利用INTERNET设计PCR引物举例

PCR技术的原理举例说明其应用1. PCR技术的简介PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，可在短时间内扩增特定DNA片段。

PCR技术的原理基于DNA的复制过程，通过不断的循环反应，在短时间内制备大量DNA的复制产物。

2. PCR技术的基本原理PCR技术主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。

2.1 变性变性步骤是将待扩增的DNA样本进行高温处理，使DNA双链解离成单链。

这一步骤通常需要在96℃左右进行，使DNA的氢键断裂，使DNA变为单链状态。

2.2 退火退火步骤是将温度调低至50-65℃，引入引物（即扩增反应的两端），使其与待扩增的DNA序列互相结合。

引物是一段能够特异性结合到待扩增片段的单链DNA序列。

2.3 延伸延伸步骤是将温度升至72℃，在此温度下添加DNA聚合酶，开始合成新的DNA链。

DNA聚合酶能识别引物和DNA模板，并在引物的基础上合成互补的DNA链。

PCR反应通常会重复进行数十次，每一轮循环都会使DNA模板的数量翻倍，从而扩增目标DNA片段。

3. PCR技术的应用举例PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括基因组学研究、疾病诊断和法医学等。

以下是PCR技术应用的一些示例。

3.1 基因组学研究PCR技术在基因组学研究中起着重要的作用。

科学家可以利用PCR技术扩增和纯化目标基因或基因组区域。

这使得研究者能够更好地了解基因的结构和功能，并探索基因与疾病之间的关系。

3.2 疾病诊断PCR技术在疾病诊断中被广泛应用。

例如，PCR可以用于检测病原体的存在，如细菌、病毒和寄生虫等。

通过扩增和检测特定的DNA序列，可以确定是否存在特定的病原体，并且判断感染的程度。

3.3 法医学PCR技术在法医学中也被广泛应用。

通过使用PCR技术，可以从犯罪现场的DNA样本中扩增和分析特定的DNA序列。

这些序列可以用于确定嫌疑人的身份，提供法律依据。

3.4 环境监测PCR技术还可以用于环境监测。

例如，科学家可以利用PCR技术检测水源、土壤和空气中的微生物。

实验五 PCR引物设计及评价【实验目的】1、掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primer premier5.0软件进行引物搜索。

2、掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。

【实验原理】一、引物设计原则聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，故又称基因的体外扩增法。

PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多，最广泛的手段之一，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环，使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。

现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行，可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。

引物设计原则如下：1、引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。

引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。

这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性；2、引物的长度一般为15-30 bp。

常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；3、引物不应形成二级结构。

引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行；4、引物序列的GC含量一般为40-60%。

过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大；5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。

Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)；6、引物5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。

7、引物3’端不可修饰。

引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。

定性。应当选用3’端ΔG 值较低（绝对值不 超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的 引物。引物的3’端的ΔG 值过高，容易在错
配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。
引物设计的原则
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4、引物二聚体及发夹结构的能值过高（超 过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带， 并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能
正常进行。
引物设计的原则
welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience 5、对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位
为宜。这可为有效退火提供足够热。
引物设计的原则
请在此添加段落内容
3、ΔG 值是指DNA 双链形成所需的自由能， welcome to use these PowerPoint templates, New
Content design, 10 years experience 该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳
kb，则用24个核苷酸的引物。有人用20～
23个核苷酸引物得到40 kb的产物。
引物设计的原则
请在此添加段落内容
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2、引物GC含量
GC含量在40%－60%之间，以45-55％
PCR引物设计 及相关软件使用
IMB:洪伟玲

进修生日志：primer BLAST在线设计引物扩增未知菌种兰会华1整理屈平华2审校1广西壮族自治区人民医院检验科，2广东省中医院检验科PCR的第一步就是引物设计。

