紫草宁生物合成途径中的代谢与调控1.背景知识介绍1.1 紫草及紫草宁紫草（学名：Lithospermum erythrorhizon），为紫草科紫草属植物。
又名山紫草、紫丹、紫草根，分布于日本、朝鲜以及中国大陆的辽宁、山西、湖南、甘肃、山东、湖北、广西、四川、陕西、贵州、江西、河北、河南等地，生长于海拔50米至2,500米的地区，多生长在山坡草地，目前尚未由人工引种栽培。
紫草是一种重要的药用植物，其功效是凉血，活血，解毒透疹。
用于血热毒盛，斑疹紫黑，麻疹不透，疮疡，湿疹，水火烫伤。
紫草根部富含红色的萘醌类次生代谢产物——紫草宁及其衍生物。
紫草宁又称紫草素，英文名称：Shikalkin，英文别名：5,8-Dihydroxy-2-(1-hydroxy-4-methylpent-3-enyl)naphthalene-1,4-dione，即5,8-二羟基-2-[(1R)-1-羟基-4-甲基戊-3-烯基]萘-1,4-二酮，结构式如下：紫草宁为赤褐色针状晶体(由苯重结晶)。
熔点149℃。
旋光度-167°±10°(在苯中)。
能溶于普通有机溶剂，以及甘油动植物油脂和碱性水溶液。
难溶于碳酸氢碱溶液。
与氢氧化碱金属作用显蓝色。
由于紫草素具有多种生物学活性，以紫草素为先导化合物开发抗炎、抗肿瘤、抗病毒新药的研究已成为热点课题，除此之外，紫草素还是良好的天然色素，已广泛用于食品、化妆品和印染工业中。
1.2紫草宁及其衍生物的药理作用1.2.1 抗肿瘤活性近年来，紫草次生代谢物的抗肿瘤活性倍受关注。
紫草素能够抑制肝癌肿瘤细胞增殖[1]、诱导生殖系统肿瘤细胞凋亡[2]，并兼具调控机体免疫的功能。
紫草素在体外一定浓度范围内能抑制人白血病Ｋ562细胞增殖，诱导其凋亡。
甲基丙烯酰紫草素具有较好的体内外抗肿瘤作用，作用机制可能与诱导细胞凋亡和抑制NF-zB p50的活性有关[3]。
乙酰紫草素可通过诱导细胞凋亡来抑制胃癌SGC-7901细胞在体内外的增殖[4]。
1.2.2 抗炎活性紫草素能有效减轻由中波紫外线（UVB）引起的表皮角蛋白细胞炎症，起到保护皮肤的作用；还可以减弱小神经胶质细胞的炎症反应，达到保护神经系统的作用。
1.2.3 降胆固醇活性研究发现，从硬紫草根部氯仿提取物中分离出的三种化合物—乙酰紫草素、异丁基紫草素和β-羟基异戊酰紫草素均具有抑制人类酰基辅酶Ａ-胆固醇酰基转移酶-1和人类酰基辅酶Ａ-胆固醇酰基转移酶-2的活性。
酰基辅酶Ａ-胆固醇酰基转移酶是胆固醇生物合成途径的关键酶，乙酰紫草素、异丁基紫草素和β-羟基异戊酰紫草素通过抑制该酶的活性，从而达到降低胆固醇含量，防治动脉粥样化的目的。
紫草的药理作用除了上述内容之外，还有降血糖活性，抗生育、抗免疫缺陷、抗凝血、保肝护肝、抗前列腺素生物合成、抗菌及清除活性氧作用等。
1.3紫草及紫草宁的市场紫草是我国传统中药材，多家中药饮片厂以紫草为主要原料研制开发生产了约500多种（规格）中成药、特药、新型中药，以及几十种中药饮片。
这些产品投入市场后很受消费者欢迎，销量增加，对紫草的需求量也随之逐年大幅攀升。
据不完全统计，紫草需求量2000年为100吨，2002-2004年增长至200-500吨，2005-2007年增长至700-1000吨，2008-2009年又增长至1100-1300吨，2010年已增长至1400吨左右。
2010年的市场用量是世纪初叶的14倍，创下历史新高。
预测今年市场用量将超过1500吨。
然而市场提供的紫草几乎完全是野生品。
由于大规模地滥采乱挖，已造成野生资源枯竭，从2001年起野生紫草资源呈逐年减少之势。
