利用INTERNET设计PCR引物举例

PCR技术的原理举例说明其应用1. PCR技术的简介PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，可在短时间内扩增特定DNA片段。

PCR技术的原理基于DNA的复制过程，通过不断的循环反应，在短时间内制备大量DNA的复制产物。

2. PCR技术的基本原理PCR技术主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。

2.1 变性变性步骤是将待扩增的DNA样本进行高温处理，使DNA双链解离成单链。

这一步骤通常需要在96℃左右进行，使DNA的氢键断裂，使DNA变为单链状态。

2.2 退火退火步骤是将温度调低至50-65℃，引入引物（即扩增反应的两端），使其与待扩增的DNA序列互相结合。

引物是一段能够特异性结合到待扩增片段的单链DNA序列。

2.3 延伸延伸步骤是将温度升至72℃，在此温度下添加DNA聚合酶，开始合成新的DNA链。

DNA聚合酶能识别引物和DNA模板，并在引物的基础上合成互补的DNA链。

PCR反应通常会重复进行数十次，每一轮循环都会使DNA模板的数量翻倍，从而扩增目标DNA片段。

3. PCR技术的应用举例PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括基因组学研究、疾病诊断和法医学等。

以下是PCR技术应用的一些示例。

3.1 基因组学研究PCR技术在基因组学研究中起着重要的作用。

科学家可以利用PCR技术扩增和纯化目标基因或基因组区域。

这使得研究者能够更好地了解基因的结构和功能，并探索基因与疾病之间的关系。

3.2 疾病诊断PCR技术在疾病诊断中被广泛应用。

例如，PCR可以用于检测病原体的存在，如细菌、病毒和寄生虫等。

通过扩增和检测特定的DNA序列，可以确定是否存在特定的病原体，并且判断感染的程度。

3.3 法医学PCR技术在法医学中也被广泛应用。

通过使用PCR技术，可以从犯罪现场的DNA样本中扩增和分析特定的DNA序列。

这些序列可以用于确定嫌疑人的身份，提供法律依据。

3.4 环境监测PCR技术还可以用于环境监测。

例如，科学家可以利用PCR技术检测水源、土壤和空气中的微生物。

实验五 PCR引物设计及评价【实验目的】1、掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primer premier5.0软件进行引物搜索。

2、掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。

【实验原理】一、引物设计原则聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，故又称基因的体外扩增法。

PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多，最广泛的手段之一，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环，使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。

现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行，可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。

引物设计原则如下：1、引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。

引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。

这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性；2、引物的长度一般为15-30 bp。

常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；3、引物不应形成二级结构。

引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行；4、引物序列的GC含量一般为40-60%。

过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大；5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。

Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)；6、引物5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。

7、引物3’端不可修饰。

引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。

进修生日志：primer BLAST在线设计引物扩增未知菌种兰会华1整理屈平华2审校1广西壮族自治区人民医院检验科，2广东省中医院检验科PCR的第一步就是引物设计。

引物设计的好坏，直接影响PCR的结果。

引物设计的软件很多，但是，多数时候是引物设计出来了，PCR也能扩增到目的条带，但非特异性的条带好几条，甚至比目的条带还要亮的，郁闷的有木有？再有，分离到一个新菌种，要扩增管家基因或蛋白基因，可引用参考文献的引物，却怎么也扩增不出来，泪奔的有木有？小编在这里给大家介绍利用细菌的全基因组序列，以primer BLAST在线设计引物和PCR扩增新菌种的方法，让您找到高大上的感觉。

一、实验目的：设计属特异性引物PCR扩增一未知菌弗朗西斯菌的sdhA基因二、引物设计过程（一）获得目的基因序列1、进入NCBI，点击gemone，搜索待扩增菌的属名Francisella2、点击search，结果得了相关菌种的全基因组序列。

2、点击其中的一个全基因组，如“广州弗朗西斯菌”4. 全基因组1658482 bp，这么大。

人海茫茫，该如何找到sdhA？这时，可使用网页搜索功能，按热键Ctrl+F，再输入要查找基因名称“sdhA”，如上图。

然后，就找到sdhA基因了。

请看，sdhA基因的位置在全基因组的第174351..176144之间哦（见下图）。

5. 再点击左侧的gene（上图），就得到了广州弗朗西斯菌1741bp的sdhA基因全序列，text文本保存。

（二）序列拼接，获得合并序列如果要扩增的是一个已知的菌种，如广州弗朗西斯菌，那么，只要得到上面的引物，你就可以直接去设计引物了。

但如果要扩增的是一个未知菌种呢？1个序列可不够；总之，你的序列得尽可能多，而且是完全不同的序列尽可能多；最好是弗朗西斯菌属内所有的已知的sdhA基因，甚至是与弗朗西斯菌亲缘关系相对较近的军团菌的sdhA基因当然，军团菌没有sdhA基因，这是后话。

