实验六 蛋白质分析

实验六蛋白质等电点测定一、实验目的掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理；了解等电点的意义及其与分子聚沉能力的关系。

二、实验原理蛋白质同氨基酸一样，是两性电解质，在不同的pH 水溶液中解离后所带正、负电荷不同。

调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态出现，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的pH 值称为该蛋白质的等电点(pI)。

各种蛋白质具有特定的等电点，这时和它所含的氨基酸的种类和数量有关。

如蛋白质分子中含碱性氨基酸较多，其等电点偏碱。

例如从雄性鱼类成熟精子中提取的鱼精蛋白含精氨酸特多，其等电点为12.0～12.4。

如蛋白质分子中含酸性氨基酸较多，则其等电点偏酸。

例如胃蛋白酶含酸性氨基酸残基为37个，而碱性氨基酸残基仅含6个，其等电点为1.0左右。

含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质，其等电点大多为中性偏酸，约5.0左右。

蛋白质等电点多接近于pH7.0，略偏酸性的等电点也较多。

处于等电点的蛋白质表现电中性，所以在溶液中的稳定性很低，容易沉淀析出。

将酪蛋白溶液分置于连续不同的pH 环境中，通过观察混浊程度可测得酪蛋白的等电点。

三、实验器材1.仪器：试管和试管架、滴管、吸管(1和5mL)、容量瓶。

2.材料：蛋白质。

3.试剂：酪蛋白醋酸钠溶液、0.01mol/L 醋酸溶液、1.00mol/L 醋酸溶液、0.10mol/L 醋酸溶液、1.00mol/L 氢氧化钠溶液。

四、实验步骤取9支粗细相近的干燥试管，编好号后按表5-1的顺序准确地加入各种试剂。

加完后观察上述各管的混浊程度，静置约20min，再视其沉淀情况，以-，+，++，+++，++++符号表示沉淀的多少；根据观察的结果，指出哪一个pH是酪蛋白的等电点(混浊显著或静置后沉淀最多，上部溶液变得最清亮一管的pH 值，即为酪蛋白的等电点);该试管要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。

实验六蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离一、目的1．学习水解蛋白质的方式。

2．把握纸层析的大体技术。

3．学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方式。

二、原理1．蛋白质的水解蛋白质能够用酸、碱或酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶水解成最终产物氨基酸。

实验室中常利用酸解法水解蛋白质。

当在6 mo叭。

盐酸溶液中将蛋白质在110t加热大约20 h，肽键断裂，现在蛋白质完全分解为氨基酸。

酸法水解蛋白质的优势是在水解进程中不发生外消旋作用，所取得的氨基酸均为L一氨基酸。

大多数氨基酸在煮沸酸中是稳固的，但色氨酸那么完全被破坏。

丝氨酸和苏氨酸在酸解进程中或多或少地也有破坏。

色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质——腐黑质，因此，用酸法水解蛋白质取得的水解液为棕黑色的。

2．纸层析法分离氨基酸纸层析是以滤纸作为支持物的分派层析法。

它利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分派系数，经层析而达到分离的目的。

在必然条件下，一种物质在某溶剂系统中的分派系数是一个常数，假设以K表示分派系数层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。

滤纸纤维素与水有较强的亲和力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一样达滤纸重的22％左右（其中约有6％的水与纤维素结合成复合物），由于这部份水扩散作用降低形成固定相；而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形成流动相。

层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂持续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的分派系数在两相间进行分派。

随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的从头分派，同时溶质离开原点不断向前移动，溶质中各组分的分派系数不同，前进中显现了移动速度不同，通过一按时刻的层析，不同组分便实现了分离。

物质的移动速度以R f值表示：各类化合物在恒定条件下，层析后都有其必然的R f值，借此能够达到定性、辨别的目的。

实验六：生物信息学试验学习总结1使用SWISS-MODEL 进行蛋白质三维结构预测，PyMOL 查看分子结构1.1蛋白质三维结构预测－SWISS-MODEL1.1.1全自动建模以MAP kinase Pmk1 [Schizosaccharomyces pombe] （NP_595289.1）为target 序列，首先收缩模板序列，选择四个模板序列进行同源建模，并对得到的模型进行评估1.1.2比对模式建模模型评估：GMQE(全局模型质量评估)是一种质量评估，它结合了目标-模板对齐和模板搜索方法的属性。

