人RAG2基因5′近端染色质结构定量差异分析及可接近区域转录调控机制研究
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人载脂蛋白A-I表达上调剂的发现与活性研究杜郁;贾晓健;王丽;王丽非;姜华军;杨帆;司书毅;杨媛;洪斌【摘要】Objective To find potential small molecules that increase endogenous synthesis of apolipoprotein A-I (ApoA-I), and to identify its ability of increasing ApoA-I at expression and functional levels. <br> Methods Compounds screening was performed with established screening model based on the ApoP-Luc HepG2 cell line. Dose-response relationship of the active compound was achieved in promoter activity. The expression of ApoA-I in HepG2 cells regulated by the compound was detected by real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), Western blot, ELISA and flow cytometry analysis. The cholesterol efflux assay was applied to investigate the effect of promoted ApoA-I on mediating lipid transfer in RAW 264.7 cells. <br> Results In the present study, compound 5238B-69 was found using the screening model. 5238B-69 increased ApoA-I promoter activity in a dose-dependent manner with EC50 of 0.01 µg/ml, and maximal activity of 408%at 0.30μg/ml. 5238B-69 significantly increased ApoA-I mRNA level and protein level in HepG2 cells. ELISA and flow cytometry analysis showed 5238B-69 could increase ApoA-I protein by 48%and 21.4%compared with control in the media and cells, respectively. The functional efflux assay further illustrated the role of ApoA-I induced by 5238B-69 with RAW 264.7 cells. <br> Conclusion A potential small molecular upregulator was obtained, which could significantly increase the expression of human ApoA-I in liver cells andpromote cholesterol efflux from mice macrophages.%目的筛选上调人载脂蛋白 A-I(ApoA-I)基因表达的新型活性化合物,并在表达和功能水平对其作用进行研究。
淫羊藿甙抑制肿瘤细胞端粒酶活性及其调节机制的研究①张 玲 王 芸 毛海婷 温培娥 崔树龄 李晓冰 (山东省医学科学院基础医学研究所,济南250062) 中国图书分类号 R73015 文献标识码 A 文章编号 10002484X(2002)0320191205摘 要 目的:探讨中药单体淫羊藿甙(IC A)抑制肿瘤H L260细胞端粒酶活性及作用机制。
方法:采用MTT法,NBT染色法,TRAP2PCR,RT2PCR法和流式细胞术。
结果:IC A显著抑制H L260细胞端粒酶活性,且端粒酶活性下降与细胞表面粒细胞分化抗原C D11b表达率呈负相关;诱导H L260细胞向粒细胞方向分化;改变H L260细胞周期各时相的分布,表现为G0/G1期细胞逐渐增多,S期细胞逐渐减少;上调分化相关基因p21、下调增殖相关基因c2myc mRNA和蛋白表达水平。
结论:阐明了IC A显著抑制H L260细胞端粒酶活性,并从基因2蛋白2细胞效应水平揭示了其调节端粒酶活性的可能机制。
关键词 淫羊藿甙 端粒酶活性 细胞分化 细胞周期 基因表达Study on the inhibition of telomerase activity and regulated mechanism in human cancer cell by IcarrinZH ANG Ling,WANG Yun,MAO Hai2Ting et al1Institute o f Bacic Medicine,Shandong Academy o f Medical Sciences,Ji2 nan250062Abstract Objective:T o study inhibited tecomerase activity of H L260cells in human cancer cell by Icarrin(IC A)and its mechanism1Methods:MTT assay,NBT assay,TRAP2PCR,RT2PCR assay,Flow Cytometry1R esults:IC A inhibited telomerase activity in H L260 cells significantly1It was negative correlation between telomerase activity and the expression ratio of C D11b antigen in H L260cells1It can in2 duced H L260cells to differentiate into mature granulocytes1It can changed cell cycle distribution of H L260cells,which was reflected by the ac2 cumulation of the vast majority of cells in the G0/G1phase and the loss of cells in the S phase1It can downregulated cell proliferation related gene c2myc;upregulated p21gene protein and mRNA expression1Conclusion:This study proved mechanism of IC A on inhibited telomerase ac2 tivity from gene2protein2effect of cell level in H L260cells1K ey w ords IC A T elomerase activity Cell differentiation Cell cycle G ene expression 端粒酶的发现在肿瘤的发生机制、诊断治疗及预后评价中具有重要意义。
