生物大分子提取技术 ppt课件

▪ 越快速越好。
4、收率：
5、速度：
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DNA的提取纯化
• 本质：将DNA从组织或细 胞中分离沉淀出来。
• 要求：去除杂蛋白、多糖、 脂类等大分子杂质，同时 要快速简便。
• 常用的提取方法： 酚-氯仿提取法
盐析法 高温裂解法 固相吸附洗脱法 碘化钠提取法 磁珠分离法
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举例:外周血DNA提取的方法步骤
1. 1、标本预处理：
2. 1ml EDTA抗凝贮冻血于室温解冻后移入5ml离心管中，加 入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500g离心15min, 倾去上清。重复一次。用0.7ml DNA提取液混悬白细胞沉 淀，37℃水浴温育1h。
3. 2、消化：
4. 上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入 1mg/ml蛋白酶K 0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动 混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋 白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。 25
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五、分离纯化
• 从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净的，含有大量杂质，必
须进一步分离纯化，这一阶段可分为粗分级分离和细分级分离两
步进行。
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核酸分离纯化的一般程序
破碎细胞或组织 提取 纯化
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核酸提取技术
• DNA提取技术
原理、方法、应用
• RNA提取技术
原理、方法、应用
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核酸提取的要求
▪ 其中前两个阶段为生物大分子 分离纯化的前处理。
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一、材料的选择与预处理
• 选材，科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到 实验目的即可。临床选材则要考虑病人的依从性。
• 预处理，如动物材料需要除去一些与实验无关的 结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生 物需要将菌体与发酵液分开。若不立即进行实验 或加工，应冷冻保存。
担负着生物催化、物质运输、运动、防御、生长调 控以及记忆、识别等多种生理功能。
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核酸-DNA与RNA结构
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脱氧腺嘌呤核苷A
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A-T对
G-C对
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5’C G A A TCAGAA3’ 3’G C T T AGTCTT5’
双链DNA
高级结构
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核酸的性质
• DNA:双螺旋; RNA单链
带电性-----电泳 水溶性------溶液 变性、复性-------分子杂交 光吸收性质-------浓度\纯度测定 DNA增色效应------TM值测定
❖ 植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等 物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取 液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目 的。
❖ 细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨 架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子， 非常坚韧。破碎的方法常有超声波、与石英砂研磨、 高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。
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桂花赞
• 几度风雨一场凉 • 人间迎来桂花芳 • 银桂周身亮繁星 • 丹桂浓妆新嫁娘 • 枝头鸟雀絮絮赞 • 树下骚客搜枯肠 • 清风淡云圆月下 • 乾坤万里共清香
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生物大分子分离纯化的意义
①生命科学研究的需要：
从生物材料中分离制备核酸、蛋白质，研究其结构与功能，对 于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。
聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同
速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离
心后，即可获得所需组分。
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四、提取
• 将组织细胞破碎，使目标分子被释放出来，并将 其与其它细胞成分分离, 这就是提取。
• 在此过程中，必须立即将细胞匀浆液置于一定条 件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保 持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备物 的分解破坏，
②医学检验需要：
是分析标本中包含的分子信息的前提条件，对于精确诊断疾病 具有重要意义。
③医疗实践的需要：
如用胰岛素治疗糖尿病。
④基因工程的需要：
基因工程疫苗和药物。
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中心法则
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• 核酸、蛋白质（酶）是重要的生物大分子
存在于一切生物体中
• 核酸是遗传信息的携带者
在有机体内指导各种蛋白质的合成。
• 蛋白质是生物功能的执行者
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二、组织细胞的破碎
• 应选择适当的方法将组织和细胞破碎，生物大 分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放 出来，并保持原来的天然状态和生物活性。
• 但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外 的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。
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组织细胞的破碎方法
❖ 一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或 用超声波处理破碎。
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三、细胞器的分离
细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞 还有叶绿体。
如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了 防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需 先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。
采用差速离心法分离细胞器，即将破碎后的细胞在适当的
介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、
3. 酚抽提纯化DNA：
冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至 水相与酚相混匀成乳状液。5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘 稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿﹕异戊醇 （24﹕1），上下转动混匀，5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘 稠水相，移至另一离心管中。重复一次。
4. 沉淀DNA：
加入1/5体积的3mol/L NaAc及2倍体积的冷无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即 有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5 ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，5000g离心5min洗涤DNA，弃上清。重复 一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液适量溶解 DNA ，DNA完全溶解通常需12-24小时。 26
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蛋白质结构
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蛋白质性质
双带电性-----电泳\等电点 水溶性\脂溶性------溶液 分子间识别-------抗原抗体反应 光吸收性质-------浓度\纯度测定 变性
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生物大分子分离纯化的一般程 序
①材料的选择和预处理
②破碎细胞及提取（有时还需 要进行细胞器的分离）
③分离纯化：包括粗分级分 离和细分级分离
1、纯度：
▪ 主要取决于研究的目的和应用上的要求。如用于基因扩增的模板DNA纯度 要求较低，而用于治疗的DNA则纯度要求很高。
▪ 大分子完整度越高越好。
▪ 要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。
2、完整度： ▪ 希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越
多，损失越大。
3、活性：