OK-432肿瘤细胞疫苗对荷瘤小鼠B细胞免疫效应的影响

OK432（冻干粉）
作用机理：
OK432 是冷冻干燥制成的菌苗，OK432 激活的中性粒细胞能够杀死 IFN-γ或者 TNF-α处理的癌细胞。

OK432 诱导的中性粒细胞对自体癌细胞的杀伤作用通过 CD11b/CD18 和 ICAM-1 之间的反应实现的。

OK432诱导的单核细胞能够杀死自体癌细胞。

OK432刺激淋巴细胞后，显示出 LAK细胞活性，这种激活的淋巴细胞甚至对抗 NK 细胞的癌细胞都显示出活性。

规格参数：
货号：TL-107 规格：100ug/500ug 活性：1KE/5KE
产品信息：
纯度：>98%
性状：白色疏松体
保存温度：2-8℃
有效期：24 个月
生产厂家：同立海源生物
使用说明：
如需分装，可用注射用水、生理盐水、培养基或 PBS稀释，稀释后浓度保持在 100ug/mL以上。

稀释后置于-20℃保存期 6个月，-80℃保存期 12个月。

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NK细胞培养试剂盒、NKT细胞培养试剂盒、CIK细胞扩增试剂盒、CD3单抗、CD16单抗、CD28单抗。

ＳｔｒａｉｔＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌＶｏｌ３３Ｎｏ ３２０２１ＯＫ ４３２联合聚肌胞诱导小鼠树突状细胞成熟及其抗损伤作用王　静１，倪秀雄２ ，林　岷２，姚　琦２，曾　真２，陈　炜２（１ 厦门市中医院病理科，福建厦门３６１００９；２ 福建医科大学生理学与病理生理学系，福建福州３５０００４）摘要：目的　比较体外单独或联合应用ＴＬＲ配体 沙培林（ＯＫ ４３２）、聚肌胞对树突状细胞（ＤＣｓ）成熟状态的影响，并将ＤＣｓ与小鼠前胃癌细胞上清液共培养，检测ＤＣｓ存活率，探讨ＯＫ ４３２联合聚肌胞对小鼠前胃癌细胞上清液诱导树突状细胞损伤的保护作用及机制。

方法　采用重组小鼠粒 巨噬细胞集落刺激因子（ｒｍＧＭ ＣＦＳ）联合重组小鼠白细胞介素 ４（ｒｍＩＬ ４），诱导小鼠骨髓源性的单个核细胞分化为未成熟的ＤＣｓ（ｉｍ ＤＣｓ），分别经ＯＫ ４３２、聚肌胞或ＯＫ ４３２联合聚肌胞诱导ＤＣｓ成熟，未成熟或成熟的ＤＣｓ分别与不同浓度的小鼠前胃癌细胞上清液共培养２４ｈ。

电镜及光镜观察ＤＣｓ的细胞形态变化，流式细胞仪检测ＤＣｓＣＤ８３和ＣＤ８６的表达情况，ＥＬＩＳＡ法测定上清液中ＩＬ １２的分泌水平，ＭＴＴ法测定ＤＣｓ体外刺激同种混合淋巴细胞增殖的免疫活性以及ＤＣｓ与不同浓度小鼠前胃癌细胞上清液共培养２４ｈ后的活性，免疫组化法检测ＤＣｓ锌指蛋白Ａ２０（Ａ２０）的表达水平。

结果　联合刺激组ＤＣｓ的形态学，表面抗原ＣＤ８３和ＣＤ８６的表达率，ＩＬ １２的分泌量及刺激淋巴细胞增殖的能力均显著高于其它处理组；小鼠前胃癌细胞上清液能损伤ＤＣｓ，联合刺激组ＤＣｓ的成活率均高于其它处理组，且其成活率与Ａ２０蛋白的表达量成正比。

结论　ＯＫ ４３２联合聚肌胞能有效诱导ＤＣｓ成熟；ＯＫ ４３２联合聚肌胞对小鼠前胃癌细胞上清液诱导树突状细胞的损伤有保护作用，其机制与上调Ａ２０蛋白表达增高有关。

