土壤中细菌、真菌呼吸作用强度的测定

Sdu微生物大实验土壤微生物的分离纯化与鉴定【实验目的】1、从各地区土壤中筛选含几丁质酶的真菌及含果胶酶的菌株；2、通过从土壤中分离纯化菌株，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的筛选、分离纯化方法和无菌操作技术。

3、复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。

4、掌握微生物的鉴定技术、菌种保藏技术。

【实验原理】1、微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

此次实验采取平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：a.选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。

b.微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。

微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。

前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。

2、霉菌：霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。

霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。

霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约 3-10μm ），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。

观察霉菌的形态有多种方法，常用的有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃培养观察法三种方法，本实验采用载玻片培养观察法。

3、果胶酶筛选培养基：配制以果胶为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用果胶的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产果胶酶的菌株。

刚果红（Congo Red,简称CR）是一种染料，它可与果胶形成红色复合物，但并不和果胶水解后的产物发生这种显色反应，在含有果胶的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的果胶形成红色复合物。

土壤微生物量测定方法常规培养法是最早也是最常用的土壤微生物量测定方法之一、该方法是将土壤样品经过稀释后接种到含有特定培养基的培养皿中，经过一段时间的培养，根据培养皿上的菌落数量计算土壤中微生物的数量。

常用的培养基有营养琼脂培养基、土壤细菌培养基和土壤真菌培养基等。

常规培养法的优点是简单易行，可以同时测定不同类型微生物的数量，但该方法有一些局限性，如只能测定能够在培养基上生长的微生物，不能测定需异养条件才能生长的微生物，而且该方法容易低估土壤中微生物的真实数量。

生物量测定法是一种利用土壤微生物的生物学过程测定微生物量的方法。

该方法一般分为碳饥饿法和氮饥饿法两种。

碳饥饿法是将土壤样品暴露在低碳条件下（如0.01%葡萄糖溶液中）一段时间后，测定土壤中的微生物的生物量。

氮饥饿法是将土壤样品暴露在低氮条件下（如0.01%硝酸铵溶液中）一段时间后，测定土壤中的微生物的生物量。

这两种方法都是利用微生物的生物学特性，通过测定微生物对不同养分的响应来估计微生物的数量。

生物量测定法的优点是准确度较高，可以测定土壤中广泛类型的微生物，但该方法也有一些局限性，如需要较长的试验周期，测定过程中需要严格控制温度、湿度等环境条件，且操作较为繁琐。

生物学特征法是一种通过测定土壤微生物的生物学特征来评估微生物群体数量的方法。

该方法常用的特征包括土壤酶活性、呼吸作用速率、微生物生长速率和微生物群体的磷脂脂肪酸组成等。

这些特征的测定可以通过色谱、酶反应和分子生物学技术等手段进行。

生物学特征法的优点是操作简便，消耗土壤样品较少，时间短，结果可靠。

但该方法也有一些问题，如不同微生物对环境的响应不同，结果受环境因素影响较大。

综上所述，土壤微生物量的测定方法有常规培养法、生物量测定法和生物学特征法等。

不同的测定方法各有优缺点，使用时可以根据具体的研究目的和所需数据的准确度进行选择。

此外，单一的方法往往无法全面准确地评估土壤微生物量，因此常采用多种方法综合分析，以得到更准确的结果。

土壤微生物计数法土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。

土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。

1.1培养计数法1.1.1概要在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。

因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。

这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。

稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。

最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。

根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。

1.1.2稀释平板法一、试剂配制常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。

按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。

凝固后的培养基可加热溶解后使用。

二、仪器设备广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。

（1）土壤系列稀释液制备取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。

土壤呼吸作用名词解释土壤呼吸作用是指土壤产生并向大气释放二氧化碳的过程。

土壤呼吸作用主要由土壤微生物(异养呼吸)和根系(自养呼吸)产生.除植被冠层光合作用，土壤呼吸作用是陆地生态系统碳收支中最大的通量.因此，精确预测陆地与大气之间碳交换需要深入理解影响土壤呼吸作用的主导因子，特别是对其主要组成部分土壤微生物和根系呼吸作用的影响机理.土壤微生物和根系呼吸作用主要是土壤中生物代谢作用的结果，因此能够影响生物活动的生态因子都会导致其呼吸强度的变化，如气候因子、土壤因子、植被及地表覆被物等.此外，人类活动引起的大气C0'浓度剧增及由此导致的增温效应，不仅是目前人类所面临的最严峻的全球环境问题，而且直接或间接地影响着土壤微生物和根系呼吸作用.同时，人类活动本身也会对土壤微生物和根系呼吸作用产生影响，如放牧、施肥、农药、重金属污染等扩展资料：土壤呼吸(Soil Respiration)是指土壤释放二氧化碳的过程，严格意义上讲是指未扰动土壤中产生二氧化碳的所有代谢作用，包括三个生物学过程(即土壤微生物呼吸、根系呼吸、土壤动物呼吸)和一个非生物学过程，即含碳矿物质的化学氧化作用。