引物设计的好坏，直接影响PCR的结果。

引物设计的软件很多，但是，多数时候是引物设计出来了，PCR也能扩增到目的条带，但非特异性的条带好几条，甚至比目的条带还要亮的，郁闷的有木有？再有，分离到一个新菌种，要扩增管家基因或蛋白基因，可引用参考文献的引物，却怎么也扩增不出来，泪奔的有木有？小编在这里给大家介绍利用细菌的全基因组序列，以primer BLAST在线设计引物和PCR扩增新菌种的方法，让您找到高大上的感觉。

一、实验目的：设计属特异性引物PCR扩增一未知菌弗朗西斯菌的sdhA基因二、引物设计过程（一）获得目的基因序列1、进入NCBI，点击gemone，搜索待扩增菌的属名Francisella2、点击search，结果得了相关菌种的全基因组序列。

2、点击其中的一个全基因组，如“广州弗朗西斯菌”4. 全基因组1658482 bp，这么大。

人海茫茫，该如何找到sdhA？这时，可使用网页搜索功能，按热键Ctrl+F，再输入要查找基因名称“sdhA”，如上图。

然后，就找到sdhA基因了。

请看，sdhA基因的位置在全基因组的第174351..176144之间哦（见下图）。

5. 再点击左侧的gene（上图），就得到了广州弗朗西斯菌1741bp的sdhA基因全序列，text文本保存。

（二）序列拼接，获得合并序列如果要扩增的是一个已知的菌种，如广州弗朗西斯菌，那么，只要得到上面的引物，你就可以直接去设计引物了。

但如果要扩增的是一个未知菌种呢？1个序列可不够；总之，你的序列得尽可能多，而且是完全不同的序列尽可能多；最好是弗朗西斯菌属内所有的已知的sdhA基因，甚至是与弗朗西斯菌亲缘关系相对较近的军团菌的sdhA基因当然，军团菌没有sdhA基因，这是后话。

《利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究》篇一一、引言随着分子生物学技术的飞速发展，聚合酶链式反应（PCR）已成为实验室研究中不可或缺的技术之一。

PCR引物设计是PCR实验成功的关键步骤之一，其准确性直接影响到PCR的扩增效率和特异性。

因此，选择合适的引物设计软件对于PCR实验的成功至关重要。

本文将介绍如何利用PrimerPremier5.0软件进行PCR引物设计的研究。

二、PrimerPremier5.0软件简介PrimerPremier5.0是一款功能强大的引物设计软件，具有直观的用户界面和丰富的功能，可帮助研究人员快速设计高质量的PCR引物。

该软件支持多种PCR类型，包括常规PCR、实时荧光定量PCR等，可满足不同实验需求。

三、PCR引物设计流程1. 输入目标序列：打开PrimerPremier5.0软件，输入需要设计引物的目标序列。

目标序列可以是基因片段、cDNA等。

2. 设置引物参数：根据实验需求，设置引物的长度、GC含量、退火温度等参数。

PrimerPremier5.0软件会根据这些参数，自动筛选出符合要求的引物序列。

3. 设计引物：在软件中，通过设置不同的引物组合，生成多个潜在的引物序列。

这些引物序列的特异性和扩增效率可通过软件进行评估和预测。

4. 筛选引物：根据实验需求和引物评估结果，选择最合适的引物序列。

在选择过程中，需要考虑引物的特异性、扩增效率、引物间及引物与模板间的互补性等因素。

5. 验证引物：将设计的引物序列导入PCR实验中，进行验证。

通过PCR实验结果，评估引物的特异性和扩增效率。

四、PrimerPremier5.0软件的优势1. 直观的用户界面：PrimerPremier5.0软件具有直观的用户界面，使得用户可以轻松地完成引物设计过程。

2. 丰富的功能：该软件支持多种PCR类型，可满足不同实验需求。

同时，该软件还具有引物评估和预测功能，可帮助用户选择最合适的引物序列。

PCR引物设计序列例题简介P C R（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，通过扩增DN A 分子可用于基因克隆、检测等多个领域。