关键词：树突状细胞；ＯＫ ４３２；聚肌胞；锌指蛋白Ａ２０；小鼠前胃癌中图分类号：Ｒ９６５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００６ ３７６５（２０２１） ０３ ００２５ ０５ＥｆｆｅｃｔｏｆＯＫ ４３２ａｎｄＰｏｌｙＩ：ＣｏｎｍａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅＤｅｎｄｒｉｔｉｃＣｅｌｌｓａｎｄＡｇａｉｎｓｔＩｎｊｕｒｙＷＡＮＧＪｉｎｇ１，ＮＩＸｉｕ ｘｉｏｎｇ２ ，ＬＩＮＭｉｎ２，ＹＡＯＱｉ２，ＺＥＮＧＺｈｅｎ２，ＣＨＥＮＷｅｉ２（１ ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，ＸｉａｍｅｎＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｘｉａｍｅｎ３６１００９，Ｃｈｉｎａ；２ ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＰａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＦｕｊｉａｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ３５０００４，Ｃｈｉｎａ）ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＯＫ ４３２ａｎｄＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）ｏｎｔｈｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆｍｕｒｉｎｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓａｎｄｃｏ ｃｕｌｔｕｒｅｗｉｔｈｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓｏｆＭｏｕｓｅｆｏｒｅｓｔｏｍａｃｈｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＭＦＣ） ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆＯＫ ４３２ｉｎａｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈＰｏｌｙＩ：ＣｏｎＤＣｓａｇａｉｎｓｔｉｎｊｕｒｙａｎｄｔｏｓｐｅｃｕｌａｔｅｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａ ｎｉｓｍｏｆｔｈｉｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ＭＥＴＨＯＤＳ　ＴｈｅｉｍｍａｔｕｒｅＤＣｓｗｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｆｒｏｍｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｏｎｏｃｙｔｅｓｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｍｏｕｓｅＧＭ ＣＳＦａｎｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｍｏｕｓｅＩＬ ４ ＴｈｅｓｅＤＣｓｗｅｒｅｔｈｅｎｐｕｌｓｅｄｓｅｐａｒａｔｅｌｙｗｉｔｈＯＫ ４３２ａｎｄＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）ｏｒｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ＤＣｓｗｅｒｅｃｏ ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＭＦＣｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓｆｏｒ２４ｈｏｕｒｓ ＭｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｓｏｆＤＣｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＤＣｓｓｕｒｆａｃｅｍｏｌｅｃｕｌｅｓＣＤ８３ａｎｄＣＤ８６ｗｅｒｅａｓｓａｙｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ＴｈｅＩＬ １２ｌｅｖｅｌｓｉｎｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｗｅｒｅａｓｓａｙｅｄｂｙＥＬＩＳＡ Ｔｈｅａｐ ｐｅａｒａｎｃｅｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｃｏ ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈＭＦＣｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓｆｏｒ２４ｈｏｕｒｓｕｎｄｅｒｏｐｔｉｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＡｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇａｂｉｌｉｔｙｏｆＤＣｓｉｎａｌｌｏ ＭＬＲａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆＤＣｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＭＴＴａｓｓａｙ ＺｉｎｃｆｉｎｇｅｒｐｒｏｔｅｉｎＡ２０（Ａ２０）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＤＣｓｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ＲＥＳＵＬＴＳ　ＴｈｅＤＣｓｐｕｌｓｅｄｗｉｔｈＯＫ ４３２ａｎｄＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）ｓｈｏｗｅｄｔｙｐｉｃａｌｌｙｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｓ，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｕｃｈｍｏｒｅａｎｔｉｇｅｎｓＣＤ８３ａｎｄＣＤ８６ｏｎｔｈｅｓｕｒｆａｃｅ，ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆＩＬ １２ａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｔｈａｎＤＣｓｗｉｔｈｏｔｈｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ；ＴｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓｏｆＭＦＣｃｏｕｌｄｉｎｄｕｃｅｄｔｈｅｄａｍａｇｅｏｆＤＣｓ ＩｎｃｒｅａｓｅｄｌｅｖｅｌｏｆｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅａｎｄＡ２０ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅｕ ｎｉｏｎｇｒｏｕｐｏｆＤＣｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄ ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ　ＯＫ ４３２ｉｎａｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）ｃａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｉｎｄｕｃｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎＤＣｓ；ＯＫ ４３２ｉｎａｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）ｃａｎｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆＤＣｓ，ｗｈｉｃｈｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡ２０ｐｒｏｔｅｉｎＫＥＹＷＯＲＤＳ：Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ；ＯＫ ４３２；Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）；Ａ２０；ＭＦＣ作者简介：王　静，女，硕士研究生，主治医师。