《利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究》篇一一、引言随着分子生物学技术的飞速发展，聚合酶链式反应（PCR）已成为实验室研究中不可或缺的技术之一。

PCR引物设计是PCR实验成功的关键步骤之一，其准确性直接影响到PCR的扩增效率和特异性。

因此，选择合适的引物设计软件对于PCR实验的成功至关重要。

本文将介绍如何利用PrimerPremier5.0软件进行PCR引物设计的研究。

二、PrimerPremier5.0软件简介PrimerPremier5.0是一款功能强大的引物设计软件，具有直观的用户界面和丰富的功能，可帮助研究人员快速设计高质量的PCR引物。

该软件支持多种PCR类型，包括常规PCR、实时荧光定量PCR等，可满足不同实验需求。

三、PCR引物设计流程1. 输入目标序列：打开PrimerPremier5.0软件，输入需要设计引物的目标序列。

目标序列可以是基因片段、cDNA等。

2. 设置引物参数：根据实验需求，设置引物的长度、GC含量、退火温度等参数。

PrimerPremier5.0软件会根据这些参数，自动筛选出符合要求的引物序列。

3. 设计引物：在软件中，通过设置不同的引物组合，生成多个潜在的引物序列。

这些引物序列的特异性和扩增效率可通过软件进行评估和预测。

4. 筛选引物：根据实验需求和引物评估结果，选择最合适的引物序列。

在选择过程中，需要考虑引物的特异性、扩增效率、引物间及引物与模板间的互补性等因素。

5. 验证引物：将设计的引物序列导入PCR实验中，进行验证。

通过PCR实验结果，评估引物的特异性和扩增效率。

四、PrimerPremier5.0软件的优势1. 直观的用户界面：PrimerPremier5.0软件具有直观的用户界面，使得用户可以轻松地完成引物设计过程。

2. 丰富的功能：该软件支持多种PCR类型，可满足不同实验需求。

同时，该软件还具有引物评估和预测功能，可帮助用户选择最合适的引物序列。

PCR引物设计序列例题简介P C R（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，通过扩增DN A 分子可用于基因克隆、检测等多个领域。

而P CR引物则是PCR反应中的关键组成部分，它们的设计直接影响P CR反应的成功与否。

本文为您提供一些关于P CR引物设计序列的例题，希望对您在实验和研究中的引物设计有所帮助。

例题一：引物序列设计为了扩增目标基因的特定片段，我们需要设计一对引物，以下是目标基因的序列，请根据该序列设计两个引物，使其具有以下要求：-引物长度在18-25个碱基对之间-引物的3'端碱基G或C-引物的理论Tm在55-65℃之间目标基因序列：A G TC GA TC GA TT AG CGA T CG AG TC GA TC GA TCG G CT AC GA TC GA解答：根据目标基因的序列，我们可以设计如下两对引物：引物1：5'-A GT CG AT CG AT TAG C GA TC-3'引物1满足引物长度在18-25个碱基对之间的要求，同时3'端碱基为C，符合要求。

接下来我们计算一下该引物的理论T m。

根据以下两个规则计算引物的理论Tm：-A与T之间的配对带来的热能释放为-2.2k J/mo l-C与G之间的配对带来的热能释放为-3.8k J/mo l根据以上规则，我们可以计算每个碱基的贡献：-A-T配对:-2.2k J/m o l-C-G配对:-3.8k J/m o l-G-C配对:-3.8k J/m o l-T-A配对:-2.2k J/m o l引物1的理论T m计算如下：(-3.8×4)+(-2.2×10)=-15.2+-22=-37.2k J/mo l该引物的理论Tm为37.2℃，低于所需的要求。

引物2：5'-C GA TC GA TC GA TCG G CT AC G-3'引物2满足引物长度在18-25个碱基对之间的要求，同时3'端碱基为G，符合要求。

如何设计PCR扩增引物1.找出这种细胞物种的PTN全长核苷酸序列2.采⽤primer premier 5.0软件设计引物设计应注意如下要点：● 1. 引物的长度⼀般为15-30 bp，常⽤的是18-27 bp，但不应⼤于38，因为过长会导致其延伸温度⼤于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进⾏反应[2]。

● 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较⾼，尤其是3’端相似性较⾼的序列，否则容易导致错配。

引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。

● 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较⼤的影响。

不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显⾼于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使⽤碱基A[3][4]。

另外，引物⼆聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。

5’端序列对PCR影响不太⼤，因此常⽤来引进修饰位点或标记物[2]。

● 4. 引物序列的GC含量⼀般为40-60%，过⾼或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太⼤[2][5]。

● 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。

Tm值的计算有多种⽅法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使⽤的是最邻近法(the nearest neighbor method) [6][7]。