而P CR引物则是PCR反应中的关键组成部分，它们的设计直接影响P CR反应的成功与否。

本文为您提供一些关于P CR引物设计序列的例题，希望对您在实验和研究中的引物设计有所帮助。

例题一：引物序列设计为了扩增目标基因的特定片段，我们需要设计一对引物，以下是目标基因的序列，请根据该序列设计两个引物，使其具有以下要求：-引物长度在18-25个碱基对之间-引物的3'端碱基G或C-引物的理论Tm在55-65℃之间目标基因序列：A G TC GA TC GA TT AG CGA T CG AG TC GA TC GA TCG G CT AC GA TC GA解答：根据目标基因的序列，我们可以设计如下两对引物：引物1：5'-A GT CG AT CG AT TAG C GA TC-3'引物1满足引物长度在18-25个碱基对之间的要求，同时3'端碱基为C，符合要求。

接下来我们计算一下该引物的理论T m。

根据以下两个规则计算引物的理论Tm：-A与T之间的配对带来的热能释放为-2.2k J/mo l-C与G之间的配对带来的热能释放为-3.8k J/mo l根据以上规则，我们可以计算每个碱基的贡献：-A-T配对:-2.2k J/m o l-C-G配对:-3.8k J/m o l-G-C配对:-3.8k J/m o l-T-A配对:-2.2k J/m o l引物1的理论T m计算如下：(-3.8×4)+(-2.2×10)=-15.2+-22=-37.2k J/mo l该引物的理论Tm为37.2℃，低于所需的要求。

引物2：5'-C GA TC GA TC GA TCG G CT AC G-3'引物2满足引物长度在18-25个碱基对之间的要求，同时3'端碱基为G，符合要求。

04
pcr引物的应用与案例分 析
pcr引物在基因克隆中的应用
01
pcr引物用于基因克隆的目的是为了获得目的基因的序列信息， 进而进行后续的基因功能和表达研究。
02
设计特异性引物，通过pcr技术，从基因或基因组中筛选出目的基因。
引物设计需考虑基因序列的特异性、扩增效率和避免非特异性
03
扩增等因素。
引物特异性优化
避免引物间的互补
引物之间不应存在互补序列，以避免形成引物二聚体或发夹 结构。
避免引物与模板扩增 和产物。
引物扩增效率的优化
引物与模板的匹配度
引物的3'端应与模板完全匹配，以提 高引物的扩增效率。
引物之间的匹配度
两个引物之间应有良好的匹配度，以 保证PCR反应的顺利进行。
引导合成
引物作为合成子链的起点，通过与 DNA聚合酶的结合，引导合成与 模板互补的DNA链。
决定产物长度
引物的设计决定了PCR产物的长度 ，通过选择合适的引物，可以控制 产物的大小和特异性。
pcr引物设计的基本原则
特异性
长度和序列
引物应与模板DNA具有高度的特异性，避 免与其他非目标DNA序列发生非特异性结 合。
pcr引物的未来发展方向与挑战
引物设计的自动化
随着生物信息学的发展，未来引物设计 可能更加自动化，减少人工干预和误差
。
标准化和质量控制
建立引物设计的标准化流程，加强引 物设计的质量控制，确保实验结果的
可靠性和可重复性。
新型引物设计策略
针对特定需求，开发新型引物设计策 略，提高PCR反应的特异性和灵敏度 。
引物灵敏度测试
03
测试引物在不同模板浓度下的扩增效率，选择灵敏度较高的引

如何设计PCR扩增引物1.找出这种细胞物种的PTN全长核苷酸序列2.采⽤primer premier 5.0软件设计引物设计应注意如下要点：● 1. 引物的长度⼀般为15-30 bp，常⽤的是18-27 bp，但不应⼤于38，因为过长会导致其延伸温度⼤于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进⾏反应[2]。

● 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较⾼，尤其是3’端相似性较⾼的序列，否则容易导致错配。

引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。

● 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较⼤的影响。

不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显⾼于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使⽤碱基A[3][4]。

另外，引物⼆聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。

5’端序列对PCR影响不太⼤，因此常⽤来引进修饰位点或标记物[2]。

● 4. 引物序列的GC含量⼀般为40-60%，过⾼或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太⼤[2][5]。

● 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。

Tm值的计算有多种⽅法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使⽤的是最邻近法(the nearest neighbor method) [6][7]。