〖综述·讲座〗OK432治疗脑胶质瘤研究进展赵长地1,　孔姣2,　聂振明21.新疆喀什地区第一人民医院神经外科,新疆喀什8440002.济宁市第一人民医院,山东济宁272111Advances in treatment of cerebral glioma with OK 432ZHA O Chang -di ,KO NG Jiao ,NIE Zhen -ming1.Neu rosu rgical Dep artment ,First People 's Ho spital o f Kashi Distr ict ,Kashi 844000,P .R .China2.First People 's H osp ital of Jining City ,Jining 272111,P .R .China【摘要】　OK432(picibanil )及OK432激活的外周血单核细胞(OK -432-activated mon onuclear cells ,OK -MCS )作为免疫赋活剂,具有较强的抗肿瘤活性。

选择手术切除并经过放、化疗的脑胶质瘤患者,采取瘤腔内注射给药,可激活T 细胞、LAK 细胞、嗜中性粒细胞及巨噬细胞等,并可诱发出细胞毒因子(tumor necrosis factor ,TNF ),从而产生杀伤瘤细胞的作用。

基因水平研究亦显示有瘤细胞凋亡的发生。

临床应用不良反应轻微、患者耐受性好,并可减轻或对抗放、化疗引起的白细胞减少及骨髓抑制等不良反应,具有一定的临床效果,可作为脑胶质瘤治疗的一种方法。

肿瘤防治杂志,2004,11(11):1210-1212[ABSTRACT ]　OK432and OK -Mcs activated by OK432have obvious antineoplastic activity as immune -excipient .The patients with the combination of postoperation ,postirradiation and chemotherapy are treated with OK432into the tumor cavity .The T cell ,LAK cell ,neutrophilic cell and macrophage may be activated and TNF may be evocated ,then making killing tumor activity .Apop -tosis of tu mor cell is observed throu gh genes study .The side effects are mild and patient 's toleration is well .The theraphy may re -duce the side effect caused by radiotherapy and chemotherapy ,so it is an effective method to cerebral glioma .Chin J C anc er Pre v Tre at ,2004,11(11):1210-1212【关键词】　抗肿瘤药;脑肿瘤;神经胶质瘤;综述文献[KEYWORDS ]　antineoplastic agents ;brain neoplasms ;glioma ;reviewliterature【中图分类号】　R739.41 【文献标识码】　A 【文章编号】　1009-4571(2004)11-1210-03 OK432(picibanil )是β溶血性链球菌SIPI722低毒株菌种,经青霉素处理制成的免疫赋活剂,是目前发现的生物调节剂中作用最强的药物,具有较强的抗肿瘤活性。

doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2024.01.013·论著/中医中药与免疫·基于IL-17/NF-κB信号通路探讨敦煌医方大补脾汤联合奥沙利铂对胃癌荷瘤小鼠炎症免疫的影响曾元丁苏韫龚红霞牛世伟张晗（甘肃中医药大学基础医学院，甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室，兰州 730000）中图分类号R285.5 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2024）01-0092-05［摘要］目的：研究敦煌医方大补脾汤对胃癌荷瘤小鼠的抑瘤作用以及基于IL-17/NF-κB信号通路探讨大补脾汤联合奥沙利铂对胃癌荷瘤小鼠炎症免疫的影响。