森林土壤呼吸是陆地生态系统土壤呼吸的重要部分，其动态变化将对全球碳平衡产生深远的影响[9]。

全球森林过度采伐和其他土地利用变化导致土壤CO2释放的增加量，占过去两个世纪来因人类活动释放的CO2总量的一半，是除化石燃烧释放CO2导致大气CO2浓度升高的另一重要因素。

森林土壤呼吸也是目前已建立的长期监测CO2通量网站的重要研究对象之一。

是研究世界碳循环的重要课题。

对生态学、环境科学及地球表层系统科学意义重大。

土壤呼吸作用，一般指土壤释放CO2或吸收O2的强度，可分为自养型呼吸(根呼吸和根际微生物呼吸)和异养型呼吸(微生物和动物呼吸)，自养型呼吸消耗的底物直接来源于植物光合作用产物向地下分配的部分,而异养型呼吸则利用土壤中的有机或无机碳。

一、实验目的1. 了解土壤中微生物的种类和数量；2. 掌握土壤微生物的分离和纯化方法；3. 熟悉微生物的形态和生理生化特性；4. 培养无菌操作和实验记录能力。

二、实验原理土壤是微生物生活的良好环境，其中含有大量微生物，包括细菌、放线菌、真菌、藻类、原生动物、噬菌体、病毒和线虫等。

微生物在土壤中发挥着重要作用，如土壤肥力的维持、植物生长的促进、有机物的分解等。

本实验通过分离和纯化土壤微生物，观察其形态和生理生化特性，进一步了解土壤微生物的种类和功能。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖、酵母提取物、琼脂、无菌水、无菌平板、无菌移液器、显微镜、培养箱等。

2. 实验仪器：天平、酒精灯、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、无菌操作台等。

四、实验方法1. 土壤样品的采集：选取有代表性的土壤样品，注意样品的均匀性和代表性。

2. 土壤微生物的分离和纯化：a. 制备牛肉膏蛋白胨培养基，高压蒸汽灭菌后备用；b. 将土壤样品与无菌水按1:10的比例混合，充分搅拌；c. 将混合液进行系列稀释，取适量稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上；d. 将平板倒置放入恒温培养箱中培养，观察菌落生长情况；e. 挑取单个菌落进行纯化，重复以上步骤，直至获得纯菌株。

3. 微生物的形态观察：a. 将纯菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基，培养后进行显微镜观察；b. 观察菌体的形态、大小、排列方式等特征。

4. 微生物的生理生化特性测定：a. 对纯菌株进行革兰氏染色，观察菌体的染色特性；b. 进行糖发酵试验，观察菌株对葡萄糖、乳糖、麦芽糖等糖类的分解能力；c. 进行氧化酶试验，观察菌株的氧化酶活性。

五、实验结果与分析1. 土壤样品的微生物数量：通过平板计数法，估算土壤样品中的微生物数量。

2. 微生物的分离和纯化：成功分离和纯化出多种微生物，如细菌、放线菌、真菌等。

3. 微生物的形态观察：观察到的菌体形态、大小、排列方式等特征与文献报道相符。

土壤微生物数量测定方法土壤微生物是指生活在土壤中的微小生物，包括细菌、真菌、放线菌、古菌等。

土壤微生物在土壤的生物地球化学循环、有机质分解、养分转换和植物健康等过程中起着重要的作用。

因此，对土壤微生物数量的准确测定具有重要意义。

本文将介绍一些常用的土壤微生物数量测定方法。

1.瓶培法：将适量的土壤样品与适量的培养基混合，在37°C下培养约24小时，然后通过平板计数法或最凼稀释法进行测定。

2.膜过滤法：将土壤提取液通过特定孔径的膜过滤器滤过，然后将膜放置在培养基上进行细菌的生长，最后进行计数。

3.间接法：通过测定土壤样品的可培养细菌指标，如氧化还原酶、脱氢酶等的活性，从而推算出土壤中的细菌数量。

4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的细菌基因，如16SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行细菌数量的测定。

1.直接镜检法：直接在显微镜下观察土壤样品中的真菌，通过计数来估算真菌的数量。

2.平板计数法：将土壤样品均匀撒在培养基上，通过培养方法使真菌生长形成菌落，最后进行计数。

3.膜过滤法：与细菌数量测定相似，将土壤提取液通过膜过滤器滤过，然后将膜放置在适当的培养基上进行真菌的生长，最后进行计数。

4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的真菌基因，如18SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行真菌数量的测定。

1.直接镜检法：直接在显微镜下观察土壤样品中的放线菌，通过计数来估算放线菌的数量。

2.平板计数法：将土壤样品均匀撒在培养基上，通过培养方法使放线菌生长形成菌落，最后进行计数。

3.膜过滤法：与细菌和真菌数量测定类似，将土壤提取液通过膜过滤器滤过，然后将膜放置在适当的培养基上进行放线菌的生长，最后进行计数。

4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的放线菌基因，如16SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行放线菌数量的测定。