● 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的⾃由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。

应当选⽤3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），⽽5’端和中间ΔG值相对较⾼的引物。

引物的3’端的ΔG值过⾼，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。

●7. 引物⼆聚体及发夹结构的能值过⾼（超过4.5kcal/mol）易导致产⽣引物⼆聚体带，并且降低引物有效浓度⽽使PCR反应不能正常进⾏[8]。

●8. 对引物的修饰⼀般是在5’端增加酶切位点，应根据下⼀步实验中要插⼊PCR产物的载体的相应序列⽽确定。

PCR引物设计及软件使用技巧PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，在基因测序、基因突变检测、基因定量等领域具有广泛的应用。

而PCR引物的设计是PCR反应成功与否的关键因素之一。

本文将介绍PCR引物设计的原理和方法，并向读者介绍一些常用的PCR引物设计软件及其使用技巧。

一、PCR引物设计的原则和策略PCR引物设计的目标是选取一对特异性的引物，使其能在目标DNA序列的两侧结合并扩增出特定的DNA片段。

PCR引物的设计应遵循以下原则和策略：（一）特异性PCR引物应与目标DNA序列特异结合，防止与其他非目标DNA 序列结合产生非特异性扩增。

为了确保特异性，引物的设计中应防止高度保守的序列，尽量选择低度保守区域。

（二）长度和GC含量PCR引物的长度通常应在18-30个碱基对之间，过短会降低特异性，过长可能会导致扩增效率降低或产生非特异性扩增。

另外，引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低都会影响扩增效果。

（三）防止二聚体和内外引物二聚体PCR引物设计时应防止引物之间以及引物与内外引物之间形成二聚体。

二聚体会影响引物的特异性和扩增效率，甚至导致PCR反应失败。

因此，引物设计时可以利用一些在线工具进行二聚体分析。

（四）防止引物间的交叉杂交和截断引物引物间的交叉杂交会导致非特异性扩增，而截断引物会导致扩增结果缺失或产物截断，因此引物设计时应防止以上状况的发生。

（五）引物间距和末尾相对于PCR引物的设计目标，引物间距相对固定，一般为100-500bp之间。

此外，引物的末端设计也要思量，如添加限制性酶切位点、引入位点或尾部，以便利后续的克隆操作。

二、PCR引物设计的方法PCR引物设计可以接受多种方法，如序列比对、限制性酶切位点分析、引物簇设计等。

下面介绍一些常用的PCR引物设计方法。

（一）序列比对法序列比对法是一种简易易行的PCR引物设计方法。

通过将目标序列与参考序列进行比对，找出保守区域来设计引物。

进修生日志：primer BLAST在线设计引物扩增未知菌种兰会华1整理屈平华2审校1广西壮族自治区人民医院检验科，2广东省中医院检验科PCR的第一步就是引物设计。

引物设计的好坏，直接影响PCR的结果。

引物设计的软件很多，但是，多数时候是引物设计出来了，PCR也能扩增到目的条带，但非特异性的条带好几条，甚至比目的条带还要亮的，郁闷的有木有？再有，分离到一个新菌种，要扩增管家基因或蛋白基因，可引用参考文献的引物，却怎么也扩增不出来，泪奔的有木有？小编在这里给大家介绍利用细菌的全基因组序列，以primer BLAST在线设计引物和PCR扩增新菌种的方法，让您找到高大上的感觉。

一、实验目的：设计属特异性引物PCR扩增一未知菌弗朗西斯菌的sdhA基因二、引物设计过程（一）获得目的基因序列1、进入NCBI，点击gemone，搜索待扩增菌的属名Francisella2、点击search，结果得了相关菌种的全基因组序列。

