土壤微生物的采集一般有土样采集
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土壤细菌的分离及纯化(1)土壤中存在着丰富的微生物群落,其中细菌是占主导地位的一类微生物。
分离和纯化这些细菌有助于深入了解它们的特性并有利于相关应用的开发。
下文将从分离和纯化的流程、常用方法以及注意事项等方面进行详细阐述。
一、分离和纯化细菌的流程1. 采集土样首先,需要采集土样,并将其认真分层剖析,取相对均匀的土样。
避免受到环境中其他微生物的干扰,有时要在合适的温度、溶液中将其处理,以杀死其他未被分离出的细菌,确保最终分离到的细菌属于所期望的种类。
2. 筛选方法可以通过筛选的方式来分离目标细菌。
在将土样处理后,可以将土壤中的颗粒筛选出来,将其悬浮于适宜的培养基中。
通过培养基选择,可以筛选出自然界中对常规培养基营养要求不高的菌株。
3. 纯化法基于筛选法筛选出的细菌群,要进一步分离单菌株。
这时候,可以通过分泌落细菌的方式进行分离。
分泌落法是在无菌条件下,用匀染映到平板上,供菌落生长孵育,培养出纯净菌株。
二、常用分离和纯化方法1. 发酵罐法发酵罐法是在无菌环境下,将土壤样本与特定的培养基混合,形成发酵液,供细菌发酵并产生代谢产物。
根据代谢产物对目标微生物的要求特点,可以从代谢产物中充分筛选出目标菌株并进行单克隆的分离培养。
2. 过滤法将土样过滤后,混合在无固定菌相的培养基中,通过筛选培养环境中的单菌孵育,纯化出其中的某一菌株。
3. 土盘法所收集的土样经过处理后,均匀地坚着到培养皿的表面。
将培养皿置于恰当的条件下,等待细菌的生长,进行单克隆的分离。
三、注意事项1. 待分离土样尽量温和,避免对土壤环境造成较大影响,减少细菌数量的变化。
2. 培养到疑似有目标菌株生长为止,这就需要经验较丰富的实验人员进行分离纯化操作。
3. 需要从其他细菌中筛选出目标菌株,可以加入抗生素等各种筛选方法。
总之,提高细菌的分离和纯化技术,是深入探索土壤生物多样性、探索新型约束细菌等领域的很重要的手段。
实验一泥土样品的收集与处理泥土样品的收集是泥土剖析工作中的一个主要环节,是关系到剖析成果和由此得出的结论是否精确的一个先决前提.因为泥土特别是农业泥土的差别很大,采样误差要比剖析误差大若干倍,是以必须十分看重收集具有代表性的样品.此外,应依据剖析目标和请求采取不合的采样办法和处理办法.一.泥土样品的收集(一)采样时光泥土中有用营养的含量随季候的转变而有很大变更.剖析泥土营养供给情形时,一般都在晚秋或初春采样.统一时光内采纳的土样,其剖析成果才干互相比较.(二)采样办法采样办法因剖析目标和请求的不合而有所不同:1.泥土剖面样品研讨泥土根本理化性质,必须按泥土产生层次采样.2.泥土物理性质样品假如是进行泥土物理性质测定,须采原状样品.3.泥土盐分动态样品研讨盐分在剖面中的散布和变动时,不必按产生层次取样,而自地表起每l0cm或20cm收集一个样品.4.耕层泥土混杂样品为了评定泥土耕层肥力或研讨植物发展期内泥土耕层中营养供求情形,采取这种办法.(1)采样请求在采样时,请求土样有代表性,是以需多点取样,充分混杂,布点平均,混杂样品的取样数目应依据实验区的面积以及地力是否平均而定,平日为5~20个点,采样深度只需垦植层泥土0~20cm,最多采到犁底层的泥土,对作物根系较深的,可恰当增长采样深度.(2)采样办法依据地形.样点数目和地力平均程度安插采样点.面积不大,比较朴直,可采取对角线取样法;面积较大,外形朴直,肥力不匀的地块可采取棋盘式采样办法(方格取样法);面积较大,外形长条或庞杂,肥力不匀的地块多采取蛇形取样法(折线取样法)见图1所示,,对角线取样法棋盘式取样法蛇形取样法法一致;采土时应除去地面落叶杂物.采样深度一般取垦植层泥土20 cm 阁下,最多采到犁底层的泥土,对作物根系较深的泥土,可恰当增长采样深度.采土可用土钻或小土铲进行.用土钻时必定要垂直拔出土内.如用小土铲取样,可用小土铲斜着向下切取一薄片的泥土样品(图2),然后将土样分散起来混杂平均.量多时可用四分法弃去,取土样1kg 装入布袋或塑料袋,袋表里各放一标签,上面用铅笔写明编号.