盒､胶回收试剂盒､IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)､蛋白胨(OXOID)､酵母提取物(Yeast extract,YE)均购自北京鼎国生物工程有限公司;Ni-NTA His·Bind树脂和Ni-NTA缓冲液试剂盒均购自MERCK公司,其他试剂和药品均为国产分析纯｡1.2表达条件的优化挑取一环-80 ℃､25%甘油保存的工程菌,接种于LB固体培养基中,37 ℃培养24 h,然后挑单菌落于100 mL LB液体培养基中,37 ℃,200 r/min振荡培养过夜,以活化菌种｡活化后按不同接种量､诱导时机､诱导物IPTG浓度､诱导温度和表达时间设置单因素实验,诱导胶原蛋白的表达,单因素实验每个处理设置3个重复｡①接种量:设置1%､2%､3%､4%､5% 5个接种量水平,将活化的菌种接种到含有50 mL LB培养基的250 mL的三角烧瓶中,37 ℃､200 r/min振荡培养4.0 h至OD600为0.7时,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导,37 ℃发酵培养4.0 h;②诱导时机:将过夜活化的种子液按2%的接种量接种于50 mL LB培养基中,37 ℃,200 r/min分别培养1.0､1.5､2.0､2.5､3.0､3.5､4.0 h后加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导,37 ℃发酵培养4.0 h;③IPTG浓度:活化的菌种接种后在37 ℃培养2.5 h后加入IPTG至终浓度分别为0.1､0.3､0.5､0.7､1.0 mmol/L,分别诱导培养5.0 h;④诱导温度:按最佳接种量和最佳诱导物浓度,在不同的诱导温度下(28､30､33､37 ℃)诱导胶原蛋白的表达,确定最佳诱导温度;⑤表达时间:使用①~④所得的实验条件,分别在菌种诱导表达后2.0､3.0､4.0､5.0､6.0､7.0 h取样,以确定最佳表达时间长度｡1.3重组蛋白含量的测定①细胞密度测定:发酵液经稀释1~10倍后,用可见分光光度计在600 nm处测其光吸收值｡②重组蛋白含量的测定:工程菌发酵结束后,取50 mL经诱导的摇瓶培养发酵液,10 000 r/min离心1 min,用0.5 mL pH值为7.4､50 mmol/L的Tris-HCl 缓冲液洗涤沉淀,吸净上清液｡用1~5 μL的蒸馏水重悬菌体,并立即加入等量的2×SDS聚丙烯酰胺凝胶加样缓冲液,混匀后,沸水浴5 min｡吸取裂解后的样品液作聚丙烯酰胺凝胶电泳,考马斯亮蓝染色测定菌体总蛋白后,采用Bandscan软件扫描SDS-PAGE电泳图,分析出每条泳道重组蛋白占菌体总蛋白的百分含量并计算出重组蛋白含量｡1.4表达产物的分离纯化菌体经超声破碎后离心,上清经Ni-NTA柱亲和层析,用10倍体积20 mmol/L Tris-HCl(含0.3 mol/L NaCl,pH 8.0)平衡柱体,然后分别用60､100､120､150 mmol/L 的咪唑缓冲液(pH 8.0)进行梯度洗脱,收集各个洗脱峰,SDS-PAGE分析收集的成分｡1.5重组蛋白的Western blotting鉴定将纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE,转印至醋酸纤维素膜上,然后将膜在含5%的PBS中室温封闭2.0 h,洗膜后加入小鼠抗人COL6A2的单克隆抗体(1∶2 000稀释)在4 ℃放置2.0 h,洗膜后再加入羊抗鼠IgG-HRP(1∶2 000稀释)在4 ℃放置2.0 h,充分漂洗后加入化学发光底物Super Signal检测试剂,暗室X光片暗匣曝光､显影｡2结果与分析2.1接种量的优化从图1可以看出,菌体的生物量随着接种量的增加而提高,而重组蛋白产量在接种量为2%时最高,继续增大接种量,其产量反而下降｡这可能是由于接种量增加导致菌体生长过快过稠,造成营养基质缺乏或溶解氧不足而不利于发酵产蛋白[8]｡考虑到在大规模发酵过程中,接种量过小会导致菌体增殖缓慢,而接种量过大对菌体生长和酶转化得率会产生一定抑制作用,确定2%为最佳接种量｡2.2IPTG诱导时机的优化诱导时机对目的蛋白表达效果的影响比较大(图2),培养3.0 h后,即对数生长中后期再添加诱导剂,蛋白的表达量最高｡过早添加诱导剂会抑制菌体的增殖,导致生物量减少,在培养时间内获得的表达量也就低;过晚添加诱导剂,菌体已处于生长稳定期,培养基内营养成分减少,细胞代谢速度减缓,合成蛋白的能力降低,表达量也会减少｡因此选择在对数生长中后期即培养3.0 h后加入诱导剂｡