方法：建立MFC胃癌皮下荷瘤小鼠模型，随机分为模型组、奥沙利铂组、大补脾汤高、中、低剂量联合奥沙利铂组［21.58、10.79、5.40 g/（kg·d）］，每组10只，雌雄分笼饲养，接种8 d后开始给药，连续给药14 d；末次给药后次日眼球取血，处死小鼠，摘取肿瘤组织称重，计算抑瘤率；ELISA检测小鼠血清IL-17和IL-6含量，免疫组化（IHC）、RT-qPCR和Western blot分别检测小鼠肿瘤组织IL-17、IL-6、NF-κB和pNF-κB mRNA和蛋白表达。

结果：奥沙利铂组、大补脾汤高、中、低剂量联合奥沙利铂组抑瘤率分别为33.02%、52.92%、46.33%和39.52%，各给药组肿瘤质量均较模型组显著降低（P<0.01），大补脾汤高、中、低剂量联合奥沙利铂组显著高于奥沙利铂组（P<0.01）；与模型组相比，各给药组血清IL-17和IL-6含量、肿瘤组织IL-17、IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65 mRNA和蛋白表达显著降低（P<0.01，P<0.05）；与奥沙利铂组相比，大补脾汤高、中剂量联合奥沙利铂组血清IL-17和IL-6含量、肿瘤组织IL-17、IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65 mRNA和蛋白表达显著降低（P<0.01，P<0.05）。