㊃专题㊃基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目O R M D L 3对哮喘血管重塑的影响及机制(81500020)通信作者:李桂梅,E m a i l :l i gu i m e i 2013@126.c o m 小于胎龄儿的认识和管理孙 妍,刘 帆,周 赟,周欣辉,李桂梅(山东大学附属省立医院儿科,山东济南250021) 摘 要:小于胎龄儿(s m a l l f o r g e s t a t i o n a l a ge i nf a n t ,S G A )围生期死亡率以及出生后至成人期发病率均明显高于适于胎龄儿(a p p r o p r i a t e f o rg e s t a t i o n a l a g e ,A G A )㊂S G A 病因具有多样性,混杂了生理性(父母身材矮小)和病理性(母体㊁胎儿和胎盘)因素㊂胎儿本身的结构性或染色体异常是S G A 的重要病因,5%~20%的S G A 是由基因异常引起㊂小于胎龄儿一旦出生,临床医师需要警惕后续的急性并发症和慢性并发症㊂急性并发症主要有围生期窒息㊁红细胞增多㊁低血糖㊁宫内感染㊁低体温㊁黄疸及喂养困难㊂S G A 长期随访可发现多系统疾病风险,包括生长受限㊁心血管疾病㊁肥胖㊁胰岛素抵抗和2型糖尿病㊁胃肠道疾病㊁神经发育和认知障碍等,对于性发育也有一定影响㊂长期并发症可能导致不良的成人结局㊂生长激素治疗改善身高安全有效,同时改善身体组分和减少代谢并发症㊂因此,科学管理S G A 需要基于中国S G A 病因及生活最佳追赶生长模式的真实世界研究,总结不同类型S G A 的最佳成长模式,这将是S G A 管理的重要研究方向㊂关键词:婴儿,小于胎龄;生长障碍;代谢疾病;生长激素中图分类号:R 723.19 文献标志码:A 文章编号:1004-583X (2019)10-0869-06d o i :10.3969/j.i s s n .1004-583X.2019.10.001D i a g n o s i s a n dm a n a g e m e n t o f s m a l l f o r g e s t a t i o n a l a ge i nf a n t s S u nY a n ,L i uF a n ,Z h o uY u n ,Z h o uX i n h u i ,L iG u i m e iD e p a r t m e n t o f P e d i a t r i c s ,S h a n d o n g P r o v i n c i a lH o s p i t a lA f fi l i a t e d t o S h a n d o n g U n i v e r s i t y ,J i n a n 250021,C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :L iG u i m e i ,E m a i l :l i gu i m e i 2013@126.c o m A B S T R A C T :T h e p e r i n a t a lm o r t a l i t y a n d m o r b i d i t y o f s m a l l f o r g e s t a t i o n a l a g e i n f a n t (S G A )w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a n t h o s eo f a p p r o p r i a t e f o r g e s t a t i o n a l a g e (A G A ).T h ee t i o l o g y ofS G Ai sd i v e r s e ,w h i c hi sa m i x t u r eo f p h y s i o l o g i c a l (s h o r ts t a t u r eo f p a r e n t s )a n d p a t h o l o gi c a l (m a t e r n a l ,f e t a la n d p l a c e n t a l )f a c t o r s .T h es t r u c t u r a lo r c h r o m o s o m a l a b n o r m a l i t y o f f e t u s i s a n i m p o r t a n t c a u s eo fS G A ,5%-20%o fS G Ai s c a u s e db yg e n e t i ca b n o r m a l i t y.O n c e a S G A i n f a n t i s b o r n ,c l i n i c i a n s s h o u l d p a y a t t e n t i o n t o t h e s u b s e q u e n t a c u t e a n d c h r o n i c c o m p l i c a t i o n s .T h em a i n a c u t ec o m p l i c a t i o n ss h o wa s p e r i n a t a l a s p h y x i a ,e r y t h r o c y t o s i s ,h y p o g l y c e m i a ,i n t r a u t e r i n e i n f e c t i o n ,h y po t h e r m i a ,j a u n d i c ea n df e e d i n g d i f f i c u l t i e s .M u l t i p l es y s t e m d i s e a s e s ,s u c h a s g r o w t hr e s t r i c t i o n ,m e t a b o l i cd i s e a s e s ,e v e n p u b e r t y a b n o r m a l d e v e l o p m e n t c o u l db e t r a c e d i nt h e l o n g -t e r mf o l l o w -u p .L o n g -t e r mc o m p l i c a t i o n sc a n l e a dt o p o o r o u t c o m e s .G r o w t hh o r m o n et r e a t m e n t i ss a f ea n de f f e c t i v et oi m p r o v eh e i g h t ,a n dr e d u c e m e t a b o l i cc o m pl i c a t i o n s .F u r t h e r m o r e ,t h em a n a g e m e n to fS G A n e e d st os u mm a r i z et h eo p i t i c a l g r o w t h m o d e l i nd i f f e r e n t t y p e s ,e s p e c i a l l l yf r o m C h i n e s e r e a lw o r l d s t u d y ,w h i c hw i l l b e a n i m p o r t a n t d i r e c t i o no f S G A m a n a ge m e n t .K E Y W O R D S :i nf a n t ,s m a l l f o rg e s t a t i o n a l a g e ;g r o w t hd i s o r d e r s ;m e t a b o l i c d i s e a s e ;gr o w t hh o r m o ne 孙妍,山东省立医院副主任医师,医学博士,硕士生导师㊂澳大利亚悉尼大学联合培养博士,哈佛大学附属波士顿儿童医院高级访问学者㊂中华医学会儿科学分会内分泌遗传代谢学组委员,中华医学会儿科学分会科学研究委员会委员,中国医师协会青春期医学专业委员会青年委员,中国医师协会医学遗传医师分会儿童遗传病专业委员会委员,中国医师协会医学遗传医师分会临床生化遗传专业委员会委员,山东省医学会儿科内分泌学组组员,山东省青春期医学专业委员会委员兼秘书㊂熟练诊治儿科内分泌遗传代谢性疾病,熟悉遗传病及内分泌综合征的分子诊断,具有遗传病咨询经验㊂参与副主编著作1部㊁参编著作1部㊂发明国家专利2项㊂主持国家自然基金青年项目㊁山东省自然基金青年项目各1项,参加山东省科研项目2项㊂获山东省科技进步一等奖1项(第八位)㊂发表论文20余篇,第一作者发表S C I 7篇㊂小于胎龄儿(s m a l l f o r g e s t a t i o n a l a g e i n f a n t ,S G A )发病率约为5%~10%,加强对其认识和管理有重要意义㊂2007年,国际儿科内分泌学会(I S P E )和生长激素研究学会(G H R S )将S G A 定义为出生体重和(或)出生身长低于同胎龄2个标准差以上[1]㊂㊃968㊃‘临床荟萃“ 2019年10月20日第34卷第10期 C l i n i c a l F o c u s ,O c t o b e r 20,2019,V o l 34,N o .10Copyright ©博看网. All Rights Reserved.2016年WHO定义S G A为婴儿出生体重低于同胎龄婴儿体重的第10百分位㊂落后2个标准差的第3百分位概念提高了S G