● 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的⾃由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。

应当选⽤3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），⽽5’端和中间ΔG值相对较⾼的引物。

引物的3’端的ΔG值过⾼，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。

●7. 引物⼆聚体及发夹结构的能值过⾼（超过4.5kcal/mol）易导致产⽣引物⼆聚体带，并且降低引物有效浓度⽽使PCR反应不能正常进⾏[8]。

●8. 对引物的修饰⼀般是在5’端增加酶切位点，应根据下⼀步实验中要插⼊PCR产物的载体的相应序列⽽确定。

PCR引物设计及软件使用技巧PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，在基因测序、基因突变检测、基因定量等领域具有广泛的应用。

而PCR引物的设计是PCR反应成功与否的关键因素之一。

本文将介绍PCR引物设计的原理和方法，并向读者介绍一些常用的PCR引物设计软件及其使用技巧。

一、PCR引物设计的原则和策略PCR引物设计的目标是选取一对特异性的引物，使其能在目标DNA序列的两侧结合并扩增出特定的DNA片段。

PCR引物的设计应遵循以下原则和策略：（一）特异性PCR引物应与目标DNA序列特异结合，防止与其他非目标DNA 序列结合产生非特异性扩增。

为了确保特异性，引物的设计中应防止高度保守的序列，尽量选择低度保守区域。

（二）长度和GC含量PCR引物的长度通常应在18-30个碱基对之间，过短会降低特异性，过长可能会导致扩增效率降低或产生非特异性扩增。

另外，引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低都会影响扩增效果。

（三）防止二聚体和内外引物二聚体PCR引物设计时应防止引物之间以及引物与内外引物之间形成二聚体。

二聚体会影响引物的特异性和扩增效率，甚至导致PCR反应失败。

因此，引物设计时可以利用一些在线工具进行二聚体分析。

（四）防止引物间的交叉杂交和截断引物引物间的交叉杂交会导致非特异性扩增，而截断引物会导致扩增结果缺失或产物截断，因此引物设计时应防止以上状况的发生。

（五）引物间距和末尾相对于PCR引物的设计目标，引物间距相对固定，一般为100-500bp之间。

此外，引物的末端设计也要思量，如添加限制性酶切位点、引入位点或尾部，以便利后续的克隆操作。

二、PCR引物设计的方法PCR引物设计可以接受多种方法，如序列比对、限制性酶切位点分析、引物簇设计等。

下面介绍一些常用的PCR引物设计方法。

（一）序列比对法序列比对法是一种简易易行的PCR引物设计方法。

通过将目标序列与参考序列进行比对，找出保守区域来设计引物。

进修生日志：primer BLAST在线设计引物扩增未知菌种兰会华1整理屈平华2审校1广西壮族自治区人民医院检验科，2广东省中医院检验科PCR的第一步就是引物设计。

引物设计的好坏，直接影响PCR的结果。

引物设计的软件很多，但是，多数时候是引物设计出来了，PCR也能扩增到目的条带，但非特异性的条带好几条，甚至比目的条带还要亮的，郁闷的有木有？再有，分离到一个新菌种，要扩增管家基因或蛋白基因，可引用参考文献的引物，却怎么也扩增不出来，泪奔的有木有？小编在这里给大家介绍利用细菌的全基因组序列，以primer BLAST在线设计引物和PCR扩增新菌种的方法，让您找到高大上的感觉。

一、实验目的：设计属特异性引物PCR扩增一未知菌弗朗西斯菌的sdhA基因二、引物设计过程（一）获得目的基因序列1、进入NCBI，点击gemone，搜索待扩增菌的属名Francisella2、点击search，结果得了相关菌种的全基因组序列。

2、点击其中的一个全基因组，如“广州弗朗西斯菌”4. 全基因组1658482 bp，这么大。

人海茫茫，该如何找到sdhA？这时，可使用网页搜索功能，按热键Ctrl+F，再输入要查找基因名称“sdhA”，如上图。

然后，就找到sdhA基因了。

请看，sdhA基因的位置在全基因组的第174351..176144之间哦（见下图）。

5. 再点击左侧的gene（上图），就得到了广州弗朗西斯菌1741bp的sdhA基因全序列，text文本保存。

（二）序列拼接，获得合并序列如果要扩增的是一个已知的菌种，如广州弗朗西斯菌，那么，只要得到上面的引物，你就可以直接去设计引物了。

但如果要扩增的是一个未知菌种呢？1个序列可不够；总之，你的序列得尽可能多，而且是完全不同的序列尽可能多；最好是弗朗西斯菌属内所有的已知的sdhA基因，甚至是与弗朗西斯菌亲缘关系相对较近的军团菌的sdhA基因当然，军团菌没有sdhA基因，这是后话。