谈肿瘤疫苗的作用机制及研究进展摘要：一直以来，对于肿瘤的治疗多采用手术，放疗和化疗三大常规方法. 一百多年前，Caley用细菌疫苗免疫机体时，观察到肿瘤缩小. 此后人们认识到肿瘤可以诱发免疫反应，而机体免疫系统对肿瘤也具有监视作用. 肿瘤疫苗的产生正是基于这种认识，运用增强肿瘤特异性抗原的免疫原性的基本方法，诱发机体的抗肿瘤免疫应答，以达到缩小和消除肿瘤的目的.关键词：肿瘤；肿瘤免疫；肿瘤疫苗1肿瘤特异性免疫机制及肿瘤的免疫逃逸机制肿瘤在机体内能引发体液免疫应答和细胞免疫应答，而以后者为主. 肿瘤抗原在细胞内加工成肽段后与细胞表面的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)类分子结合并呈递给CD8+细胞毒性T淋巴细胞，或先从肿瘤细胞上脱落，再由抗原提呈细胞摄取、加工成肽段后与表面MHC类分子结合并呈递给CD4+辅助性T淋巴细胞，进而诱发机体的抗肿瘤细胞免疫应答. 值得注意的是CD4+ T淋巴细胞和CD8+ T淋巴细胞的激活都需要MHC抗原肽复合物和免疫共刺激分子的协同刺激作用［1］，而共刺激分子的缺失正是肿瘤引发的机体外周免疫耐受的可能机制之一. 肿瘤由于其极大的异质性和遗传不稳定性，在机体环境长时间的免疫选择压力下，会启动一系列的免疫逃避机制，对抗机体的抗肿瘤免疫反应. 这些机制分别针对T细胞对肿瘤的识别阶段和效应阶段，包括肿瘤抗原的丢失、MHC类分子表达下调、抗原加工缺陷、表达干扰细胞毒作用的蛋白酶及表达FasL等［2］.2肿瘤疫苗的设计策略2.1总体思路针对肿瘤抗原在机体内免疫原性下降，造成特异性细胞免疫激活不足，外周免疫耐受的状况，肿瘤疫苗设计策略的总体思路是应用各种技术，增强免疫系统对肿瘤抗原的识别能力，改善免疫微环境，引发有力的特异性抗肿瘤细胞免疫，阻止肿瘤进展，最终消除肿瘤.2.2肿瘤细胞疫苗肿瘤细胞疫苗是将整个肿瘤细胞作为抗原导入患者体内，诱导特异性的抗肿瘤免疫应答. 由于肿瘤细胞带有肿瘤的全部抗原，无需考虑分离肿瘤特异性抗原（tumor specific antigen, TSA），而且由于自体肿瘤细胞具有和正常组织相同的人类白细胞抗原，不会引发机体的免疫排斥反应，因此被认为是理想的肿瘤疫苗方案. 但是自体肿瘤组织来源十分有限，并且考虑到TSA的表达具有一定的组织特异性，因此这种方法的应用受到了限制［3］. 后来，人们开始使用人工培养的同种异体肿瘤细胞系进行肿瘤疫苗的研究. 不同肿瘤细胞的混合能够提供一系列的TSA，有利于增加肿瘤疫苗的免疫原性，减小其发生抗原丢失的几率［2］. 但是，单独使用自体或异体的肿瘤细胞难以产生足够强度的免疫应答，免疫佐剂的使用极大地改善了这种情况. 随着基因工程的进展，人们开始对肿瘤细胞进行基因修饰，将编码免疫共刺激分子如CD80，CD86的基因，导入肿瘤细胞中，为T细胞活化提供第二信号，有效地打破了肿瘤的外周免疫耐受. 近年来，也有人将编码一些细胞因子如IL2， IL12，粒巨噬细胞集落刺激因子（granulocytc macrohage colony stimulatihy factor,GM CSF）等的基因导入肿瘤细胞，期望通过细胞因子蛋白的表达，改善肿瘤组织局部免疫微环境，增强T细胞的抗肿瘤免疫效应［4］. 然而，近些年来临床实验表明，即使在实验中能够诱发满意免疫反应的肿瘤细胞疫苗，在转化成临床有效的治疗性肿瘤疫苗时都遇到了困难. Fifis等［5］的研究发现，大鼠结肠癌细胞系经体外培养后免疫同源小鼠，引发了免疫反应和肿瘤保护效应. 然而，当他们对荷瘤小鼠进行同样处理时，却大大促进了肿瘤的生长，提示肿瘤细胞能够通过一系列机制抑制机体的抗肿瘤免疫反应，包括分泌免疫抑制因子IL10，肿瘤生长因子β阻止有效的免疫反应；分泌血管内皮细胞生长因子，GM CSF等因子活化具有免疫抑制作用的骨髓源性细胞；激活特异的调节性CD4+CD25+T细胞以下调细胞毒性T淋巴细胞的效应等.2.3肿瘤抗原疫苗肿瘤能够引起机体特异性免疫反应的现象引发了对肿瘤抗原的研究. 