通过上述方法测定土壤中微生物的数量，可以了解土壤微生物对土壤生态系统功能的影响，并为土壤质量评价和科学合理利用提供依据。

山东林业科技 2021 年第 2 期 总 253 期 SHANDONG FORESTRY SCIENCE AND TECHNOLOGY 2021.No.2文章编号：1002-2724(2021 )02-0100-08土壤呼吸影响因素及测定方法的研究进展张 萌!-2'3，卢 杰!'2'3* ，任毅华®收稿 H 期:2021-02-28基金项目：科技部国家野外科学研究观测站(生态系统)运行补助项目(2015-2020)作者简介：张萌(1997-)，女，在读硕士，主要从事森林生态学方TV 研究工作，E-mail : ******************通讯作者：卢杰(1973-)，男，教授，主要从事森林生态学的研究与教学工作，E-mail ： ***************(1.西藏农牧学院高原生态研究所，西藏林芝860000；2.西藏高原森林生态教育部重点实验室，西藏林芝860000；3.西藏林芝高山森林生态系统国家野外科学观测研究站，西藏林芝860000)摘要：在全球气候正在经历变暖的情况下，土壤呼吸作为碳输出的主要途径而受到广泛的关注，研究土壤呼吸不仅仅可O帮助人类面对全球气候变暖的问题，还会影响到人类未来的发展。

本文通过对土壤呼吸影响因素的相关文献的查阅、整理、归 纳，总结了影响土壤呼92因素，其中主要包括3个方T ：第一是生物因素，主要包括植被、根系、凋落物与土壤微生物等方T ,但主要是植物和土壤微生物状4 ；第二是非生物因素，例如温度，土壤湿度O 及土壤的理化特性；第三是其他因素，主要包括施 肥、森林采伐、耕作方式和火烧等。

综述了目前国内外土壤呼9方法，并且探讨了每种测量方法2原理、技术、 、缺点O。

土壤呼9测量的 方法便是动态气室系统，并且在需要可O 与微气象方法结合使用。

关键词：土壤呼9；影响因素；生物因素；非生物因素； 方法中图分类号：Q142.3文献标识码:AResearch Progress on Influencing Factors and Determination Methods of Soil Respiration ZHANG Meng 1%2'3，LU Jie^UREN Yihua 1%2%3(1. Institute of Tibet Plateau Ecology, Tibet Agriculture & Animal Husbandry University, Nyingchi Tibet 860000; 2. Key Laboratory of Forest Ecology in Tibet Plateau(Tibet Agriculture & Animal Husbandry University), Ministry of Education, Nyingchi Tibet 860000 ; 3. Linzhi National Forest Ecosystem Observation & Research Station of Tibet, Nyingchi Tibet 860000)Abstract ： As the global climate is experiencing warming, soil respiration, as the main way of carbon output, has attracted extensive attention. Studying soil respiration can not only help human beings to face the problem of global warming, but also affect the future development of human beings.In this paper, the factors affecting soil respiration were summarized by referring to, sorting out and summarizing the related literatures of soil respiration factors, which mainly included three aspects. The first is biological factors, mainly including vegetation, root system, litter and soil microorganisms, but mainly plants and soil microorganisms.Second, abiotic factors, such as temperature, soil moisture, and physical and chemical properties of the soil;The third is other factors, mainly including fertilization, deforestation, farming methods and burning.This paper summarizes the methods of soil respiration measurement at home and abroad, and discusses the principles, techniques, advantages, disadvantages and application scope of each method.The preferred method of soil respiration measurement is the dynamic chamber system and can be used in conjunction with the micrometeorological method when needed.Keywords ： soil respiration; influencing factors; biological factors; abiotic factors; assay method土壤作为陆地上最大的碳库，通过土壤呼吸的过程进行碳输出叫由环境变化引起的土壤呼吸强 度的微弱改变都有可能对生态系统碳平衡产生显 著的影响。

实验四细菌总数的测定——纯种分离一、目的1.掌握从环境（土壤和活性污泥等）微生物群体中获得纯种微生物的分离和培养技术。

2.掌握无菌操作技术。

二、材料和器皿1.扭力天平、取土样工具、涂布棒(接种棒)。

2.无菌三角瓶、试管、培养皿、移液管、玻璃珠。

3.无菌水。

4.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。

三、实验操作步骤1、取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。

先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。

盛土的容器应是无菌的。

将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。

土样取回后应尽快投入实验，同时取10-15g，称重后经105oC烘干8h，置于干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。

2、倒平板熔化已灭菌的上述4种培养基并冷却至45oC左右倒平板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。

3、编号取5支无菌空试管（15×150mm）依次编号为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。

4、分装无菌水按无菌操作用5mL移液管分别吸取4.5mL无菌水于编号的各无菌空试管中。

5.制备土壤稀释液称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液。

用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次、摇匀，此即为10-3浓度。

同样方法，依次稀释到10-7。

稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。

环境要求：琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。

代表性：取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨；液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。

减少误差：每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。

6、培养及计数培养条件：倒置于36±1℃温箱内培养48±2h计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。