收集地点.地形.泥土名称.时光.深度.作物.收集人等,采完后将坑或钻眼填平.图2 小土铲采样图(3)采样数目假如采来的泥土样品量太多,可用四分法将过剩的泥土弃去,一般1kg 阁下的土样即够化学.物理剖析之用.四分法的办法是:将收集的泥土样品弄碎混归并铺成四方形,划分对角分成四等份,取其对角的两份,其余两份弃去,假如所得的样品仍然许多,可再用四分法处理,直到所需数目为止.见图3所示二.泥土样品的处理样品处理的目标是:(1)挑出植物残茬.石块.砖块等,以除去非土样的构成部分;(2)恰当磨细.充分混匀,使剖析时所称取的少量样品具有较高的代表性,以削减称样误差;(3)全量剖析项目,样品须要磨细,以使剖析样品的反响可以或许完整和一致;(4)使样品可以长期保管,不致因微生物运动而霉坏,引起性质的转变.土块第一步 第二步 第三步图3 四分法取样泥土样品的处理包含风干.去杂.磨细.过筛.混匀.装瓶保管和登记操纵.(一)风干和去杂从田间采回的土样,应实时进行风干.其办法是将泥土样品弄成碎块平铺在清洁的纸上,摊成薄薄的一层放期近阴凉湿润通风,又无特别的气体(如氯气.氨气.二氧化硫等).无尘土污染的室内风干,经常翻动,加快湿润.切忌阳光直接曝晒或烘烤.在土样半干时,须将大土块捏碎(尤其是粘性泥土),以免完整干后结成硬块,难以磨细.样品风干后,应拣出枯枝落叶.植物根.残茬等.若泥土中有铁锰结核.石灰结核或石子过多,应细心拣出称重,记下所占的百分数.(二)磨细和过筛物理剖析时,取风干土样100~200g,放在木板或胶板上用胶塞或圆木棍碾碎,放在有盖底的18号筛(孔径1mm)中,使之经由过程lmm的筛子,留在筛上的土块再倒在木板上从新碾碎,如斯重复多次,直到全体经由过程为止.不得摈弃或漏掉,但石砾切勿压碎.留在筛上的石砾称重后须保管,以备石砾称重盘算之用.用时将过筛的土样称重,以盘算石砾重量百分数,然后将土样充分混杂平均后盛于广口瓶中,作为泥土颗粒剖析及其它物理性质测定之用.化学剖析时,取风干样品一份,细心挑去石块.根茎及各类新生体和侵入体,再用圆木棍将土样辗碎,使全体经由过程18号筛(1mm)这种土样可供速效性营养及交流机能.pH等项目标测定.测定泥土全氮.有机质等项目标样品,可用经由过程lmm筛孔的土样,用四分法或多点取样法掏出样品约50g,放入瓷研钵中进一步研磨,使其全体经由过程60号筛(孔径0.25mm)为止.假如须要测定全磷.全钾,还需从lmm土样中同样掏出约20g,磨细并使之全体经由过程100号筛(孔径0.15mm),分离混匀后,装入广口瓶中.(三)保管和登记样品装入广口瓶后,应贴上标签,记明土样号码.土类名称.采样地点.深度.日期.孔径.收集人等.瓶内的样品应保管在样品架上,尽量防止日光.高温.潮湿或酸碱气体等的影响,不然影响剖析成果的精确性.三.器具土钻.小土铲.米尺.布袋(盐碱土需用油布袋).标签.铅笔.土筛.广口瓶.天平.胶塞(或圆木棍).木板(或胶板)等.思虑题1.泥土样品的收集与处理在剖析工作中有何意义?2.处理土样时为什么<lmm.<0.25mm和<0.l5mm的细土必须重复研磨,使其全体过筛?3.处理经由过程lmm及0.25mm土筛的两种土样,可否将两种筛套在一路过筛,分离收集两种筛下的土样进行剖析测定?为什么?1.附注:(一)依据土样处理成果,盘算泥土石砾的百分率.(二)土筛号数即为每英寸长度内的孔(目)数,如100号(目)即为每一英寸长度内有100孔(目).筛号与筛孔直径对比见附表.附表尺度筛孔对比表。
土壤样品采集、处理和检测要求土壤样品采集、处理和检测是土壤环境监管和评价的重要组成部分。
以下是土壤样品采集、处理和检测的要求。
一、土壤样品采集要求1.选取代表性样点,避免采集样品受到不同因素的影响而引起误差。
2.在采样前应先了解采样区域的地理环境、土地利用类型、历史背景及施肥情况等信息。
3.采样工具应使用干净、无污染、无铁质、无铜质的不锈钢工具。
4.采样深度一般在20cm左右,且应有标记。
5.在进行离子、有机物等分析时,要将地表层——下伏液态水层竖向采样并混合均匀后采集样品。
二、土壤样品处理要求1.土壤样品采集后,应进行混合均匀处理。