肿瘤抗原包括多个层次：完整的蛋白质分子、抗原肽及纯化的DNA. 关于肿瘤DNA疫苗，下文将另行讨论. 目前将肿瘤抗原分为TSA和肿瘤相关抗原（tumor associated,TAA）. TSA是指只存在于肿瘤细胞，而TAA并非肿瘤细胞特有的抗原，只是在发生肿瘤时此类抗原的表达明显上调. Tabi等［2］认为，肿瘤抗原必须在全部或大多数患有相同肿瘤患者的大部分肿瘤细胞中呈普遍的高表达状态. 他将肿瘤抗原分为5类：① 突变抗原；② 肿瘤细胞过度表达抗原；③ 癌睾抗原; ④ 组织特异性分化抗原；⑤ 病毒抗原.单独应用肿瘤抗原蛋白存在免疫原性差的问题，这是由于肿瘤细胞可通过抗原、HLA缺失等机制发生逃逸. 刘宏利等［6］结合了肽疫苗和DNA疫苗各自的特点，以P815肿瘤细胞的CTL表位（P815A3543）为模型，合成该表位加多聚赖氨酸的颗粒性多肽，并制备含有编码此表位和GM CSF基因的表达质粒，制成了新型的颗粒性肽DNA复合疫苗，这种疫苗利于APC的摄取加工，可诱导有效的CTL应答，从而预防小鼠致命性P815肿瘤细胞攻击，并可部分根除肿瘤.超抗原能够激活全部携带T细胞抗原识别受体Vβ片段的T细胞,激活的T细胞克隆数约是普通抗原的1000倍,产生强大的杀伤靶细胞的作用. 马文学等［7］用已构建的重组跨膜型超抗原的表达载体pET28a TM SEA转化E.coli BL21(DE3)pLysS宿主菌,并诱导其表达跨膜型超抗原融合蛋白，实验结果显示，跨膜型超抗原融合蛋白能够锚定在肿瘤细胞膜上，显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，并延长其生存期,为肿瘤抗原疫苗的研究提供了新思路.热休克蛋白（heat shock protein, HSPs）作为细胞内的分子伴侣，通过其多肽结合结构域与一系列肿瘤相关抗原形成复合物，同时HSPs通过HSP受体CD91和LOX1介导被APC摄取［8-9］，于是，将肿瘤抗原与HSPs在基因或蛋白水平进行连接，可使机体提高特异性和非特异性抗肿瘤免疫的水平. 自体肿瘤HSPgp96抗原肽疫苗已进入临床Ⅲ期，但是由于这种疫苗具有很强的个体特异性，因此只对同源肿瘤起作用，而且由于自体肿瘤HSP抗原肽复合物需要从肿瘤患者体内提取，来源受到了很大限制. 目前研究方向是体外合成HSP抗原肽疫苗，如将HSP与肽或全蛋白进行连接；将HSP的DNA与抗原DNA 连接后表达融合蛋白［10］；或将HSP基因直接注入肿瘤细胞提高其免疫原性［11］.&nbsp; 独特型(idiotype，Id)单抗原显著优点在于它能引发针对相应自身抗原的体液免疫应答，抗Id的抗体(Ab2)能够模拟TAA，并作为TAA的内影像诱发抗肿瘤免疫. Chang等［12］研究了小鼠抗独特型模拟人类高分子量黑色素瘤相关抗原（）的结构基础，发现重链的互补决定区（CDR）3（H3）、轻链的CDR1（L1）在三维结构上紧密相连，该区域的部分氨基酸序列与核心蛋白的相似折叠区具有同源性，同时发现组成环的15氨基酸残肽在体内和体外均可与引发相似的免疫反应. 抗Id抗体已进入临床研究阶段，在淋巴瘤、结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤的治疗中表现出了较好效果. CD55是表达在结直肠癌细胞表面的糖蛋白，可保护肿瘤细胞免受补体的攻击，Ullenhag等［13］用模拟CD55的人类抗Id mAb 105AD7对67例结直肠癌患者进行了免疫，大多数患者在酶联免疫斑点试验和免疫细胞增殖反应中表现出了抗肿瘤免疫反应.2.4肿瘤DNA疫苗肿瘤DNA疫苗的原理就是将编码肿瘤特异性抗原的裸DNA分子直接注入机体或者经载体携带后注入机体，肿瘤DNA被体内肿瘤细胞或正常细胞识别并摄入，在细胞内表达肿瘤特异性抗原，引发机体持久的细胞和体液免疫. 