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对虾偷死野田村病毒(CMNV) RT-PCR 检测方法的建立作者：张达云来源：《农家致富顾问·下半月》2016年第03期摘要：参考 GenBank 中对虾偷死野田村病毒（Covert mortality nodavirus， CMNV）的基因序列，应用 Primer Premier5.0 软件设计了一对引物，建立了适合CMNV快速检测的RT-PCR 检测方法。
以该方法对实验室分离并保存的CMNV cDNA片段为模板进行PCR扩增，得到了预期大小为210bp的目的片段。
将扩增所得的DNA片段进行克隆测序，测序结果与GenBank 中的CMNV的相应序列比对分析，确定为CMNV的基因序列。
以对虾常见IHHNV（传染性皮下及造血组织坏死病毒）、WSSV（对虾白斑综合症病毒）、TSV（桃拉病毒）、YHV（黄头病毒）等病毒核酸片段为模板，用设计的引物进行PCR，结果均为阴性。
该方法敏感性检测结果表明，最低RNA模板检出量为2pg。
表明所建立的RT-PCR检测技术具有特异、快速和敏感的特点，可用于对虾CMNV的快速检测。
关键词：虾；病毒；检测方法1 材料与方法1.1 材料与试剂从宁波市多个南美白对虾育苗场分别采集10日龄虾苗幼体1000尾左右，95%酒精保存，CMNV、IHHNV（传染性皮下及造血组织坏死病毒）、WSSV（对虾白斑综合症病毒）、TSV （桃拉病毒）、YHV（黄头病毒）阳性样品为本实验室的保存样品。
上海生工的“柱式动物组织总RNA抽提纯化试剂盒”和“胶回收纯化试剂盒”、康为世纪“HiFiScript cDNA 第一链合成试剂盒”、康为世纪“2×Taq MasterMix”。
1.2 病毒RNA提取根据上海生工的柱式动物组织总RNA抽提纯化试剂盒，操作如下：将阳性虾苗用RNase-free研磨器研磨匀浆后，取25-50mg匀浆产物加入1.5ml RNase-free 离心管中，加入450μl Buffer Rlysis-AG，立即震荡混匀，室温放置3min；12，000rpm，4℃离心3min，将上清移至新的1.5ml RNase-free离心管中，加入1/2体积无水乙醇，充分混匀后，转移至吸附柱中，静置1min，室温12，000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；将吸附柱放回收集管中，加入500μl GT solution，静置1min，室温10，000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；再加入500μl NT Solution，静置2min，室温10，000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；室温12，000rpm空转离心2min；将吸附柱放入新的RNase-free的离心管中，在吸附膜中央加入40μl DEPC处理的水，静置2min，室温12，000rpm离心2min，得到总RNA。
Open Journal of Fisheries Research 水产研究, 2020, 7(3), 115-123Published Online September 2020 in Hans. /journal/ojfrhttps:///10.12677/ojfr.2020.73016广西虾源副溶血弧菌喹诺酮类耐药基因qnrC、qnrS、qnrVC的检测及分析盛雪晴1，杨廷雅1，张振豪2，潘英姿1，梁祖銮1，苏清荣1，邓翊煊1，陈耐牟1，肖双燕1，梁静真1*1广西大学动物科学技术学院广西水生动物病害诊断实验室，广西南宁2防城港市港口区渔业技术推广站，广西防城港收稿日期：2020年7月23日；录用日期：2020年8月6日；发布日期：2020年8月13日摘要本实验通过PCR方法检测34株广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌中喹诺酮类耐药基因qnrC、qnrS和qnrVC的分布情况。
耐药基因检测结果表明，34株副溶血弧菌中qnrC、qnrS和qnrVC基因的检出率分别为2.9%、0.0%与2.9%。
qnrC基因在防城港市、钦州市、北海市的检出率分别为16.7%、0%、0%。
qnrS基因在防城港市、钦州市、北海市的检出率均为0%。
qnrVC基因在防城港市、钦州市、北海市的检出率分别为0%、0%、6.3%，三种耐药基因的检出率在三个市的副溶血弧菌之间差异均不显著(P > 0.05)。
基于qnrC 基因的氨基酸序列同源性比较结果表明，防城港株F17383与副溶血弧菌TOE26912.1、TOP53441.1、OQU02262.1亲缘关系最近，氨基酸同源性分别为100.0%、98.8%和98.8%。
基于qnrVC基因氨基酸序列同源性比较结果表明，北海株B13121与副溶血弧菌AXI69764.1亲缘关系最近，同源性为99.4%。
关键词凡纳滨对虾，副溶血弧菌，qnrC基因，qnrS基因，qnrVC基因Detection and Analysis ofQuinolone Resistance Genes,qnrC, qnrS and qnrVC,in Vibrio Parahaemolyticusfrom Shrimp in GuangxiXueqing Sheng1, Tingya Yang1, Zhenhao Zhang2, Yingzi Pan1, Zuluan Liang1, Qingrong Su1, Yixuan Deng1, Naimou Chen1, Shuangyan Xiao1, Jingzhen Liang1**通讯作者。
应用RT-PCR和单抗技术检测广西猪场临床非典型表现猪瘟
的发生情况
禤雄标;陆芹章;黄伟坚
【期刊名称】《广西畜牧兽医》
【年(卷),期】2004(20)6
【摘要】应用RT-PCR及本室研制的三株抗猪瘟病毒(HCV)E2基因的单抗检测广西各猪场送检疑似猪瘟的病料,以了解广西猪场非典型症状猪瘟流行情况.共检24份外表猪瘟临床症状不明显或混合感染症状复杂的保育猪病料和8份母猪繁殖障碍引起的流产、死胎等的病料.经检测,24份外表缺乏猪瘟临床症状的病料中有8份诊断为猪瘟,阳性率为33%;8份流产、死胎的病料中有3份诊断为阳性,阳性率为38%.结果表明,广西猪场确实存在非典型症状猪瘟,有些猪场流行还很严重.