2.保持样品的湿度不变,并尽快送至检测单位或实验室。
3.土壤中有机物含量较高的样品应在采集后尽快进行处理和检测,以防有机物被微生物降解。
4.有机质含量高的土样应进行曲线稀释或重量划定以获得最佳测定结果。
三、土壤样品检测要求1.根据不同的物质成分进行不同的检验,如离子检测、有机物质检测等。
2.检测前应进行试验室的初始污染检测,避免由试验室污染影响样品检测结果。
3.选择权威、正规的检测机构进行检测。
4.检测结果应有报告,包括检测方法、结果、误差范围、检测标准等信息。
四、土壤样品采集、处理和检测注意事项1.避免污染土壤样品容易受到化学污染和物理污染的影响。
为避免污染,需要使用干净、无污染的采样工具,避免有色散、污染等情况。
此外,在采样前,应确认承重层的深度和类型。
2.避免干扰因素在采样过程中,需要注意避免干扰因素的影响。
例如,避免挖掘工具及人员践踏采样点周围的土壤;避免零星采集等情况。
3.不同类型土壤样品的处理方法不同类型土壤的处理方法也不尽相同。
例如,对于含有机质的土壤样品,在采集后应尽快进行处理和检测,以防止有机物被微生物降解等情况。
对于聚苯乙烯、石棉等不透明样品,在处理之前应先将其浸泡在水中,或使用旋转分离器等方法,以分离样品和土壤颗粒。
4.注意样品处理的时间在处理之前,必须尽快进行,以避免样品质量的损失。
土壤肥料学实验实验一土壤样品的采集与处理土壤样品(简称土样)的采集与处理,是土壤分析工作的一个重要环节,直接关系到分析结果的正确与否。
因此必须按正确的方法采集和处理土样,以便获得符合实际的分析结果。
实验用具:铁铲、锄头、土壤刀、土壤袋、木槌、研钵、土壤筛(0.25、1、2mm)、卷尺、广口瓶、标签等。
一、土样的采集分析某一土壤或土层,只能抽取其中有代表性的少部份土壤,这就是土样。
采样的基本要求是使土样具有代表性,即能代表所研究的土壤总体。
根据不同的研究目的,可有不同的采样方法。
(一)土壤剖面样品土壤剖面样品是为研究土壤的基本理化性质和发生分类。
应按土壤类型,选择有代表性的地点挖掘剖面,根据土壤发生层次由下而上的采集土样,一般在各层的典型部位采集厚约l0 厘米的土壤,但耕作层必须要全层柱状连续采样,每层采一公斤;放入干净的布袋或塑料袋内,袋内外均应附有标签,标签上注明采样地点、剖面号码、土层和深度。
为了解土壤肥力情况,一般采用混合土样,即在一采样地块上多点采土,混合均匀后取出一部份,以减少土壤差异,提高土样的代表性。
1、采样点的选择选择有代表性的采样点,应考虑地形基本一致,近期施肥耕作措施、植物生长表现基本相同。
采样点5—20 个,其分布应尽量照顾到土壤的全面情况,不可太集中,应避开路边、地角和堆积过肥料的地方。
根据地形、地块大小、肥力等情况的不同,采样点的分布也不一致,一般可采用以下三种方法:(1)对角线采样法适用于地块小、采样点少、肥力均匀、地形平坦、地形端正的地块,图1A;(2)棋盘式采样法适用于地块面积大小中等、采样点较多(约10 点以上)、地势平坦、地形整齐、肥力稍有差异的地块,图1B;(3)蛇形采样法;适用于地块面积大、地势不平坦、地形多变、肥力不均匀的地块,图1C。
A B C图1 采样点的分布方法2、采样方法:在确定的采样点上,先用小土铲去掉表层3 毫米左右的土壤,然后倾斜向下切取一片片的土壤(见图2)。
浅谈微生物样品的采集及送检微生物是指单细胞或多细胞的微小生物,包括细菌、真菌、病毒、原虫等。
随着微生物学的发展,微生物的应用越来越广泛,如医学、农业、环境监测、食品安全等领域。
对于微生物样品的采集和送检,涉及到以下几个方面的问题:1. 采样现场微生物样品的采集现场有很多,如空气、土壤、水体、植物、动物等。
在采集微生物样品前,需要了解该样品所处环境的特点和微生物的种类分布情况,选择合适的采样方法和工具,在采样时要注意不污染样品,避免环境变化对样品的影响,确保采样的合理性和可靠性。
2. 采样方法针对不同类型的微生物样品,采样方法也有所不同。
比如,采集空气样品可以使用活性贴膜法、空气捕集器等;采集土壤样品可以使用土样钻、土样铲等;采集水体样品可以使用自动水质监测仪、自流水采样器等。