肿瘤DNA疫苗由质粒DNA骨架、抗原DNA和真核细胞基因调控序列组成.肿瘤特异性DNA分子在体内被肌肉、皮肤、黏膜等易感处的细胞摄取后，表达出抗原蛋白，经加工处理后与分子结合呈递于细胞表面，激活CD8+T细胞，刺激CTL的形成和分化，产生细胞免疫作用；还有一部分抗原蛋白分泌至细胞外，被抗原提呈细胞吞噬加工后与分子共同表达于细胞表面，呈递给CD4+T细胞，激活体液免疫应答［14-15］. DNA疫苗不仅激活了肿瘤特异性体液免疫应答，产生了大量抗体，还激活了被认为是人体抗肿瘤免疫关键细胞的CD8+T细胞［16］，这无疑是肿瘤DNA疫苗的一大优势. 而且由于DNA疫苗分子进入人体后才开始其抗原蛋白的合成表达，因此DNA疫苗能够模拟病毒感染的自然过程，合成蛋白被降解加工，作为内源性分子由分子提呈给CD8+T细胞，激活强有力的细胞免疫应答，较之肿瘤抗原肽进入人体经APC加工提呈给CD4+T细胞，再激活体液免疫要有效得多. 同时，携带肿瘤抗原基因的质粒DNA可长期在宿主细胞内控制表达肿瘤抗原蛋白，因此具有长期持续的效果，有望使机体获得持久的抗肿瘤免疫功能.Niethammer等［17］用携带编码癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）基因的沙门氏菌感染小鼠，联合抗体融合蛋白，观察到的表达，大量CD8+T细胞被激活，100%的小鼠皮下肿瘤完全消除，75%的小鼠肺转移得到抑制. CD2，CD25，CD28以及CD48，CD80水平的明显上调表明CTL和负责抗原提呈的DCs在接受DNA疫苗的免疫刺激后得到了有效的激活. 然而在临床研究中，DNA肿瘤疫苗没有达到令人满意的效果. Conry等［18］用表达CEA和HBV表面抗原的质粒DNA免疫17例结肠癌转移患者，未见明显的临床变化，患者产生针对CEA的淋巴细胞增殖但未检测到CEA特异性抗体. 然后,人们对DNA疫苗做了一系列改进，主要从递送系统和免疫佐剂两方面加强质粒DNA的免疫原性. 基因枪运载质粒DNA的效率远远高于普通注射器和生物注射器，在 Trimble等［19］对此进行的比较中，基因枪运载质粒DNA的方法诱导出了最多的CD8+T细胞和最佳的抗肿瘤免疫反应. 由于这种途径能直接转染组织局部的Langerhans细胞［20］，因此诱导免疫所需要的质粒DNA用量可大大减少，同时，免疫佐剂也被用于质粒DNA. 研究证明，将编码细胞因子、细菌毒素、蛋白佐剂的DNA 与携带抗原基因的质粒DNA有机融合后，能加强质粒DNA的免疫原性［21］. 然而，Lima等［22］的研究发现,用CEA和融合DNA疫苗免疫小鼠后，高剂量组CEA引发的特异性体液和细胞免疫得到大大激活，但同时也产生了大量抗的自身抗体，而用单独的CEA DNA疫苗免疫小鼠，肿瘤生长被完全抑制. 这提示肿瘤抗原基因和细胞因子基因的融合疫苗在增强疫苗免疫效能的同时打破了机体对于细胞因子的免疫耐受,从而降低细胞因子的免疫佐剂功能,甚至可能对致敏宿主造成长期的损害［22］.除了质粒DNA外,病毒载体的DNA疫苗也进入了临床研究阶段. 病毒载体的DNA疫苗有更强的激活固有免疫反应的能力，通过TLR依赖和非依赖途径募集和活化抗原特异性T细胞，同时病毒载体激活的炎症信号能够影响依赖的CD8+T细胞的局部扩增和免疫记忆的形成. 最常用的病毒载体是重组腺病毒和重组痘病毒载体［23］，重组腺相关病毒、α病毒、口腔泡状病毒、单纯疱疹病毒还处于早期研究阶段. ATP依赖的抗原呈递相关转运蛋白（TAP1）在抗原直接提呈给CD8+T细胞和外源性抗原在树突状细胞（DCs）中交叉提呈的过程中发挥着重要作用. 由于TAP1在肿瘤细胞中表达极度低下，肿瘤细胞表面抗原的表达缺失造成其极易发生免疫逃逸. Lou等［24］给恶性黑色素瘤小鼠注射编码人TAP1的重组不复制腺病毒，诱导出了有效的抗肿瘤CTL反应，肿瘤浸润性的DCs细胞增加，记忆性T细胞亚类增多，动物存活期延长. 