A诊断的特异性而降低了敏感性㊂由于新生儿身长测量的准确性问题,使得在临床实际应用中,利用出生身长远不如出生体重普遍㊂S G A有早产㊁足月㊁过期产小于胎龄儿之分,更具挑战的是早产儿S G A的定义问题㊂目前建议早产儿S G A的诊断应采用胎儿生长标准,而不能用出生体重标准㊂I S P E和G H R S建议S G A不应作为宫内生长受限(i n t r a u t e r i n e g r o w t h r e t a r d a t i o n, I U G R)的同义词㊂I U G R指子宫内胎儿生长迟缓,与出生体重无关㊂而S G A基于横截面评估,不是单个轨迹㊂S G A婴儿不一定经历I U G R,而I U G R不可避免地会出生S G A婴儿㊂从整体上来看,S G A围生期死亡率以及出生后至成人期发病率均明显高于适于胎龄儿(a p p r o p r i a t e f o r g e s t a t i o n a l a g e, A G A),尤其是出生体重在第3百分位以下者㊂随着对S G A健康影响的认识日渐深入,儿科内分泌医生越来越重视S G A的防治与管理㊂母体原因比较复杂,包括年龄㊁体重㊁身高,分娩间隔㊁既往异常分娩史㊁是否应用辅助生殖技术,炎症性肠病㊁癫痫㊁抑郁或受虐等疾病史,抽烟㊁酒精及可卡因等药物暴露或滥用,母亲教育程度等社会经济因素,以及缺氧等环境因素均可导致S G A㊂1S G A的病因S G A分为匀称型和非匀称型㊂根据重量指数[2] =初生体重(g)ˑ100/身长(c m)3及身长与头围的比例分为两型:重量指数>2.00(胎龄ɤ37周)或2.20(胎龄>37周);身长与头围之比>1.36,称为匀称型㊂重量指数<2.00(胎龄ɤ37周)或2.20(胎龄>37周);身长与头围之比<1.36者,为非匀称型㊂匀称型S G A通常由染色体异常㊁遗传代谢性疾病㊁先天性感染所致,反映早孕期胎儿问题㊂通常分为内因性和外因性,内因性主要包括先天性遗传因素㊁病毒或弓形体感染㊁中毒或辐射,日后常有脑神经发育障碍;外因性常因缺乏叶酸㊁氨基酸㊁微量元素或有害物质影响,胎儿身长㊁体重㊁头围相称,均较小㊂非匀称型S G A通常因孕母血管性疾病致胎儿生长发育必需物质(如氧气㊁营养)供给缺乏,反映胎盘问题,由于损伤发生在妊娠晚期,故各器官细胞数目正常,细胞体积缩小,损伤为可逆性,特点是头围与孕期相符而体重较低㊂S G A病因具有多样性,混杂了生理性(父母身材矮小)和病理性(母体㊁胎儿和胎盘)因素㊂见图1[3]㊂图1小于胎龄儿病因1.1母体原因母体原因比较复杂,包括年龄㊁体重㊁身高,分娩间隔㊁既往异常分娩史㊁是否应用辅助生殖技术,炎症性肠病㊁癫痫㊁抑郁或受虐等疾病史,抽烟㊁酒精及可卡因等药物暴露或滥用,母亲教育程度等社会经济因素,以及缺氧等环境因素均可导致S G A㊂初产妇发生S G A的风险较经产妇高㊂身高矮小㊁体重指数(B M I)<20的孕母S G A发生风险高㊂有研究发现,孕妇本身为出生低体重,其子女发生S G A增加㊂孕母发生妊娠剧吐及孕期体重增加不足也与发生S G A有相关性㊂经济贫困人群,S G A患㊃078㊃‘临床荟萃“2019年10月20日第34卷第10期 C l i n i c a l F o c u s,O c t o b e r20,2019,V o l34,N o.10Copyright©博看网. All Rights Reserved.病率增加㊂孕母年龄35岁以上可能是S G A的高危因素㊂随着生育年龄的延迟,妊娠期并发症(如妊娠高血压综合征)的发病率逐年增高,胎儿正常的生长发育面临着新挑战㊂母亲的基础疾病包括慢性高血压㊁先天性心脏病㊁哮喘㊁慢性肾病㊁克罗恩病㊁溃疡性结肠炎和自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮㊁抗磷脂综合征等)等对胎儿发育有影响,可引起S G A㊂妊娠期糖尿病在肥胖妇女中较常见,高糖会导致巨大儿,但高糖也可损伤胎盘蜕膜血管内皮细胞,引起胎盘血流灌注不足,导致S G A㊂孕母的种族影响的评估比较复杂,目前已有大部分研究发现不同种族人群中胎儿出生体重不同,美国黑色人种㊁印度和亚洲妇女发生S G A的概率较高㊂目前,更多学者建议S G A的参考标准优先采用本国参考值㊂也有学者提出,S G A的定义还需要根据母亲身高体重㊁胎次以及种族进行个性化考量,这一提议尚未得到普遍认可㊂1.2胎儿原因胎儿原因主要包括遗传疾病和先天性感染㊁多胎妊娠㊂胎儿本身的结构性或染色体异常是S G A的重要病因,5%~20%的S G A是由基因异常引起[4]㊂与S G A相关的生长激素(G H)-胰岛素样生长因子(I G F)轴异常性疾病包括[3]:G H缺乏㊁L a r o n综合征㊁免疫缺陷伴G H不敏感㊁X连锁联合免疫缺陷㊁S HO R T综合征㊁I G F-1缺乏/抵抗㊁P A P P-A2缺乏㊁不耐酸亚基(A L S)缺乏㊁软骨发育不良㊁软骨发育低下㊁短指畸形㊁N o o n a n综合征㊁神经纤维瘤1型等㊂功能性细胞程序异常的S G A包括:头围正常/巨头性疾病如F l o a t i n g H a r b o r综合征㊁3M综合征㊁MU L I B R E Y侏儒;小头畸形性包括C o r n e l i ad eL a n g e综合征1-5㊁MO P D1型/Ⅱ型㊁M e i e r-G o r l i n综合征1-5㊁S e c k e l综合征1-8㊂D N A 修复缺陷性疾病包括B l o o m综合征㊁F a n c o n i贫血㊁N i j m e g e nb r e a k a g e综合征㊁L I G4综合征㊁X R C C4综合征等㊂与S G A相关的甲基化异常性疾病包括: S i l v e rR u s s e l l综合征㊁T e m p l e综合征㊁I MA G e综合征㊁20号染色体母源单亲二倍体等㊂此外,在我们31例S G A患儿的基因检测研究中还报道了如下疾病:E h l e r-D a n l o s综合征㊁猫叫综合征㊁15q26缺失综合征㊁甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症㊁P r a d e r-W i l l i综合征㊁远端关节弯曲㊁原发性肾上腺皮质功能不全等[5-6]㊂宫内感染引起5%~10%的S G A㊂感染致S G A 的机制与细胞损伤和溶解相关,病毒性感染主要包括巨细胞病毒㊁水痘病毒等;寄生虫感染则涉及弓形虫病等;细菌性感染的病例较少;梅毒㊁支原体和衣原体感染均有导致S G A可能㊂多胎妊娠有更高S G A风险,其中双胎S G A风险是单胎妊娠的5~10倍,25%的双胎中存在S G A㊂1.3胎盘原因胎盘是一个多功能的器官,任何一项功能的损伤或缺陷都可能影响胎儿生长发育,从而导致S G A[7]㊂约有3%的新生儿会因胎盘原因产生S G A㊂胎盘损伤造成的灌注不足㊁营养物质运输缺陷或气体交换异常是S G A较常见的病理机制㊂因此,胎盘疾病如胎盘梗死㊁血管瘤㊁慢性绒毛膜炎等可通过限制子宫胎盘血流而引起S G A㊂此外,胎盘发育过程中必需的生长因子和激素异常影响胎盘绒毛成熟和血管发育,也会导致S G A发生㊂1.4其他病因最新的丹麦研究发现,父亲的出生体重与新生儿的出生体重有关,父亲出生为S G A,其子女发生S G A的风险增加㊂胎儿出生体重也与父亲身高呈正相关趋势㊂污染作为全球性问题,包括空气环境污染如二氧化硫㊁细微粒物质(重金属和有毒有机污染物如芳香烃等)㊁固体燃料暴露,均与S G A相关;接触环境噪声㊁电磁场也可增加S G A发生率㊂此外,纳入13项队列研究7个国家共28285人的荟萃分析发现,维生素D缺乏与S G A风险增加有关[8]㊂2S G A的并发症S G A患儿一旦出生,后续的急性期并发症和慢性并发症是需要临床医师警惕的㊂急性并发症主要有围生期窒息㊁红细胞增多㊁低血糖㊁宫内感染㊁低体温㊁黄疸及喂养困难㊂S G A胎儿和婴儿有较高的围产儿和新生儿死亡率,最常见的死亡原因是严重胎盘功能不全和慢性缺氧㊂红细胞增多伴有黄疸风险增加㊂早产新生儿在出生后第一周有低血糖风险,必要时静脉补充葡萄糖㊂低血糖的发生是多因素的,包括糖原储备减少,糖异生限制,酮生成限制和能量需求增加(如围产期窒息㊁脓毒症和体温过低等)㊂血液优先分布到重要器官,子宫内的肠道灌注减少,喂养不耐受和坏死性小肠结肠炎临床可见㊂对S G A患儿进行长期随访,发现有多系统疾病风险,包括生长受限㊁心血管疾病㊁肥胖㊁胰岛素抵抗和2型糖尿病㊁胃肠道疾病㊁神经发育和认知障碍等,对于性发育也有一定影响㊂长期并发症可能导致不良的成人结局㊂2.1生长受限国际共识将追赶性生长定义为生长速度(c m/年)大于同年龄同性别儿童的中位数,或者当患儿的身长(高)超过了同年龄同性别儿童的第3百分位或者-2个标准差时可以认为已经达到了追赶性生长㊂约87%S G A患儿生后第1个月开始出现追赶生长,6个月内比较明显,多在2年内完成㊂㊃178㊃‘临床荟萃“2019年10月20日第34卷第10期 C l i n i c a l F o c u s,O c t o b e r20,2019,V o l34,N o.10Copyright©博看网. All Rights Reserved.