【总页数】3页(P251-253)
【作者】禤雄标;陆芹章;黄伟坚
【作者单位】广西大学动物科学技术学院,南宁,530005;广西大学动物科学技术学院,南宁,530005;广西大学动物科学技术学院,南宁,530005
【正文语种】中文
【中图分类】S858.282.65+1
【相关文献】
1.猪瘟病毒Taqman实时定量RT-PCR检测方法的建立和临床应用 [J], 毛立;李文良;李彬;江杰元
2.多重RT-PCR一步法技术同时检测猪瘟病毒和蓝耳病病毒方法的建立以及初步应用 [J], 孔繁德;王荣;陈琼;吴德峰;徐淑菲
3.关于猪瘟病毒Taqman实时定量RT-PCR检测方法与临床应用的探讨 [J], 马兰
4.RT-PCR技术检测猪瘟病毒应用浅析 [J], 陈隆全
5.中小型猪场可用RT-PCR方法检测猪瘟病毒 [J], 刘宜存
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多重RT-PCR同时检测鉴别三种对虾病毒的研究与应用谢芝勋;庞耀珊;邓显文;唐小飞;刘加波【期刊名称】《病毒学报》【年(卷),期】2005(21)5【摘要】根据基因库中对虾桃拉综合征病毒(TSV)、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(I-HHNV)的基因序列,分别设计了三对特异性引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别TSV、WSSV和IHHNV的多重RT-PCR。
该技术对同一样品中的TSV RNA、WSSV DNA和IHHNV DNA模板进行扩增,结果均同时得到3条大小与实验设计相符的231bp(TSV)、593bp(WSSV)和356bp(IHHNV)的特异性多重RT-PCR扩增带,对其它对虾病原核酸的扩增结果为阴性。
敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到10pg TSV RNA、100pg WSSV DNA和100pg IHHNV DNA。
临床检测试验结果表明,该技术对TSV、WSSV和I-HHNV的检出率明显高于传统的临床症状观察和组织病理学检查,提示该技术适用于这三种病毒的临床快速检测和鉴别诊断。
【总页数】4页(P393-396)【关键词】多重聚合酶链式反应;对虾;桃拉综合征病毒;白斑综合征病毒;传染性皮下和造血器官坏死病毒【作者】谢芝勋;庞耀珊;邓显文;唐小飞;刘加波【作者单位】广西壮族自治区兽医研究所【正文语种】中文【中图分类】Q78;S941.53【相关文献】1.猪流行性腹泻病毒变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用 [J], 秦毅斌;卢冰霞;段群棚;何颖;李斌;梁家幸;苏乾莲;周英宁;蒋冬福2.多重RT-PCR方法在凡纳滨对虾病毒检测中的应用 [J], 黎铭;陈晓汉;李咏梅;熊建华;陈秀荔;蒋伟明;曾地刚;彭敏;杨春玲;马宁3.二温式多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)的研究与应用 [J], 谢芝勋;庞耀珊;刘加波;邓显文;唐小飞4.多重RT-PCR用于临床检测三种胃肠炎病毒的研究 [J], 寇晓霞;吴清平;王大鹏;郭伟鹏;邓梅清5.应用多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒和桃拉病毒 [J], 谢芝勋;庞耀珊;何竞铭;邓显文;唐小飞;刘加波;谢志勤;廖敏;文雪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
《罗氏沼虾诺达病毒检测RT-PCR法》
编制说明
一、标准的目的和意义