在采样前需要了解采样方法和采集工具的使用方法,避免因操作不当而导致样品污染或采集不到样品等问题。
3. 保存和运输采集好的微生物样品需要及时保存和运输,以免样品失活或受到污染。
一般情况下,常用的保存方式有低温冷冻、冰冻干燥、稀释液保存等。
在运输过程中,需要注意保持样品的稳定性和完整性,避免外部环境对样品的影响。
同时,还需要标注样品的采集时间、采集地点、采集人员和采集方法等详细信息,以便后续分析的参考。
4. 检测方法检测微生物样品的方法也有很多,如细胞计数法、PCR法、ELISA法、肉眼观察等。
在选择检测方法时,需要考虑样品类型、检测目的和检测灵敏度等因素。
同时,还需要合理确定检测指标和参考值,以便对检测结果进行分析和判断。
总之,采集和检测微生物样品是一个复杂的过程,需要根据具体情况合理选择采样方法和检测技术,保证采样过程的规范和标准,避免样品污染和假阳性结果的出现,从而保证检测结果的准确性和可靠性。
土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法土壤酶活性测定取样工具及取样方法在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15cm处的土约10g,盛入清洁的牛皮纸袋或者塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。
土样在自然条件下烘干装入袋中备用。
所需试剂:酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵[(NH4)2SO4]、甲苯、苯磷酸二钠、NaAc.3H2O、HAc、酚、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、、配置方法:铵态氮标准溶液:称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中,再加水稀释至1000mL,此溶液1mL含100µg N。
往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度,制备成的溶液在490nm下比色,并绘制标准曲线。
醋酸缓冲液:PH5.0,NaAc.3H2O50g,溶于适量水中,加6mol/LHAc34ml,稀释至500ml。
硼酸缓冲液:PH9.0,80毫升0.05mol/l硼砂(Na2B4O7.10H2O)与0.2mol/l的硼酸混合。
纳氏试剂:将碘化钾10g溶于10ml水中,边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱与水溶液,直至生成的红色沉淀不再溶解为止。
加入氢氧化钾30g并溶解之,再加入氯化汞饱与溶液1ml,加水至200ml。
静置,取上层清液,贮于棕色瓶中酚的标准溶液:(1)原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升,溶液在暗色中稳固,(2)工作液—取50ml原液稀释至1升(1ml含0.05mg酚);分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容(分别相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚),待颜色稳固后,570nm比色绘制标准曲线。
测定方法磷酸酶活性测定一、试验原理土壤中的磷,很大部分以有机磷化合物的形式存在。
微⽣物取样⽅法⼤全随着⾼通量技术的发展,我们对微⽣物的认识逐步深⼊,微⽣物在临床以及科研上的应⽤越来越多,⽽微⽣物采样的正确与否直接关系到微⽣物数据的准确性。
因此,微⽣物的采样⽅法就显得格外重要。
⾸先,我们需要在取样的过程中,注意以下⼏个⽅⾯:(1) 所有实验⽤到的取样⽤具必须是经过灭菌的(如样品袋、取样器、采⾎管、试管、铲⼦、匙、⼑类⼯具等)。
(2) 收集样品信息,取样前或取样后应在盛装样品的容器或样品袋上⽴即贴上标签,每件样品必须标记清楚(例如品名、来源、数量、取样地点、取样⼈及取样⽇期等)。