2、点击其中的一个全基因组，如“广州弗朗西斯菌”4. 全基因组1658482 bp，这么大。

人海茫茫，该如何找到sdhA？这时，可使用网页搜索功能，按热键Ctrl+F，再输入要查找基因名称“sdhA”，如上图。

然后，就找到sdhA基因了。

请看，sdhA基因的位置在全基因组的第174351..176144之间哦（见下图）。

5. 再点击左侧的gene（上图），就得到了广州弗朗西斯菌1741bp的sdhA基因全序列，text文本保存。

（二）序列拼接，获得合并序列如果要扩增的是一个已知的菌种，如广州弗朗西斯菌，那么，只要得到上面的引物，你就可以直接去设计引物了。

但如果要扩增的是一个未知菌种呢？1个序列可不够；总之，你的序列得尽可能多，而且是完全不同的序列尽可能多；最好是弗朗西斯菌属内所有的已知的sdhA基因，甚至是与弗朗西斯菌亲缘关系相对较近的军团菌的sdhA基因当然，军团菌没有sdhA基因，这是后话。

最近刚开始做PCR，参考了很多与引物设计相关的帖子，结合自己使用primer5和oligo的体会，想谈谈自己设计引物的方法和步骤，恳请各位前辈指正。

RT-PCR引物设计原则和方法在NCBI上搜索到该基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。

打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy 目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。

点击Primer，进入引物窗口。

此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。

在Search Parameters里面，可以设定相应参数。

一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp。

点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。

对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’端不要以A结尾，最好是G或者C，T也可以；3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG 或CCC，否则容易引起错配。

此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。

该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。

若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。

5. 上下引物的互补性：
• 一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物 的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形 成引物二聚体。
6. 3’末端 • 3’末端的性质非常关键。 • 不推荐3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列的
引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生； • 5’端序列添加限制性酶切位点。
二、Primer Premier 软件设计引物
• 是由加拿大的 Premier 公司开发的专业用于 PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的 软件
• 主要界面分为序列编辑窗口（genetank）、 primer design、酶切分析（restriction site）和 Motif
பைடு நூலகம்
正向（As is）、反向（reversed）、互补（complemented）及 反向互补（reverse complemented ）。
E值越小为好！！
缺失或插入，用“-”来表 示
Query1、2表示输入 的两对引物，Sbjct表 示在库里比对的序列
Degeneracy多义性，尽量减少
GC% 含量：对于 引物多义性，这样会带来更好
PCR 反应来说 GC 的特异性，尽量避免3’末端
含量在50% 左右比 的多义性，因为这个位置即使
较合适。
一个碱基的错配都能阻止引物
（40-60%,45-55%） 延伸。
三、ncbi 在线 primer-Blast 获取候选引物
• 在Enter Query Sequence栏中输入引物序列： • 例：引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;
5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’
• 同时输入上下游引物。输入上下游引物都从5’ → 3’。

内封面本科毕业设计（论文）题目 H1N1流感病毒H1亚型PCR快速检测方法的引物设计院 ( 系 )专业名称年级班级学生姓名指导教师2011年 5 月 24 日摘要目的：利用生物信息技术对H1N1流感病毒H1亚型设计PCR快速检测方法的引物。

方法：利用DNAStar的MegAlign软件对H1N1流感病毒与从NCBI Genbank下载的其他亚型流感病毒核酸序列进行比对，并对H1亚型不同毒株的HA序列之间进行核酸序列比对。

最后利用primer premier5.0设计引物，并对设计的引物在NCBI中进行BLAST。

结果：通过MegAlign软件比对发现，H1亚型流感病毒HA序列与其他亚型的HA序列核酸序列同源性较差，而H1亚型不同毒株的HA序列较为保守，通过筛选设计出了较好的引物，使H1N1流感病毒H1亚型PCR的检测更加迅速、准确。

结论：H1N1流感病毒H1亚型与其他亚型的核酸序列同源性较差，而H1亚型不同毒株的HA序列较为保守，应用软件设计的H1亚型的引物可以较好地检测出H1亚型流感病毒。