罗氏沼虾是我国最主要的淡水虾养殖品种，但2010年全国的罗氏沼虾闹“苗荒”，苗价急剧攀升，苗种供应不足已经成为制约我国罗氏沼虾养殖业发展的首要因素。
罗氏沼虾白尾病（WTD）又称肌肉白浊病、白体病，主要危害罗氏沼虾苗种，尤其是淡化后的仔虾；患病虾苗可在较短时间内大量死亡，虾池中累积死亡率高达30%～90%。
该病流行广、发病快、死亡率高，严重制约着罗氏沼虾养殖业的健康发展，已成为罗氏沼虾苗种业和养殖业的主要威胁，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须申报的疾病。
罗氏沼虾诺达病毒（MrNV）是引起罗氏沼虾WTD的主要病原，但目前国内尚没有检测MrNV的相关标准。
广西是我国罗氏沼虾的主要养殖区，急需一种检测MrNV的技术规范来为罗氏沼虾WTD的快速诊断及罗氏沼虾苗种的MrNV检疫提供技术手段。
因此，制定MrNV套式RT-PCR检测方法的地方标准，规范MrNV的检测，为广西境内MrNV的检测提供依据和技术手段，对于WTD的诊断、防控以及MrNV的检验检疫都具有重要意义。
项目由广西水产研究所水产品质检中心（广西渔业病害防治环境监测和质量检验中心）实施。
中心拥有各种大型仪器设备82台（套），通过了国家和省级计量认证，长期从事水生动物病害方面的检测和研究工作。
近几年来，项目组主要成员一直开展MrNV的监测和研究工作，积累了不少经验，并从患WTD的罗氏沼虾中检测出诺达病毒，保存了阳性材料，为MrNV检测标准的制定打下了重要基础。
我们承担
广西壮族自治区质量技术监督局桂质监函[2011]884号文下达的广西地方标准制定《罗氏沼虾诺达病毒检测套式RT-PCR法》的任务，高标准地完成标准的制定工作。
二、标准起草工作简况
承担任务后，广西水产研究所成立标准起草小组，由黎小正副所长担任组长，成员有韦信贤、童桂香、吴祥庆。
为了使制定的标准具有科学、规范和可操作性，起草小组专门制定了《罗氏沼虾诺达病毒检测套式RT-PCR法编制工作方案》。
根据工作方案和任务要求，广泛查询和收集资料、开展调查和深入研究。
参考国内同类相关国家标准和行业标准的制定情况，充分借鉴、吸收标准规范的成果；采购试剂，探索样品处理及核酸提取的方法，优化套式RT-PCR反应条件和反应程序，确保规范的科学性和可操作性，初步建立MrNV套式RT-PCR检测方法。
对检测方法进行特异性、敏感性、重复性等多方验证，汇总、分析实验数据，进行方法的可行性评价，完成标准征求意见稿，送专家征求意见。
标准征求意见稿完成后，分别向在检验检疫、科研、教学、技术推广等方面有实际经验和较高理论水平的专家征求意见。
2012年11月，修改并完成标准送审稿。
起草小组成员根据专家的反馈意见，逐一对标准的条款进行修改，对有疑问的条款，再向专家咨询、落实或再翻阅资料查证。
在编写的规则上，按照《标准化工作导则》的要求进行，编制出该标准的送审稿。
三、标准确定所遵循的原则
1、政策性原则：本标准编制的每一项内容都遵循国家有关的法律、法规和规章制度。
2、先进性原则：本标准是在国内没有类似标准的前提下提出的，因此制定具有先进性。
3、适用性原则：本标准操作规程容易掌握，适用于检验检疫。
4、协调统一性原则：本标准是以OIE《水生动物疾病诊断手册》（2009年版）作为指导、依据和参考的前提下制定，所以与其操作方法协调统一。
5、规范化原则：本标准的制定按照GB/T 1.1-2001《标准化工作导则第一部分：标准的结构和编写规则》来编写。
四、标准的主要内容
本标准积极借鉴OIE最新诊断手册，结合广西罗氏沼虾检验检疫需求而制定。
编写内容包括适用范围、术语、材料、操作程序、废弃物处理。
五、主要参考文献
1、GB/T 1.1-2001《标准化工作导则第一部分：标准的结构和编写规则》。
2、OIE《水生动物疾病诊断手册》（2009年版）。
《罗氏沼虾诺达病毒检测套式RT-PCR法》起草小组
2012年12月。