(3) 请尽量将样本分装 3-5 份备份;建议每组取 6 个及以上重复较为合适,⾄少 3 个重复。
(4) ⽤到⾕⽲取样管的实验样品,可以常温运输;如果不⽤取样管,则必须低温-80℃保存,保存期间切忌反复冻融;低温寄送时请将样品置于泡沫箱中,⽤⼲冰寄送。
然⽽样品种类繁多,不同的样品取样有不同的⽅案,下⾯详细介绍每类样品对应的取样⽅案。
环境微⽣物普通⼟壤(1) 去除表⾯浮⼟、凋落物等,根据⼟壤情况,选择是否过2mm筛⽹,每个样品从3个及以上采样点采集并混合⽽成,建议将样本分装 3-5 份备份;注:采样时需注意每个采样点的取⼟深度及采样量应均匀⼀致,⼟样上层与下层的⽐例要相同。
(2) 保存于⽆菌离⼼管中,置于泡沫箱(冰袋或⼲冰)中,0°C以下运回实验室;(3) 如果条件不允许⽴即提DNA,可将样品置于-80°C冰箱中保存,并通过⼲冰寄送⾄公司后提取样品总 DNA。
根际⼟壤根际,是指受植物根系活动影响,在物理、化学和⽣物学性质上不同于⼟体的那部分微域环境。
部分研究是针对⼟壤微⽣物与植物之间的相互关系,因此需要对根际⼟进⾏取样。
(1) 采集植株,去除根周较松散的⼟,仍附着在根系表⾯的视为根际⼟。
将植物置于装有冰袋或⼲冰的保温箱中,避光条件,0℃以下运回实验室;(2) 准备⽆菌容器,将植物根系部分置于缓冲液(PBS或⽣理盐⽔)中震荡,震荡时间和强度依据样本实际情况调整,洗下根际⼟;(3) 将洗涤液进⾏⾼速离⼼,收集⼟壤沉淀,若沉淀较少,也可过滤膜,同⼀样⽅取样的样本进⾏多点等量混合;(4) 将样本分装⾄离⼼管中,密封,标记样本信息后液氮速冻,置于-80℃冰箱保存,⼲冰寄送。
土壤酶活性及微生物测定配置方法:铵态氮标准溶液:称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中,再加水稀释至1000mL,此溶液1mL含100µg N。
往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度,制备成的溶液在490nm下比色,并绘制标准曲线。
醋酸缓冲液:PH5.0,NaAc.3H2O50g,溶于适量水中,加6mol/LHAc34ml,稀释至500ml。
硼酸缓冲液:PH9.0,80毫升0.05mol/l硼砂(Na2B4O7.10H2O)和0.2mol/l的硼酸混合。
纳氏试剂:将碘化钾10g溶于10ml水中,边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱和水溶液,直至生成的红色沉淀不再溶解为止。
加入氢氧化钾30g并溶解之,再加入氯化汞饱和溶液1ml,加水至200ml。
静置,取上层清液,贮于棕色瓶中酚的标准溶液:(1)原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升,溶液在暗色中稳定,(2)工作液—取50ml原液稀释至1升(1ml含0.05mg酚);分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容(分别相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚),待颜色稳定后,570nm比色绘制标准曲线。
七、八、实验步骤取5克过20目筛的风干土样于50毫升容量瓶中,用0.8(16滴)毫升甲苯处理,15分钟后,加入5毫升苯磷酸二钠溶液(6.75克苯磷酸二钠溶于水,并稀释至1升)和5毫升相应的缓冲液(碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液,中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液,酸性磷酸酶用pH5.0的醋酸缓冲液)。
仔细混合后,将反应物置于37摄氏度恒温箱中培养12小时,然后用蒸馏水定容至刻度,摇匀过滤,用5毫升水代替基质以设置对照。