早产S G A患儿的追赶生长会耗费更长的时间㊂15%的S G A儿童2岁时身高低于-2S D S,直至青春期和成人仍无法完成生长追赶㊂因此,3岁孩子身高低于-2个标准差的S G A儿童需要到内分泌儿科专家处就诊㊂无法实现身材追赶的原因并不明确㊂妊娠晚期发育迟缓(非对称型S G A)似乎有相对较好的追赶性生长㊂G H-I G F轴异常可能是产前和产后追赶性增长缺乏的原因㊂近60%的S G A儿童24小时内自发G H分泌减少,或G H激发试验具有较低峰值,且血清I G F-1和I G F B P-3较健康对照组更低㊂2.2胰岛素抵抗1岁内体重追赶生长过快(标准差分数>0.67)的S G A患儿具有较高的空腹胰岛素水平和胰岛素抵抗指数水平;S G A患儿出生时的低胰岛素水平和高胰岛素敏感性在3岁时转化为胰岛素抵抗状态也与追赶生长有关;自发追赶生长的S G A患儿4岁时胰岛素抵抗水平高于A G A对照儿童㊂究其原因,S G A患儿中长链脂酰辅酶A合成酶(a c y l-c o e n z y m eA s y n t h e t a s e1,A C S L1)对脂质合成㊁脂肪活化㊁运输和降解有重要作用,在成熟脂肪细胞中过度表达,其上调促进了快速追赶,同时最终增加了酯化脂肪酸的释放,导致胰岛素抵抗;以及A C S L1驱动甘油三酯的生物合成可加快肥胖从而导致代谢紊乱㊂此外,S G A患儿与A G A相比,营养改善后胰岛素增加I G F1合成,I G F1水平升高提示I G F1抵抗[9]㊂I G F1及其受体I G F1R在分娩S G A 母亲的胎盘中增加;胎盘I G F1R㊁A k t和m T O R (I G F1受体下游关键信号分子)在早产S G A的激活已被报道㊂2.3心血管风险及肥胖㊁2型糖尿病等代谢性疾病越来越多的证据表明子宫内环境和生长在生命早期会影响慢性非传染性疾病的发展,如心血管疾病㊁肥胖和成年2型糖尿病㊂S G A患儿在生命的最初3个月迅速实现快速追赶㊁体重增加最多的个体,心血管和代谢风险状况最严重㊂S G A患儿出生后的早期追赶生长(而不是S G A本身)被认为是心血管疾病的危险因素㊂胰岛素抵抗与血管反应性改变㊁肾素-血管紧张素-醛固酮系统以及交感神经系统的功能改变有关㊂产前生长受限导致产前循环适应并改变心脏和血管树的发育[10],低出生体重有导致成人血压升高的趋势㊂S G A成人收缩压和舒张压升高㊂早产S G A患儿收缩压以及舒张压水平较足月S G A 增高㊂S G A患儿代谢病相关风险增加㊂一些研究发现,S G A婴儿早期产后脂肪积累增加,I G F1升高是其原因之一㊂脂蛋白脂肪酶(l i p o p r t e i n l i p a s e,L P L)介导的超低密度脂蛋白脂解(v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s,V L D L)和甘油三酯(t r i g l y c e r i d e,T G)可能是皮下脂肪组织快速生长的主要机制[11-12]㊂S G A患儿较同年龄㊁性别和相似B M I的A G A,肥胖比率增加㊂S G A增加动脉粥样硬化的风险[13]㊂非酒精性脂肪性肝病是S G A青春期前儿童的一个新问题,其出生后体重迅速增加,胰岛素抵抗起着关键作用㊂在完成追赶性增长之后㊁青春期之前,S G A女孩出现中心性肥胖㊁高胰岛素血症㊁低脂联素血症㊁高瘦素血症㊁血脂异常;性激素结合球蛋白水平降低㊁硫酸脱氢表雄酮水平升高;骨成熟加速[14]㊂葡萄糖配置指数(胰岛素反应第一阶段和HOMA指数的比值)在S G A患儿较A G A低,提示胰岛素敏感性降低后的不完全β细胞补偿[15]㊂这种低胰岛素敏感性和代偿性胰岛素分泌的结合可能是导致2型糖尿病的早期途径㊂2.4神经系统影响中晚期S G A是脑瘫的既定危险因素[16]㊂大多数研究中,S G A孩子的智商在正常范围,但平均低于对照儿童㊂S G A出生的男孩,智力落后的最重要预测因素是缺乏足够的追赶性增长㊂长期的神经发育后遗症包括智商较低㊁学习困难等行为问题㊂宫内环境欠佳增加发育中胎儿的压力,导致糖皮质激素增加,可能对发育中的大脑造成有害影响的水平㊂且认知障碍与低出生体重㊁低身长及小头围独立相关㊂G H治疗能促进头部生长并能改善这些婴儿的智商㊂也有相反研究表明,S G A状态与神经发育不良无关;而在校正包括脑瘫在内的协变量后,2岁时体重<10%的S G A儿童平均精神运动发育指数低于体重超过10%者,在极低出生体重儿中,出生后的生长过程而不是出生时体重决定了神经发育结果[17]㊂2.5其他系统影响尽管现有研究存在局限性,大多数人认为S G A儿童青春期始于正常年龄,但相对A G A儿童更早,初潮年龄较A G A提前㊂S G A组和A G A组大多数儿童(男80%v s77%,女76%v s 78%)在正常年龄(男10.5~14岁,女9.5~13岁)达到青春期,青春期持续时间相似,初潮发生在正常年龄段,但S G A女孩明显提前㊂尽管整个青春期的生长情况相似,但生长模式却有显著差异:A G A组整个青春期骨延长和成熟的稳定进展,S G A组从青春期开始生长和骨成熟速度加快,在2~3期达到峰值,随后生长速度减慢,骨骺融合提前,故S G A组最终身高有所降低[18]㊂S G A儿童比A G A儿童更容易发生性早熟,青春期发育和初潮的发生更早,青春期进展更快㊂这不仅与出生体重㊁胎龄㊁肥胖有关,而且还可能与儿童早期体重快速增长对青春期的影响㊃278㊃‘临床荟萃“2019年10月20日第34卷第10期 C l i n i c a l F o c u s,O c t o b e r20,2019,V o l34,N o.10Copyright©博看网. All Rights Reserved.有关:儿童体重过度增长可导致中枢性肥胖㊁胰岛素敏感性降低,且I G F1水平升高,从而导致性早熟[19]㊂此外,多囊卵巢综合征在S G A女性中更为普遍,且有追赶性成长[20]㊂3S G A的防治降低S G A的发生,避免由此引起的不良妊娠结局是目前的首要任务㊂孕期检查中,需加强产前对孕妇的监测和保健,早期识别高危孕妇,改善营养,纠正不良生活习惯,减少S G A的发生㊂当孕期发现S G A,应给予及时治疗,改善预后㊂首先左侧卧位休息,改善子宫血流以增加胎盘绒毛间隙的血供,必要时使用肝素㊁硝酸甘油等㊂对于临床治疗效果欠佳者应加强胎儿监护,适时终止妊娠,治疗过程中改善妊娠结局需要产科和儿科的共同协作来完成㊂早诊断是防治S G A的根本措施㊂对于S G A的急性和慢性并发症,则需要早关注,早预防㊂3.1 G H治疗I S P E和G H R S建议2岁以下S G A 儿童身高低于-2.5个标准差或4岁以下S G A儿童身高低于-2个标准差可接受r h G H治疗[1]㊂针对S G A追赶生长的时间窗,拉丁美洲专家共识建议在1岁内每3个月进行1次随访,1~2岁每6个月进行1次随访,每次测量身长㊁体重㊁头围[21]㊂对于没有完成追赶生长导致矮小的S G A,美国食品药品监督管理局建议最早可从2岁开始G H治疗,欧洲建议从4岁开始G H治疗㊂出生为S G A的矮身材患儿接受G H治疗,可使成人身高平均增加1.25个标准差㊂G H治疗在成人也被证实改善身高安全有效,同时改善身体组分和减少代谢并发症㊂G H治疗期间,收缩压和舒张压降低,体脂含量减少,胰岛素敏感性降低和补偿性胰岛素分泌增加,总胆固醇㊁低密度脂蛋白降低;而G H治疗6.5年后,治疗组仅有收缩压和舒张压较未治疗组降低;脂肪组织成分㊁胰岛素分泌及敏感性㊁血脂变化均无明显差异㊂需要警惕的是,某些S G A中的特殊疾病如B l o o m综合征,恶性肿瘤发生率增加,不建议应用G H㊂3.2胰岛素增敏性治疗二甲双胍早期(7.9岁)治疗女性性早熟的疗效已经证实[22]㊂二甲双胍治疗4年后,青春期延迟,仍保持线性增长㊂治疗效果与降低胰岛素㊁瘦素和I G F1水平,以及减少动脉粥样硬化脂质分布相关㊂此外,二甲双胍的青春期前干预可减少脂肪并改善胰岛素敏感性,在一小部分非肥胖S G A儿童也获得了追赶性增长㊂3.3营养支持母乳喂养可减少S G A儿童的肥胖风险,且降低热加工食品中炎性晚期糖基化终产物,从而减少胰岛素抵抗㊂智利进行的一项大型前瞻性研究发现,接受富含二十二碳六烯酸(d o c o s a h e x a e n o i ca c i d,D H A)早产儿配方奶粉ȡ6个月,较其他奶粉婴儿在第一年和第二年的总脂肪质量和躯干脂肪质量更低,两年空腹胰岛素均降低,提示D H A有改善代谢的作用[23]㊂孕期摄入叶酸对S G A的减少有积极作用,多种微量元素的补充也有利于减少S G A的发生[24]㊂产后体重增加和生长与神经认知结果㊁肥胖㊁胰岛素抵抗和血压之间存在正相关关系[25]㊂4随访管理国内尚无对S