据不完全统计，2001年野生紫草产量为3000-4000吨左右，2002-2003年下降至1000-1500吨左右，2 006年再降至800吨左右，2009-2010年已降至500吨左右。
资源的匮乏抬高了紫草及其提取物的价值，在国际市场上，紫草提取物价格高达每公斤7000美元。
2.紫草宁的生物合成2.1植物组织培养技术植物组织培养概念又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
组织培养能够快速繁殖某些稀有植物或有较大经济价值的植物，利用植物组织培养技术培养紫草细胞来得到紫草素，便是成功的例子。
2.2紫草宁的生物合成途径紫草素及其衍生物的主要生物合成过程是先由两类重要的代谢，即苯丙素类代谢和甲羟戊酸代谢分别形成两个重要的中间前体—对羟基苯甲酸（PHB）和香叶基焦磷酸（GBB），然后由对羟基苯甲酸香叶基转移酶催化及其它代谢酶的级联反应合成的。
该次生产物最初在内质网中形成，然后通过胞外分泌作用将紫草素微粒运输到细胞壁中[5]。
两个前体物质—对羟基苯甲酸（PHB）和香叶基焦磷酸（GBB ）的生物合成分别如下[6][7]：苯丙氨酸丙氨酸脱氨酶（PAL ） 反式肉桂酸 肉桂酸-4-羟化酶（C4H ）4-香豆酸 4-香豆酸辅酶A 连接酶（4CL ）4-香豆辅酶A对羟基苯甲酸（PHB PHB-O-Glu乙酰辅酶A乙酰辅酶A 硫解酶（AACT ）+ HMG-CoA 合成酶（HMGS ） β-羟基，β-甲基戊二酰辅酶A （HMG-CoA ）HMG-CoA 还原酶（HMGR ）甲羟戊酸（MV A ）焦磷酸化、脱羧 IPP二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP ），焦磷酸香叶酯合成酶 GPP在紫草宁的生物合成过程中，由对羟基苯甲酸香叶基转移酶作用，将甲羟戊酸代谢途径形成的GPP的香叶酯基转移到来自丙氨酸代谢产物PHB上，形成香叶基-对羟基苯甲酸（GBA），该化合物是生成紫草宁及其衍生物的前几部反应中的重要前体，由它经过几步酶联反应便生成目标产物，其完整步骤整理如下（由文献整理所绘）：3.紫草宁的代谢与调控目前，不但基本清楚了紫草宁生物合成代谢的途径，而且还从紫草培养细胞中分离和鉴定了一些与紫草宁合成相关的代谢酶和基因，开展了紫草宁生物合成的毛状根转基因培养体系以及改变或修饰紫草宁生物合成代谢途径、代谢酶基因等的代谢工程研究。
本文将结合这些研究成果，介绍一些与紫草宁生物合成相关的代谢酶和基因的功能和表达特性，以及在实际生产中，是怎样对紫草宁及其次生药物进行生产调控的。
3.1 代谢工程概念代谢工程是基因工程的一个重要分支，利用重组DNA为主的技术，操纵酶的转移和细胞调节功能，定向改造基因组结构，重新设计细胞的代谢系统，达到生物体内改变代谢流，扩展代谢途径和构建新的代谢途径的目的。
在植物次生代谢产物的代谢工程中以毛状根转化体系应用较多，离体培养的毛状根中代谢酶基因表达特性和次级产物代谢调控具有与培养细胞基本一致的特点。
毛状根培养系统的应用已非常广泛，如：培养长春花毛状根可以生产长春花碱；人参毛状根生产人参皂苷等，不仅如此，这种明显优于植物组织培养的技术也成功运用于紫草宁的生产，即利用紫草毛状根生产紫草宁[8]。
通过Ri质粒的转化获得的紫草毛状根，与紫草植株的根一样能产生和分泌紫草宁色素，且与紫草细胞保持生产调控的一致性，故毛状根为紫草宁代谢工程及开展基因功能和其它分子生物学领域的研究奠定了基础。