为了测定反应混合物中的酚量,取1毫升滤液于100毫升容量瓶中,加5毫升硼酸缓冲液(pH9.0),再加入3毫升2.5%的铁氰化钾和3毫升0.5%的4-氨基安替吡啉,摇动,溶液呈粉红色,然后再加水定容,待颜色褪到稳定时(约需20~30分钟),在分光光度计上于波长570纳米处测定溶液的光密度,根据用酚制备的标准曲线查出供试滤液中酚的含量。
分离纤维素分解菌实验操作步骤实验的具体操作步骤如下1.土样的采集土壤中的微生物,大约70%~90%是细菌。
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长,绝大多数分布在距地表约3~8cm的土壤层。
因此,土壤取样时,一般要铲去表层土。
另外,土样的采集要选择富含纤维素的环境,这是因为在纤维素含量丰富的环境,通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。
2.选择培养3.富集培养在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前,先通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度,以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。
富集培养所需要的仪器有:250ml锥形瓶、天平、药匙、玻璃棒、电炉、摇床、玻璃珠、称量纸等。
选择培养基的制备比例见下:纤维素分解菌的选择培养基纤维素粉 5gNaNO31gNa2HPO4•7H2OKH2PO4MgSO4•7H2OKCl酵母膏水解酪素将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000ml按上表比例配制50ml选择培养基。
在250ml锥形瓶中装入50ml培养基,放5~6颗玻璃珠,用8层纱布做成瓶塞,将瓶口塞紧,再在瓶塞外包裹两层牛皮纸,用线绳扎紧,在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
称取土样20g,在无菌条件下加入装有50ml培养基的锥形瓶中。
将瓶置于摇床上,在30℃下振荡培养3~4d,至培养基变浑浊。
4.梯度稀释所需仪器:试管(7支)、移液器、枪头。
需要先经高压蒸气灭菌的仪器:试管(每只内装9ml蒸馏水)、枪头(黄色、蓝色)。
用量程为1000µL的移液管从富集培养土壤液中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀。
然后换枪头从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml 无菌水的试管中,混合均匀,以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液。
5.刚果红染色法分离与观察(涂布平板)所需仪器:无菌培养皿(12个)、涂布器(3个)、移液器、枪头、温箱等。
需要灭菌的仪器:无菌培养皿(12个)、涂布器(3个)、移液器、枪头。
土壤微生物的采集一般有土样采集
、增殖培养、培养分离、筛选最后进行纯种分离、毒性试验等。
1、采样:
一般在有机质较多的肥沃土壤中,微生物的数量最多,中性偏碱的土壤以细菌和放线菌为主,酸性红土壤及森林土壤中霉菌较多,果园、菜园和野果生长区等富含碳水化合物的土壤和沼泽地中,酵母和霉菌较多。
选择一定的土壤环境采集土样,将采集到的土样盛入清洁的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中。
2、增殖培养:
为了容易分离到所需的菌种,让无关的微生物至少是在数量上不要增加,可以通过配制选择性培养基,选择一定的培养条件来控制.例如碳源利用的控制,可选定糖,淀粉,纤维素,或者石油等,以其中的一种为唯一碳源,那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长,而其它微生物就可能死亡或淘汰.这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多.