关键词：H1N1流感病毒H1亚型快速检测PCR引物设计ABSTRACTObjective: To design H1N1 influenza virus H1 subtype PCR primers for rapid detection method with biological information technology. Methods: Compare nucleic acid sequences from H1N1 influenza virus and other subtypes of flu virus download from Genbank NCBI with MegAlign of DNAStar software and HA nucleic acid sequences from the different strains of H1 subtypes.Finally, design primers with the primer premier5.0, and Blast the primers in NCBI. Results: Through the MegAlign of DNAStar software ,we find that the homology of nucleic acids sequences between H1N1 influenza virus and other subtypes is poor, however, the nucleic acids sequences of different strains of H1 subtypes are more conservative. A pair of better primers were designed by screening from the results in primer premier5.0, making the PCR detection of H1N1 influenza virus more quickly and accurately. Conclusion: The homology of nucleic acids sequences between H1N1 influenza virus and other subtypes is poor, however, the nucleic acids sequences of different strains of H1 subtypes are more conservative. H1N1 influenza virus H1 subtype primer designe by software is better able to detect the H1 subtypes of flu viruses.Key words:H1N1 influenza virus H1 subtype rapid detection Design PCR primers目录摘要 (1)ABSTRACT (2)目录 (3)1 前言 (4)1.1 流感及流感病毒概述 (4)1.1.1. 流感的流行病学特点及主要症状 (4)1.1.2 . 流感病毒的分类及命名 (4)1.1.3. 流感病毒的基因组特征 (5)1.1.4. 流感病毒的变异和进化 (5)1.2当前流行的甲型H1N1 流感病毒的研究概况 (7)1.2.1.当前流行的甲型H1N1 流感病毒的流行现状 (7)1.2.2.当前流行的甲型H1N1 流感病毒的特点 (8)1.2.3.当前流行的甲型H1N1 流感病毒的检测方法 (9)2 研究材料 (10)2.1 H1N1流感病毒H1亚型核酸序列的获得 (10)2.2 其它流感病毒HA亚型核酸序列的获得 (11)3 研究方法 (15)3.1核酸序列研究方法 (15)3.2特异性引物设计方法 (15)4 结果与分析 (20)4.1核酸序列特征结果与分析 (20)4.2引物设计结果与分析 (33)5 结论 (38)5.1 讨论 (38)5.2 展望 (39)致谢 (40)参考文献 (41)1 前言1.1 流感及流感病毒概述1.1.1. 流感的流行病学特点及主要症状流行性感冒（influenza，简称流感）是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一种传染性强、传播速度快的疾病。

一、引物设计s‎t ep by step1、在NCBI‎上搜索到目‎的基因，找到该基因‎的mRNA‎，在CDS选‎项中，找到编码区‎所在位置，在下面的o‎r igin‎中，Copy该‎编码序列作‎为软件查询‎序列的候选‎对象。

2、用Prim‎e r Premi‎e r5搜索‎引物①打开Pri‎m er Premi‎e r5，点击Fil‎e-New-DNA seque‎n ce,出现输入序‎列窗口，Copy目‎的序列在输‎入框内（选择As），此窗口内，序列也可以‎直接翻译成‎蛋白。

点击Pri‎m er,进入引物窗‎口。

②此窗口可以‎链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Sea‎r ch按钮‎，进入引物搜‎索框，选择“PCR‎prime‎r s”，“Pairs‎”，设定搜索区‎域和引物长‎度和产物长‎度。

在Sear‎c h Param‎e ters‎里面，可以设定相‎应参数。

一般若无特‎殊需要，参数选择默‎认即可，但产物长度‎可以适当变‎化，因为100‎～200bp‎的产物电泳‎跑得较散，所以可以选‎择300～500bp‎.③点击OK，软件即开始‎自动搜索引‎物，搜索完成后‎，会自动跳出‎结果窗口，搜索结果默‎认按照评分‎（Ratin‎g）排序，点击其中任‎一个搜索结‎果，可以在“引物窗口”中，显示出该引‎物的综合情‎况，包括上游引‎物和下游引‎物的序列和‎位置，引物的各种‎信息等。

④对于引物的‎序列，可以简单查‎看一下，避免出现下‎列情况：3’不要出现连‎续的3个碱‎基相连的情‎况，比如GGG‎或CCC，否则容易引‎起错配。

此窗口中需‎要着重查看‎的包括：Tm应该在‎55～70度之间‎，GC％应该在45‎％～55％间，上游引物和‎下游引物的‎T m值最好‎不要相差太‎多，大概在2度‎以下较好。