3.2毛状根毛状根是指整体植株或某一器官、组织（包括愈伤组织）、单个细胞，甚至原生质体受到发根农杆菌的感染所产生的一种病理现象，是细胞中质粒的T-DNA插入寄主细胞核基因组而得到的表现型，主要是在感染部位上或附近能产生大量的副产物-毛状根。
目前，它已广泛应用于植物基因工程、植物次生代谢产物生产、植物品种改良和植物栽培等领域。
在药用植物方面，以发根农杆菌m 质粒转化植物产生的毛状根建立离体培养系统，实现次生代谢物质的工业化生产，来解决中药资源的短缺问题，越来越受到人们的重视。
相对于常规细胞培养和组织培养，毛状根培养系统具有生长快速、不需外源植物激素、合成次生代谢物质能力强而且稳定，并能向培养液释放部分代谢产物等优点，通过改变培养条件，毛状根甚至可以合成比原来植物中高出数倍的活性物质，以及原来植物所不含有的活性成分。
3.3紫草宁生物合成关键的代谢酶紫草宁生物合成代谢途经中的关键酶已用红笔标出（请见上图）。
3.3.1 苯丙氨酸脱氨酶（PAL）苯丙氨酸脱氨酶是苯丙素类代谢途径中的起始代谢酶，它将苯丙氨酸催化生成反式肉桂酸，PAL基因在植物中以基因家族形式存在，科学家从紫草培养细胞中分离到两个编码PAL的cDNA克隆。
这两个基因主要在形成紫草宁的紫草植株的根部表达。
光照和茉莉酸甲酯能促进紫草培养细胞中的PAL基因的表达[9]。
3.3.2 4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）4-香豆酸辅酶A连接酶也是植物苯丙素类代谢中的重要酶。
4CL 将4-香豆酸转换成4-香豆酸辅酶A,该化合物再经不同的代谢途径可以生成木质素、类黄酮和香豆素等酚类产物, 但在紫草细胞中则形成重要的中间产物PHB。
从紫草细胞中分离到该基因的两个cDNA克隆,LE4CL-1和LE4CL-2，光照能显著增加它们的表达水平[10]。
3.3.3 甲戊二羟酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）紫草宁的部分碳骨架来自于异戊二烯代谢途径，而HMGR是代谢途径中起初的反应酶。
该酶催化甲戊二羟酸单酰辅酶A还原为MVA，然后经反应生成另一重要的中间产物GPP（见生物合成途径）。
该酶与紫草宁的形成密切相关，是一个重要的调节酶。
光照强烈抑制HMGR基因在紫草培养细胞中的表达，因此光照也强烈抑制紫草宁的形成[11]，可见HMGR基因的表达调控对紫草宁的形成具有重要的调节作用。
3.3.4 对羟基苯甲酸香叶基转移酶（PGT）对羟基苯甲酸香叶基转移酶是紫草细胞培养紫草宁形成代谢中的一个至关重要的代谢酶，它将GPP的香叶基转移到PHB上而形成GBA，最终反应生成紫草宁及其衍生物，增加或是减少它的活性直接影响到紫草宁的生产，故在紫草宁形成的调控中起着重要的作用。
科学家分离到两个PGT的cDNA 克隆，LePGT-1和LePGT-2，这两个基因只在紫草植株根中表达，而且特异地以GPP为代谢底物。
寡糖和MeJA能增加培养基中紫草细胞PGT基因表达和PGT活性，而光照却强烈抑制该基因的表达和PGT活性[10]，以及紫草宁的形成，暗培养则显著增强他们的表达。
在紫草培养细胞中, PGT基因的表达模式与其酶活性变化和紫草宁的形成具有高度的一致性，可见 PGT 基因的表达水平对紫草宁形成调控的重要性。
3.3.5 小结以上四个酶是对紫草宁生物合成代谢影响最大的四个酶。
前三个酶PAL、4CL和HMGR作用于两个组成单元（PHB、GBB）的形成，最后一个酶PGT作用于构建单位的连接。
这四个酶的活性及其基因表达的强弱都受到光照的影响，我认为是这些基因在光照或避光条件下差异表达的结果。