由此产生的GMQE分数表示为0到1之间的数字，反映了用该校准和模板构建的模型的预期精度。

较高的数字表明更高的可靠性。

一旦建立了模型，在这个特定的情况下，GMQE(1)就会得到更新，同时考虑到获得的模型的q 平均值，从而提高质量评估的可靠性。

QMEANQMEAN平均数(Benkert等)是基于不同几何属性的复合得分函数，并提供了全局的(即:对于整个结构)和局部(即每个残余物)绝对质量的估计是基于一个单一模型的。

z分数(2)提供了对模型中观察到的结构特征的“本土程度”的估计，并指出该模型是否具有与实验结构相似的质量。

较高的q均值z分数表明模型结构与相似尺寸的实验结构之间的一致性较好。

得分在0-4.0或以下的是一个质量很低的模型，这一点也可以通过在分数旁边的“拇指向下”符号的变化来突出显示。

QMEAN由四个单独的术语组成。

全球q平均值质量分数的四个单独术语也列在上面。

在巴图的白色区域(数值接近于零)表明这一特性与实验结构中所观察到的相似。

实证值表明，该模型平均得分高于实验结构，负数表明该模型平均得分低于实验结构。

q均值z分数本身显示在顶部。

单独的z分数比较了Cbeta原子之间的相互作用势，所有的原子，溶解势和扭转角度的潜力。

“局部质量”图显示了模型的每一个剩余部分(在x轴上报告)，期望与本机结构(y轴)的相似性。

实验六 SDS-PAGE测定蛋白质分子量生物111 杨明轩 1102040128一、研究背景及目的对于那些生物体内含量高、易于分离结晶获得纯品的蛋白，可以通过测定氨基酸序列，借助各种氨基酸的分子量求出蛋白的分子量，并与质谱等手段相互结合，得到精确可信的分子量。

但对于那些含量少，不易分离的蛋白，无法实现结晶，就必须借助其他手段测定其分子量。

要找到能够测定分子量的实验手段，首先要考虑那些能够将不同分子按照其各自的分子量分离的技术。

在众多的技术当中，密度梯度离心、层析、电泳都与物质的分子量有关。

其中，超速离心机造价高，使用过滤层析色谱测分子量要做标准曲线，柱长要求高，且这些方法不够准确。

因此，电泳技术成为了实现分子量测定这一目的的最佳选择。

但是，在活性电泳中，影响蛋白前迁移率的因素有蛋白质的电荷性质、分子大小和形状。

要测定分子量，就要消除电荷、分子形状对蛋白迁移率的影响，即使得各种蛋白的电荷、形状不存在显著差异。

对于电荷，使各分子不带电违背电泳的基本原理，而使各分子带点完全相同是无法实现的，因此考虑使其带上大量电荷，从而让分子之间的电荷差异可以忽略。

在活性电泳中，改变样品的带电情况依靠的是缓冲液pH的变化，显然不能够使分子大量带电，这就表明必须向电泳体系中引入其他物质，与蛋白分子定量等量结合，且不改变分子量差异造成泳动差异。

对于分子形状，考虑到功能性蛋白大多是球形粒子，要保持形状不变，就要实现对蛋白的包裹性结合。

而蛋白表面的电荷分布情况千差万别，依靠电荷性质无法结合形成稳定的复合物。

考虑到蛋白质中含有大量的疏水氨基酸，可以通过疏水作用结合，这就要造成蛋白变性，是疏水基团充分暴露出来，分子不能在维持球型而变成棒状，因此，所选择的物质还需要能够维持复合物形状的统一。

基于以上考虑，科学家选择了双亲性物质，既能通过疏水作用与蛋白定量结合成牢固的复合物，又能借助亲水性在溶液中良好分散。

新技术的发明常以原有技术作为基础。

实验六、多序列比对及进化树的构建（3学时）目的：1、了解蛋白质序列模式二级数据库的结构、内容及基本使用方法。

2、了解多序列比对工具ClustalW/X的使用方法并学习对比对结果进行编辑与分析。

3、学习如何构建系统进化树。

内容：一、蛋白质功能位点数据库PROSITE、蛋白质序列指纹图谱数据库Prints的内容、结构及使用。

1、熟悉PROSITE数据库的数据结构。

从生物学院-国家生物学理科基地-课件下载处下载最新的课程相关内容.rar,解包后打开实验数据-实验二中的CBI EMBL format_P02753，找到Database cross-references项中的PROSITE，点击PS00213的链接。

则显示PROSITE数据库中Lipocalin 模式（AC号为PS00213）的记录信息。

利用网上的PROSITE user manual（/prosite/prosuser.html#convent36）理解每一个字段及内容的含义。

回答问题：A、L ipocalin pattern的长度是多少？B、请解释/TAXO-RANGE=??EP?的含义。

C、分别解释NR字段中三行数据的含义。

D、Q28133蛋白（ALL2_BOVIN）是否符合此pattern？E、Is this a good pattern? Why?2、PROSITE数据库的检索。