G A的管理临床指南出台,国际上有影响力的S G A诊治指南或共识包括:2003年国际S G A发展建议会议共识声明(简称国际共识)㊁美国L a w s o n W i l k i n s儿科内分泌学会和欧洲儿科内分泌学会制定的多份共识声明以及2011年拉丁美洲S G A共识㊂S G A的标准化管理对于减少不良结局的发生有重要意义㊂S G A生后多会出现追赶生长, S G A追赶生长的核心在于身高的追赶而不是体重的追赶㊂随访S G A患者,观察预后,研究S G A的有效干预措施,旨在减少S G A成年后发生慢性疾病的可能性㊂2015年对美国20世纪60年代的大型出生队列数据库研究,针对S G A不同生长模式(不追赶生长㊁4月龄后生长速度减慢㊁缓慢追赶生长㊁适度追赶生长及过度追赶生长)对儿童不良结局发生风险进行预测,发现在适度追赶生长模式中,在婴儿期的前几个月,体重快速增长至同年龄同性别儿童体重的第30百分位左右,之后以较缓和的速度增长,至7岁时达到第50百分位的生长模式可不增高儿童不良结局风险㊂该研究展示了S G A最适追赶生长模式的特征,但是需要在不同人种更大范围中进行验证[26]㊂最佳的追赶性生长对S G A婴儿的正常神经发育至关重要㊂总之,S G A病因复杂,短期不良结局主要有低体温㊁低血糖㊁红细胞增多,甚至病死率增高,而长期不良结局主要包括生长迟缓㊁神经发育障碍,乃至成年期代谢性疾病发病率增加等㊂目前G H可以安全有效改善身高,针对代谢异常也可尝试二甲双胍治疗㊂不同病因的S G A结局不同,与其生后不同的生长模式交互作用又进一步对其长期健康结局产生不同影响,因此长期随访㊁及时治疗对于改善远期预后有重要意义㊂一种管理模式可能不适用于所有S G A患儿㊂因此,科学管理S G A需要在临床上恰当界定S G A基础上,根据病因和追该生长曲线,结合认知功能及代谢指标的检测随访,全面分析㊁综合评定,总㊃378㊃‘临床荟萃“2019年10月20日第34卷第10期 C l i n i c a l F o c u s,O c t o b e r20,2019,V o l34,N o.10Copyright©博看网. All Rights Reserved.结不同类型S G A的最佳成长模式,是S G A管理的重要研究方向㊂基于中国S G A病因及生活最佳追赶生长模式的真实世界研究将是中国S G A管理指南的重要依据㊂参考文献:[1] C l a y t o nP E,C i a n f a r a n i S,C z e r n i c h o wP,e t a l.M a n a g e m e n to ft h e c h i l d b o r n s m a l l f o r g e s t a t i o n a l a g e t h r o u g h t oa d u l t h o o d:a c o n s e n s u s s t a t e m e n t o f t h e I n t e r n a t i o n a l S o c i e t i e so f P e d i a t r i cE n d o c r i n o l o g y a n d t h eG r o w t hH o r m o n eR e s e a r c hS o c i e t y[J].JC l i nE n d o c r i n o lM e t a b,2007,92(3):804-810.[2] K e s a v a n K,D e v a s k a r S U.I n t r a u t e r i n e g r o w t h r e s t r i c t i o np o s t n a t a l m o n i t o r i n g a n d o u t c o m e s[J].P e d i a t r C l i n N o r t hA m,2019,66(2):403-423.[3] F i n k e n M J J,v a nd e rS t e e n M,S m e e t sC C J,e ta l.C h i l d r e nb o r n s m a l l f o r g e s t a t i o n a l a g e:d i f f f f e r e n t i a l d i a g n o s i s,m o l e c u l a r g e n e t i c e v a l 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胞浆内核酸受体RLRs的研究进展廖倩;吴谡琦;孙修勤【摘要】How the hosts recognize and clear invading viruses is one of the key issues in molecular immunology. However, the immediate-early signaling events among host and virus interaction were largely unknown. In the past few years, there are great breakthroughs in this rapidly evolving field. RIG-I like receptors (RLRs) have recently been identified as cytoplasmic sensors for nucleic acid of virus, which RIG-I (retinoic acid-inducible gene I), MDA5(melanoma differentiation associated factor 5)and LGP2(laboratory of genetics and physiology 2). The CARDs domains within this RLRs mediate associations with its adaptor protein MAVS to activate the transcription factors NF-kB and IRF, and then induce production of type I interferons and pro-inflammatory cytokines. Consequently these factors initiate innate immune responses and the acquired immune responses, enhancing the host's antiviral ability. Therefore RLRs play a key role in the detection and subsequent eradication of the replicating viral genomes. Recent progress is summarized in this paper on types, structures of RLRs, its roles in recognition of virus nucleic acid and molecular mediating signaling after the activation of RLRs in order to provide references for researches on antiviral immunity of marine organisms, especially teleost fishes.%机体如何识别以及清除入侵的病毒一直是免疫学研究的重点,然而对于病毒与宿主细胞相互作用的最早期信号事件的了解甚微.近几年的研究工作在先天性免疫系统如何识别早期病毒的入侵方面取得了重大进展.RIG-I样受体(RIG-I Like Receptors,RLRs)是一类新发现的胞浆内模式识别受体,能够识别细胞质中的病毒核酸,由3个成员组成,分别是RIG-I(Retinoic Acid-inducible Gene I)、MDA5 (Melanoma Differentiation-Associated Gene5)和LGP2(Laboratory of Genetics and Physiology 2).它们可通过自身的CARD结构域与下游信号分子线粒体连接蛋白(Mitochondrial Antiviral Signalling Protein,MAVS)的CARD结构域间的相互作用,激活细胞转录因子IRF和NF κB,诱导干扰素和促炎症细胞因子的产生,从而启动固有免疫应答和调节随后的获得性免疫应答,增强机体抵抗病毒的能力.因此,RLRs对抗病毒天然免疫的建立起着非常重要的作用.文章将分别就RLRs的组成结构、对病毒核酸等靶分子的识别及其相关信号传导途径方面所取得的主要研究进展做一概述,以期为海洋生物(特别是硬骨鱼类)的抗病毒免疫应答等相关研究提供参考.【期刊名称】《海洋科学进展》【年(卷),期】2013(031)001【总页数】8页(P153-160)【关键词】RIG-I样受体;RIG-I;MDA5;LGP2【作者】廖倩;吴谡琦;孙修勤【作者单位】国家海洋局第一海洋研究所,山东青岛266061【正文语种】中文【中图分类】Q819机体的固有免疫系统在抵抗病毒感染方面发挥着重要作用。