3、培养分离:
尽管通过增殖培养效果显著,但还是处于微生物的混杂生长状态.因此还必须分离,纯化.在这—步,增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用,而且控制得细一点,好一点.纯种分离的方法有划线分离法,稀释分离法.
4、筛选:
这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件,通过三角瓶的容量进行小型发酵试验,以求得适合于工业生产用菌种.
关于菌种的识别,细菌、放线菌、酵母菌和霉菌,每一类微生物在一定培养条件下形成的菌落各具有某些相对的特征,利用观察这些特征,来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物。
土壤
一般取土壤表层5-10cm处土壤,如果土壤有翻动,应更深一点,避免空气中微生物污染。
1我们一般都用那种封口袋(塑料的),纸袋不容易保持水分。
2当天采当天快递回来,不用加冰袋。
3快递一般三天就到,对微生物菌群影响不大。
4在冰柜中4度保存,时间不要超过一个月,尽量随采随做。
菌株分离(seperation)就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开,并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选,进而得到所需的微生物的过程。
工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分:一是从自然界分离所需要的菌株,二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并迸行代谢产物鉴别。
菌种可从以下几个途径进行收集和筛选:
(1)向菌种保藏机构和个人索取有关的菌株,从中筛选所需菌株。
国内外著名的菌种保藏机构有:中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCCM),美国典型菌种保藏中心(ATTC),英国国家典型菌种保藏所(NCTC),日本的大阪发酵研究所(IFO)等。
(2)由自然界采集样品,如土壤、水、动植物体等,从中进行分离筛选。
(3)从一些发酵制品中分离回的菌株,如从酱油中分离蛋白酶产生菌,从酒糟中分离淀粉酶或糖化酶的产生曲等。
该类发酵制品经过长期的自然选样,具有悠久的历史,从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。
菌株的分离和筛选一般可分为:采样、富集、分离、产物鉴别、生化鉴定几个步骤。
一、从土壤中采样
1克土壤的含菌量大体有如下的递减规律:细菌(108)>放线菌(107)>霉菌(106)>酵母菌(105)>藻类(104)>原生动物(103)(一)根据土壤特点
1.土壤有机质含量和通气状况
采土样最好的上层是5-25cm、一般每克上中含菌数约几十万到几十亿个,并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到。
总的来说酵母菌分布土层最浅,约5-10 cm;霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。
2.土壤的酸碱度和植被状况
3.地理条件:南方、北方
4.季节条件:7-10月
(二)采样方法
用取样铲,将表层5cm左右的浮土除去,取5-25cm处的土样10-25 g,装入事先准准备好的塑料袋内扎好、北方土壤干燥.在10-30cm处取样。
给塑料袋编号并记录地点、土壤土质、植被名称、时间及其他环境条件。
一般样品取回后应马上分离。
以免微生物死亡。
但有时样品较多,或到外地取样,路途遥远,难以做到及时分离,则可采先用选择性培养基做好试管斜面,随身带走。
到一处将取好的土样混匀,取3-4g撒到试管斜面上.这样可避免菌株因不能及时分离而死亡。
二、根据微生物生理特点取样
1.根据微生物的营养类型
每种微生物对碳、氮源的需求不一样,分布也有差异。
若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物,从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品,容易得到满意的效果。
不少微生物对碳源的利用是不完全专一的,如以油脂为碳源的某些脂肪酶产生菌同样也可以分解淀粉获得能源而生长。
2.跟据微生物的生理特性
三、特殊环境下采样1.局部环境条件的影响2.极端环境条件的影响。