2.3IPTG诱导浓度的优化如图3所示,不同浓度的IPTG对外源蛋白的表达有一定的影响｡低浓度条件下,随着IPTG的浓度增加,外源蛋白的表达量也增加,在IPTG浓度为0.5 mmol/L时达到最大值,此后随着IPTG浓度的增加表达量反而下降｡由于高浓度的IPTG会对菌体生长造成毒害作用,同时为了节约成本,选择0.5 mmol/L为最适诱导浓度｡2.4诱导温度的优化过低或过高的温度都会使菌体代谢缓慢,不利于外源基因的表达[9]｡实验结果(图4)表明,随着温度升高,收获的菌体生物量先升后降,在30 ℃时菌体生物量最高｡而重组蛋白的表达随着温度的升高而加强,在37 ℃时最高,因此选择37 ℃为最佳诱导温度｡2.5表达时间的优化如图5所示,诱导5.0 h时蛋白表达量和生物量均达到最大值｡继续诱导,生物量和表达量均下降｡收集时间过早,蛋白的表达还不充分,收集时间过迟则可能导致细胞老化,自溶,发酵液中杂蛋白多,不利于纯化,综合考虑确定最佳诱导时间为5.0 h｡2.6目的蛋白的分离纯化大量诱导表达融合蛋白,经超声破碎､离心后,收集上清液,经Ni-NTA柱亲和层析提纯重组蛋白,用梯度咪唑缓冲液洗脱蛋白,150 mmol/L咪唑缓冲液洗脱蛋白为纯蛋白｡SDS-PAGE检测见图6,重组蛋白相对分子质量约为46 ku,与预期相符｡2.7重组蛋白的Western blotting鉴定Western blotting(图7)分析显示,1号泳道空白对照无特异性反应条带,而2号泳道中纯化产物与小鼠抗人COL6A2的单克隆抗体有特异性反应｡3结论本实验研究了不同的培养条件对重组蛋白表达的影响,结果表明接种量对重组蛋白表达影响较大,当接种量过大时,会直接影响菌体生长状态,从而抑制重组蛋白的表达;ITPG有毒性,培养基中IPTG浓度过低会使诱导力度不够,蛋白表达少,过高则可能会影响菌体生长;诱导时机和诱导后的培养时间都对目的蛋白的产量有重要的影响｡确定了重组蛋白表达的最佳培养条件:接种量为2%,培养3.0 h后添加终浓度为0.5 mmol/L的ITPG,37 ℃下诱导表达5.0 h,表达的重组蛋白含量最高｡本研究使用重组质粒pET22b-CP6转化的大肠杆菌pC6-BL21(DE3),经IPTG 诱导表达,得到可溶性重组蛋白,经Ni-NTA柱亲和层析纯化获得重组蛋白,方法简单易行｡本实验的结果为进一步在发酵罐内进行分批发酵和补料发酵提供了参考｡参考文献:[1] 蒋挺大,张春萍. 胶原蛋白[M]. 北京:化学工业出版社,2001.[2] TOMITA M, MUNETSUNA H, SATO T, et al. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons[J]. Nat Biotechnol,2002,21(1):52-56.[3] RUGGIERO F, EXPOSITO J Y, BOURNAT P, et al. Triple helix assembly and processing of human collagen produced in transgenic tobacco plants[J]. FEBs Letters,2000,469(1): 132-136.[4] 杨立霞,修建新,朱欣杰,等. 重组生产胶原蛋白的研究进展[J]. 河北化工,2007,30(007):43-46.[5] LUO Y E,FAN D D,MA X X,et al. Process control for production of human-like collagen in fed-batch Escherichia coli BL21[J]. Chin J Chem Eng,2005,13(2):276-279.[6] 范代娣. 一种类人胶原蛋白及其生产方法[P]. 中国专利:ZL01 1067578,2005-04-13.[7] 沈宝明,谭新球,谭周进,等. 影响工程菌株目的基因表达的因素[J]. 生物技术通报,2010(3):6-12.[8] 戎晶晶,刁振宇,周国华. 大肠杆菌表达系统的研究进展[J].药物生物技术,2005,12(6):416-420.[9] MICHAEL J W, MARIA P, SHAWNR R C, et al. Stabilization of apoglobin by low temperature increases yield of soluble recombinant hemoglobin in Escherichia coli[J]. Applied and Environment Microbiology, 1997,63(11):4313-4320.。