5682–5691 核酸研究、 2011 年卷第 39、第 13 发布在线 2011 年 3 月 22 日 doi:10.1093/nar/gkr155由子沉默在哺乳动物细胞中的转录基因模仿该目标基因启动子斯科特 T.Younger1,2 和戴维 R.Corey1,2,*药理学与生物化学,得克萨斯大学西南医学中心,达拉斯,TX 75390 9041,美国的 2Department 1Department接获 2010 年 12 月 10 日;修订 2011 年 3 月 1 日;接受 2011 年 3 月 2 日ABSTRACT完全是以基因启动子的扩音器 mentary 合成小复式 RNAs 可以沉默 transcrip 突变在哺乳动物细胞中。
(miRNAs) 小分子 rna 是内源性小规管 Rna 序列具体调节基因的表达。
我们有德 veloped 以确定能量状态-钛子目标站点内基因启动子的计算方法。
十个候选 miRNAs 预测目标孕激素受体 (PR) 基因启动子测试的调节基因表达的能力。
几一种抑制公关基因表达和米尔-423-5 便士,该目标高保守的公关启动子区域,被选的详细分析。
染色质沉淀发现米尔-423-5 p 模仿下跌 RNA 聚合物 ase 二入住,并增加组蛋白 H3 赖氨酸 9 dimethylation (H3K9me2)在公关专员简报-突破口的染色质级沉默。
转录沉默是瞬态的、独立的 DNA 甲基化,和关联...INTRODUCTION小复式 Rna 基因启动子的补充是烈性消音器和靶基因的激活(选装) 哺乳动物细胞中的表达。
我们和其他人已经表明这些小 Rna 序列 spe-cifically 承认重叠基因启动子(6,12–15)的非编码 RNA (ncRNA)成绩单。
识别目标 ncRNA 的一些发生在接近染色体的方法-并导致招聘的阿耳戈英雄 (前) 蛋白 ncRNA,目标基因启动子(13,14,介绍)。
TGR5是新型的代谢调节因子李熠;冯健;范忠才【摘要】G蛋白偶联胆汁酸受体1(TGR5)是一种特殊的胆汁酸膜受体,在胆汁酸信号网中起着重要作用。
它的激活可以控制血糖,调节血脂平衡,提高能量消耗,并发挥抗炎作用等,进而有望成为治疗一系列代谢性疾病的药物靶点。
%G protein-coupled bile acid receptor 1(TGR5) is a specific membrane receptor of bile acids , playing an important role in the bile acid signaling network .Its activation has been proved to increase the glycemic control , regulate of blood lipid balance , enhance energy expenditure , exert anti-inflammatory actions and so on .It suggests that TGR5 may play an important role in metabolic diseases .【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】4页(P108-111)【关键词】TGR5;糖代谢;脂代谢;能量代谢;动脉粥样硬化【作者】李熠;冯健;范忠才【作者单位】泸州医学院附属医院心血管疾病研究室心血管内科,四川泸州646000;泸州医学院附属医院心血管疾病研究室心血管内科,四川泸州646000;泸州医学院附属医院心血管疾病研究室心血管内科,四川泸州646000【正文语种】中文【中图分类】Q493代谢综合征是一种由多种心血管危险因素参与为特征的临床综合征,包括胰岛素抵抗、脂质代谢异常、高血压和肥胖等,其中胰岛素抵抗被认为是其最重要的病因之一。
- 7 -pancreatic cancer cell migration and Gemcitabine resistance[J].Am J Gastroenterol,2020,115(1):S57-S58.[18]董庆旭,赵郑莉.成纤维细胞生长因子受体4基因沉默对口腔鳞癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制[J].解剖学杂志,2021,44(4):312-318.[19] XIN L,LIU L,LIU C,et al.DNA-methylation-mediatedsilencing of miR-7-5p promotes gastric cancer stem cell invasionvia increasing Smo and Hesl[J].J Cell Physiol,2020, 235(3):2643-2654.[20]李娜,张哲莹,朱会芳,等.miR-7-5p 和miR-152-3p 联合调控Wnt/β-catenin 通路对乳腺癌细胞上皮-间质转化及化疗耐药的影响[J].临床与实验病理学杂志,2021,37(7):765-770.(收稿日期:2023-08-14) (本文编辑:陈韵)①江西省瑞金市人民医院 江西 瑞金 342500通信作者:钟文娟人干扰素α2b阴道泡腾胶囊与微波疗法对子宫颈炎伴高危型人乳头瘤病毒感染患者炎症因子的影响钟文娟①【摘要】 目的:探究人干扰素α2b 阴道泡腾胶囊+微波疗法对子宫颈炎伴高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染患者炎症因子的影响。
方法:选择瑞金市人民医院2021年6月—2022年6月接收的子宫颈炎伴HR-HPV 感染患者60例作为研究对象。
将患者随机分为两组:A 组(n =30)接受微波疗法,B 组(n =30)接受人干扰素α2b 阴道泡腾胶囊+微波疗法。
比较两组疗效、病毒载量、炎症因子水平、免疫功能指标及不良反应发生率。
结果:与A 组相比,B 组治疗后白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-4(IL-4)、HR-HPV 病毒载量均显著更低(P <0.05)。
端粒酶催化亚基hTERT调控乳腺癌细胞自我更新能力的探讨朱英华;李晶晶;郭倩囡【摘要】Objective To investigate the expression of hTERT and the effect of hTERT on the self-renewal ability of breast cancer stem cell. Methods Detecting the expression of hTERT by RT- PCR and Western Blot. Knockdown the expression of hTERT by RNA interference. Results We finded out that hTERT is high expressed in breast cancer stem cell, and reduced the expression of hTERT suppressed the self-renewal ability of breast cancer cell. Conclusion High expressed hTERT enhanced the self-renewal ability of breast cancer stem cell.%目的:球囊培养富集乳腺癌干性样细胞并检测 hTERT 的表达,进一步通过 RNA 干扰的方法探讨其对乳腺癌细胞自我更新能力的影响。
方法球囊培养富集乳腺癌干性样细胞,检测乳腺癌干性细胞与分化细胞中 hTERTmRNA 及蛋白的表达,小分子 RNA 干扰敲低hTERT 的蛋白表达水平。
结果乳腺癌干性细胞中 hTERT 表达升高,敲低其表达后乳腺癌细胞自我能力下降。
结论高表达的 hTERT 促进了乳腺癌细胞的自我更新能力。