该窗口的最‎下面列出了‎两条引物的‎二级结构信‎息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉‎二聚体和错‎误引发位置‎。

手把手教你在线做PCR引物设计POST by Bingsen Xu前言：我是刚刚注册到丁香园，在PCR技术讨论版看见置顶贴，“请求助引物设计的战友先进来这里！”稍微浏览了一下，发现很多朋友对PCR引物设计还不是很熟悉，我愿意把自己积累的一点引物设计方面的经验和大家分享，希望不会做引物设计的朋友看完之后，可以不用再发求助贴而是自己动手做引物设计或者引物检验。

开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。

当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本贴的讨论范围。

另外，要先对PCR目的序列的长度有个大致估计，好了，马上开始吧：第一步：找到Primer3的站点。

你不用记住这个站点，但是要记住“Primer3”这个词，然后打开GOOGLE首页，输入Primer3，跳出来的第一个项目就是了“Primer3 Input 0.4.0 (primer3-web/htdocs/input-040.htm)”网址是/。

第二步：贴上模板序列。

进入Primer3站点，可以看到一个引物设计的界面。

（附件Word文档里有图）在“Paste source sequence below (5'->3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。

注意是5'->3'方向的，数字或者空格都没关系，软件会自动过滤的。

第三步：重要参数设定。

首先是“Product Size Ranges”，如果你不希望软件给你随便做的话，首先要调整的就是这个参数。

默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500，具体看情况调整。

第二个参数是“Primer Size”，默认值一般可以用，但是，当你用熟了这个软件，你自己就知道该怎么改了。

第三个参数是”Primer Tm”这个和Primer Size差不多。

如何设计PCR引物查找目的基因序列并不能直接用于我们研究所用，因为查找到的基因序列只能算是基因的电子序列，并不是我们研究要用的现实中的序列，如何获得现实的基因序列呢？这就需要我们根据基因的电子序列来设计引物了，通过引物借助PCR方法才能获得我们的目的基因序列。

接下来，我们(汉恒生物)将介绍一下PCR方法并讲述如何设计引物。

PCR（polymerase chain reaction），即聚合酶链反应，又称基因体外扩增技术，是由一对引物介导、能在体外对特定DNA 片段进行快速酶促扩增的技术。

PCR能把很微量的遗传物质在数小时内扩增数百万倍达到检测水平．使原来无法进行分析和检测的许多项目得以完成。

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。

引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。

实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。

若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

3.长度寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。

引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T）Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。

4.G+C含量G+C含量一般为40%~60%。

其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。

一般原则
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高 或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大。 不同的算法推荐45-55%或50-60%
一般原则
5. ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能， 该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳 定性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不 超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的 引物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错 配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应 。（能值越高越容易结合）
可以在5’端前添加G或C以提 高Tm值，或加入酶切位点， 然后再做Analyze。
决定后，将该引物选中，Ctrl+C、Ctrl+V粘贴： GCCAGTTCTGATATTTACACC
同理，编辑并保存下游引物
下游引物：AATGAAATCCAGTACGCTTC，方向默认是5’→3’
4.6 引物的二次筛选
3’ΔG的绝对值不要超过9，否则会在错配点形成双链
接下来进行引物具体分析。 点击Analyze
分析二聚体和发夹结构 点击Analyze – Duplex Formation – Forward Primer
上游引物间形成二聚体 要求ΔG小于4.5，配对碱基对不超过3
发夹结构 要求ΔG小于4.5，配对碱基对不超过3
会弹出一个页面有10秒钟的 更新提示
图形示意结果
带有genbank的链接，点击可以进入 相应的genbank序列 匹配序列描述
具体匹配情况
将四条序列保存在一个txt文档中 匹配情况，分值，e值
24
4.3 DNAMAN 同源序列比对获取保守区域
4.4 Primer Primier引物设计与筛选
三、引物设计流程