ExPaSy(/prosite/) 及SRS（，）都提供了对PROSITE数据库的检索服务。

可以通过AC、ID、description、author等信息进行数据库检索，你还可以通过各序列数据库中的交叉引用链接（cross-references or xref等）找到相应的PROSITE pattern, profile or rules 信息。

ScanProsite工具（/tools/scanprosite/）则可以分析查询序列中可能包含的序列模式或序列谱，以作为进一步鉴定的基础。

实验紫外吸收法测定蛋白质含量一、实验目的1．掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。

2．学习紫外分光光度计的仪器原理及使用方法。

二、实验意义牛奶是大众化的奶制品，蛋白质含量较高，近年来中国乳制品出现了很多的食品安全问题。

针对这些问题，我们小组使用紫外分光光度计来测定常见牛奶品牌中蛋白质含量。

紫外分光光度计操作简单，有较好的灵敏度，可用于乳制品生产线上质量检测。

三、实验原理由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280纳米波长处。

在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度值（O.D.280，或吸收值）与其浓度呈正比关系，可作定量测定。

该法迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。

因此，已在蛋白质和酶的生化制备中广泛采用。

本法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。

故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。

例如，在制备酶的过程中，层析柱的流出液内有时混杂有核酸，应予以校正，核酸强烈吸收波长为280纳米的紫外光，它对260纳米紫外光的吸收更强。

但是，蛋白质恰恰相反，280纳米的紫外吸收值大于260纳米的紫外吸收值。

利用它们的这些性质，通过计算可以适当校正核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。

但是，因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定结果还存在着一定的误差。

四、实验试剂和器材（一）、试剂：1.牛血清清蛋白溶液：购买市面上售卖的经过校正的结晶牛血清清蛋白，配制成浓度为1mg/mL的溶液。

氯化钠溶液。

2.待测蛋白质溶液：10月份沃尔玛超市购买伊利纯牛奶3盒，该货架有这种产品70盒左右。

在正式实验开始前的周末去沃尔玛超市购买3盒伊利纯牛奶，规格250mL（牛奶保存环境为温度20摄氏度左右的室内，货架对面为酸奶冷柜）。

记录购买时间，牛奶在货架所放位置（靠近地面，货架中层，货架上层）。

第一部分 基础生化实验实验一 氨基酸及蛋白质的性质【实验目的】1. 加深理解所学有关的蛋白质性质的理论知识2. 掌握氨基酸和蛋白质常用的定性、定量分析的方法及原理一、蛋白质呈色反应蛋白质的呈色反应是指蛋白质所含的某些氨基酸及其特殊结构，在一定条件下可与某些试剂发生了生成有色的物质的反应。

不同蛋白质分子所含的氨基酸残基也是不完全相同，因此所发生的成色反应也不完全一样。

另外呈色反应并不是蛋白质的专一反应，某些非蛋白质类物质（含有-CS-NH 、-CH 2-NH 2、-CRH-NH 2、-CHOH-CH 2NH 2等基团的物质）也能发生类似的颜色反应。

因此，不能仅仅根据呈色反应的结果为阳性就来判断被测物质一定是蛋白质。

注意：本次实验为定性实验，试剂的量取用滴管完成。

（一）双缩脲反应【实验原理】当尿素经加热至180℃左右时，两分子尿素脱去一分子氨，进而缩合成一分子双缩脲。

其在碱性条件下双缩脲与铜离子结合成红紫色络合物，此反应称为双缩脲反应。

其反应过程如下：C OH 2NH 2N+COH 2N H 2NH 22O O+NH多肽及蛋白质分子结构中均含有许多肽键，其结构与双缩脲分子中的亚酰胺键相同。

因此，在碱性条件下与铜离子也能呈现出类似于双缩脲的呈色反应。

其反应过程如下：【试剂】1. 蛋白质溶液（鸡蛋清用蒸馏水稀释10倍，通过2-3层沙布滤去不容物）2. 0.1%甘氨酸溶液3.0.01%精氨酸溶液4.10%NaOH溶液5.1%CuSO4溶液6.尿素结晶【实验操作】1. 双缩脲的制备取少许尿素结晶 (约火柴头大小)放入干燥的试管中，微火加热至尿素熔解至硬化，刚硬化时立即停止加热，此时双缩脲即已形成。

冷却后加10%氢氧化钠溶液约1ml、并震荡，再加入1%硫酸铜溶液2滴，再震荡，观察颜色的变化。

注意：a.在操作过程中试管不能冲向其他人以防止烫伤；b.控制加热的时间既不能过长也不能过短；c.加热时火不能太大，防止碳化。