【期刊名称】《中国继续医学教育》【年(卷),期】2015(000)025【总页数】2页(P63-64)【关键词】端粒酶催化亚基 hTERT;乳腺癌干性细胞【作者】朱英华;李晶晶;郭倩囡【作者单位】510120 广东省广州市中山大学孙逸仙纪念医院医学研究中心;510120 广东省广州市中山大学孙逸仙纪念医院医学研究中心;510120 广东省广州市中山大学孙逸仙纪念医院医学研究中心【正文语种】中文【中图分类】R737.9作者单位: 510120 广东省广州市中山大学孙逸仙纪念医院医学研究中心基金项目:国家自然科学基金项目(编号:c002015010)乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,近年来已成为威胁女性健康的头号杀手,乳腺癌的传统治疗方法包括外科手术摘除肿瘤、放疗、化疗、内分泌治疗等方法。
综 述 Zongshu 《中外医学研究》第17卷 第14期(总第418期)2019年5月①湖南师范大学医学院 湖南 长沙 410000RIG-I样受体信号通路及其调控研究综述丁汝璇①【摘要】 RIG-I 样受体(维甲酸诱导基因I)是细胞质中的一类RNA 解旋酶,属于固有免疫的模式识别受体,其可以结合病原相关分子式及RNA 配体识别非自身的病毒RNA,激活RIG-I 信号通路,促进细胞因子产生,发挥抗病毒效应。
本研究综述RIG-I 样受体的多种信号通路和调控机制,为病毒感染的控制和免疫调节治疗提供新的思路和方向。
【关键词】 RIG-I 样受体; 信号通路; 调控机制; 病毒感染; 免疫反应 doi:10.14033/ki.cfmr.2019.14.086文献标识码 A文章编号 1674-6805(2019)14-0184-03 A Review of RIG-I Like Receptor Signaling Pathway and Its Regulation/DING Ruxuan.//Chinese and Foreign Medical Research,2019,17(14):184-186 【Abstract】 RIG-I like receptor(retinoic acid-induced gene I) is a kind of RNA helicase in cytoplasm,which belongs to the pattern recognition receptor of innate immunity,which can bind the pathogenic correlation molecular formula and RNA ligand to identify non-own viral RNA,activate the RIG-I signaling pathway,promote the production of cytokines and exert the antiviral effect.This study reviews the various signaling pathways and regulatory mechanisms of RIG-I like receptors,providing new ideas and directions for the control of viral infection and immunomodulatory therapy. 【Key words】 RIG-I like receptors; Signal transduction pathway; Regulation mechanism; Viral infection; Immune response First-author ’s address:Hunan Normal University School of Medicine,Changsha 410000,China 天然免疫模式识别理论最早于20世纪80年代末被提出,该理论指出:高等生物能通过体内的模式识别受体(PRRs),识别出病原微生物的保守分子式[1-2]。
论文分类号R392.11 单位代码 1 0 1 8 3 密级内部研究生学号 2004342027吉林大学硕士学位论文人肝再生增强因子的原核表达质粒的构建、表达及其初步药效学研究Study On Gene Clonning,Expression In E.coli AndElementary Effect of Human Augmenter of LiverRegeneration作者姓名:孙天旭专业:生化与分子生物学导师姓名吴永革教授及职称:学位类别:理学硕士论文起止年月:2004年9月至 2007年6月吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明:所呈交的硕士学位论文,是本人在指导教师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。
除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。
本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
学位论文作者签名:日期:年月日《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿声明研究生院:本人同意《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》出版章程的内容,愿意将本人的学位论文委托研究生院向中国学术期刊(光盘版)电子杂志社的《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿,希望《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》给予出版,并同意在《中国博硕士学位论文评价数据库》和CNKI系列数据库中使用,同意按章程规定享受相关权益。
论文级别:;硕士□博士学科专业:生化与分子生物学论文题目:人肝再生增强因子的原核表达质粒的构建、表达及其初步药效学研究作者签名:指导教师签名:年月日作者联系地址(邮编):长春市火炬路1260号(130012)作者联系电话:作者姓名孙天旭论文分类号R392.11保密级别内部研究生学号 2004342027 学位类别硕士授予学位单位吉林大学专业名称生化与分子生物学培养单位(院、所、中心)生命科学学院研究方向细胞因子学习时间2004年9月至2007年7月论文中文题目人肝再生增强因子的原核表达质粒的构建、表达及其初步药效学研究论文英文题目Study On Gene Clonning,Expression In E.coli And Elementary Effect of HumanAugmenter of Liver Regeneration关键词(3-8个) 肝再生增强因子(ALR);原核表达;纯化;初步药效姓名吴永革职称教授导师情况学历学位博士工作单位生命科学学院论文提交日期 2007年6月答辩日期2007年6月是否基金资助项目无基金类别及编号如已经出版,请填写以下内容出版地(城市名、省名)出版者(机构)名称出版日期出版者地址(包括邮编)内容提要肝再生增强因子是一种重要的肝再生刺激因子,自从发现以来,因其特殊的基因结构特点、多种生物学活性尤其是对急慢性肝损伤的保护作用,使得该因子受到多方面重视。
人RAG2基因5′近端染色质结构定量差异分析及可接近区域转录调控机制研究作者:薛文宇曾艳韦星呈来源:《中国当代医药》2017年第03期[摘要]目的研究人类重组激活基因2(RAG2)5′近端染色质可接近区域调控RAG2表达的分子机制。
方法采用染色质可接近性实时聚合酶链反应(CHART-PCR)分析RAG2基因5′近端区域的DNase Ⅰ超敏位点(DHS),比较RAG阳性和阴性淋巴细胞以及非淋巴细胞的染色质开放状态变化。
采用双荧光素酶报告基因分析DHS的转录调控活性,采用胶迁徙试验和染色质免疫沉淀试验证实GATA3的体外(in vitro)和在体(in vivo)结合,采用PCR定点突变和显性负突变体技术证实GATA3对RAG2基因的调控作用。
结果人RAG2基因5′上游近端区域染色质在T与B细胞中处于不同的开放状态,RAG阳性T细胞的核心启动子活性与其特异性DHS相吻合。
T细胞特异性转录因子GATA3结合于T细胞特异性DHS的高度保守区域,特异性上调报告基因及在体RAG2 mRNA在T细胞中的表达。
结论 RAG2基因5′近端区域通过染色质开放状态变化调控基因表达的特异性。
GATA3与高度保守的DHS区域结合,上调内源性人RAG2在T细胞中的表达。
[关键词]重组激活基因;染色质可接近性;启动子;顺式作用元件;转录因子;T淋巴细胞[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2017)01(c)-0007-07[Abstract]Objective To study molecular mechanism of the regulation of RAG2 expression regulated the human recombination activating gene 2 (RAG2)5′proximal chromatin accessible areas.Methods To compare the open states change of chromatin of RAG positive and negative lymphocytes as well as non lymphocyte chromatin,chromatin accessibility by real-time polymerase chain reaction (CHART-PCR) was used for DNase Ⅰ analysis of RAG2 gene 5′proximal regions of hypersensitive sites (DHS).Double luciferases reporter assay was used to examine the transcriptional regulation effects of the DHS regions.Electrophoresis mobility shift assay and chromatin immunoprecipitation assays were used to detect the binding of GATA3 in vitro or in vivo.PCR site-directed mutant assay and dominant-negative mutant assay were used to identify the regulatory effects of GATA3 on the reporter gene (in vitro),as well as on RAG2 gene (in vivo).Results In T and B cells,the chromatin structures of 5′ proximal region of human RAG2 were in distinct open states.In RAG positive T cells,the activity of RAG2 core promoter corresponded to its specific DHS.GATA3,a T-cell specific transfactor,bound to a highly conserved sequence within the specific DHS,and increased the expression of the reporter genes as well as RAG2 mRNA of the T cells in vivo.Conclusion RAG2 gene 5′proximal area through open states ch ange of chromatinregulate the specificity of the gene expression,GATA3 regulates the expression of endogenous RAG2 in T cells by binding to highly conserved DHS regions.[Key words]Recombination activating gene;Chromatin accessibility;Promoter;Cis-acting element;Transcription factor;T lymphocyte重组激活基因(recombination activating gene,RAG)编码的重组激活酶RAG1和RAG2介导抗原受体基因V(D)J重排,在抗原受体多样性细胞库的形成以及淋巴细胞分化发育过程中发挥关键作用[1]。
任一RAG基因的无效突变,将阻断T和B淋巴细胞发育,导致严重免疫缺陷病[2-3]。
在T和B细胞发育过程中,RAG1和RAG2表达具有严格的组织、阶段特异性。
以往的研究者对调控小鼠RAG1和RAG2转录的启动子及增强子、其他类型的转录调控元件以及转录调控因子的研究结果进行了报道[1,4-6],还报道了小鼠RAG2启动子、淋巴细胞特异性增强子(D3)、B细胞特异性增强子(Ep)、以及转录因子的结合与调控功能研究结果[7-10],但是目前对人RAG转录调控机制的报道十分有限,尤其是缺乏在体(in vivo)的研究证据。
本研究将通过CHART-PCR(chromatin accessibility by real-time PCR)方法对人RAG2基因5′近端区域的DNase Ⅰ超敏位点(DNase Ⅰ hypersensitivity site,DHS)进行定量分析,比较RAG阳性(RAG+)T和B淋巴细胞、RAG阴性(RAG-)淋巴细胞以及非淋巴细胞的染色质开放状态变化;研究T细胞中转录因子(transcription factor,TF)与DHS在体外(in vitro)和在体(in vivo)的特异性结合对报告基因的调控作用以及TF显性负突变体(dominant-negative mutant,DNM)对内源性RAG2表达的直接影响。
1材料与方法1.1细胞Reh(RAG+人pre-B细胞)由ATCC提供,Daudi(RAG-人B细胞)、CCRF-CEM (RAG+人pre-T细胞)、Jurkat(RAG+人胸腺T细胞)、Hut78(RAG-人T细胞)、K562(RAG-人红细胞系)均由中科院细胞库提供。
上述细胞使用RPMI 1640(GIBCO),加入10% FCS、100 U/ml氨苄青霉素、0.1 mg/ml链霉素以及5% CO2、37℃培养。
1.2 CHART-PCR鉴定DHS1.2.1 DNase I处理方法参考Ling等[11]的方法略作改良,1.5×107细胞核经0~2 U/μl DNase Ⅰ(TakaRa)作用,10 mmol/L Proteinase K终止反应后,提取基因组DNA。
1.2.2 CHART-PCR分析引物设计使扩增产物为80~250 bp的连续或部分重叠的目的基因片段(表1)。
使用Primer 3和Oligo 7.58进行引物评价,Primer-Blast做特异性分析。
基因组DNA经5倍稀释(0、0.8、4.0、20.0、100.0、500.0 ng)做标准曲线。
目的DNA模板加入量为50 ng,SYBR?誖Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa),ABI 7500(applied biosystems),每个反应设3次重复。
1.3报告基因、TF过表达及DNM表达载体1.3.1 pGLhR2报告基因使用pGL4.10[Luc2](Promega)载体,将人RAG2转录起始位点(TSS)5′上游(-1746、-789、-323、-157、-129、-108、-70、-9 bp)至+104 bp区域连接至Sac Ⅰ/Xho Ⅰ位点。
1.3.2 pGLhR2G3m(GATA3结合位点突变载体)将pGLhR2-108/+104的GATA3位点突变(TAAATC→TAAAAG)。
1.3.3 GATA3表达载体pEF1-hGATA3 将含CDS(GeneBank Accession:NM001002295)区域的2.4 kb片段从全长GATA3 cDNA克隆(GENECHEM)中切出(EcoR Ⅰ/Xba Ⅰ),插入pEF1载体(Invitrogen)的相同位点。
1.3.4 pEF1-hG3KRR(GATA3DNM表达载体)按照Smith等[12]的方法,将GATA3锌指结构中的KRR突变为AAA。
引入KRR突变的寡核苷酸序列为5′-CTCATTAAGCCCGCGGGCAGCGCTGTCTGCAGCC-3′和5′-GGCTGCAGACAGCGCTGCCGCGGGCTTAATG ?鄄AG-3′。
各克隆经DNA测序验证。
1.4 细胞转染和TF过表达及DNM表达1.4.1转染试验使用DEAE(diethylaminoethyl)-葡聚糖方法和双荧光素酶(Luc2/hRLuc)报告基因系统(Pro?鄄mega),转染效率内控使用pGL 4.74[hRLuc/TK]载体[7]。
1.4.2 TF过表达与pGLhR2报告基因共转染,不同剂量的GATA3表达载体用pEF1载体调节为相同的DNA总量。
1.4.3 DNM表达转染pEF1-hKRRG3,DNA总量的调节方法同上。
结果以3次试验值的均数与标准差表示。
1.5胶迁徙试验细胞核蛋白提取方法如前所述[8]。
凝胶迁徙试验(electrophoresis mobility shift assay,EMSA)采用LightShift Chemiluminescent EMSA kit(PIERCE),按照kit标准流程操作。