而在此病的研究中，携带表达和迷你基因的重组ALVAC在30例黑色素瘤患者中仅有1例出现免疫反应，2例病情稳定［25］ . 这可能与患者血清中存在的抗病毒载体的抗体有关.2.5树突状细胞（dendritic cell, DCs）肿瘤疫苗DCs是体内最强大的专职抗原提呈细胞，它能够识别、捕获、加工、提呈抗原引发初始免疫反应. 将TAA直接导入DCs，使其发挥提呈抗原并激活T细胞的功能，成为肿瘤免疫治疗的有效途径. 方法有用肿瘤细胞裂解产物、肿瘤抗原蛋白、肿瘤抗原多肽、合成肿瘤抗原肽冲击DCs细胞，或用肿瘤来源的RNA冲击DCs，也可以将肿瘤细胞与DCs细胞进行融合，或用肿瘤抗原病毒载体转染DCs.近年来，热休克蛋白抗原肽复合物激活DCs诱导抗肿瘤免疫受到了广泛关注. HSP70－抗原肽复合物负载的DCs比单独用抗原肽或HSP负载的DCs能更有效地激活Ｔ细胞、抑制肿瘤生长，而且HSP辅助提呈肿瘤抗原时使用更小量的抗原肽［26］. Moran等［27］将委内瑞拉马脑炎病毒复制子转染DCs细胞，用其免疫过表达neu原癌基因蛋白的荷瘤小鼠，结果转基因高水平表达，DCs细胞成熟并分泌前炎症因子，诱导活化NEU特异性CD8+T细胞，产生抗NEU 的IgG抗体. 有趣的是，耗竭小鼠CD4+T细胞而非CD8+T后，T细胞完全失去了抑制肿瘤生长的能力，提示CD4+T细胞在肿瘤生长抑制中发挥了重要作用. 肿瘤组织来源的RNA转染DCs被证明具有强大的抗原性、更多的作用靶点和更高的安全性，经过一系列动物实验，目前已进入临床研究. Su等［28］将PSA mRNA转染DCs，免疫治疗转移性前列腺癌，检测了患者外周血PSA水平和癌细胞数量，证明疫苗可引起有效的抗原特异性免疫反应，未见明显毒副作用.3问题与展望随着对肿瘤免疫机制研究的深入，肿瘤疫苗成为临床预防和治疗肿瘤有效方法的趋势日益明显. 尽管肿瘤疫苗的有效性在动物实验中取得了振奋人心的效果，但其在临床研究中的治疗结果尚未令人满意. 如何寻找和筛选有效的肿瘤抗原，激活机体的细胞和体液免疫应答；如何打破机体对肿瘤的外周耐受从而更有效的行使其免疫监视功能；如何改善免疫微环境，减少肿瘤对机体免疫反应的抑制；以及后续肿瘤疫苗进入机体的有效途径，免疫方法等均需要进一步的研究. 使用佐剂、细胞因子及其它有效的方法，如利用DCs强大的抗原提呈能力，大大增加了肿瘤疫苗的免疫原性；抗肿瘤T细胞的活化需要双信号，共刺激分子B7通过激活T细胞表面的CD28分子活化免疫反应，通过激活细胞溶解性T淋巴细胞相关抗原（C）分子则抑制免疫反应，有人已设想通过阻断T细胞表面的以利于肿瘤杀伤性T细胞克隆的激活；近年来CD4+CD25+自身调节T细胞（Treg）在肿瘤免疫中的抑制作用受到了关注，如何拮抗Treg细胞对抗肿瘤免疫的抑制，优化局部免疫微环境，从而活化免疫细胞识别、排斥肿瘤的作用也是研究的方向. 有研究证明，不同的疫苗接种途径及程序会对肿瘤疫苗的治疗效果产生有意义的影响，据此寻找最佳的免疫程序，发挥肿瘤疫苗的优势也值得研究. 此外，实验和临床研究发现，肿瘤疫苗对早期肿瘤、手术切除肿瘤或经放化疗已明显缩小的肿瘤具有更好的治疗效果，提示将肿瘤疫苗与手术、化疗、放疗及移植等手段结合起来应用，以达到满意的治疗效果.随着基础研究和临床试验进一步的开展，我们对肿瘤疫苗的认识也将更加深入，有理由相信，新的安全、有效、抗原性更强、适应范围更广的肿瘤疫苗终将为广大肿瘤患者带来福音.【参考文献】［1］林文棠，朱平. 临床免疫学［M］. 西安:第四军医大学出版社，2002：100-102.［2］ Tabi Z, Man S. Challenges for cancer vaccine development［J］. Adv Drug Deliv Rev, 2006, 58(8):902-915.［3］ Hockertz S. Present and future of cancer vaccines［J］. Toxicology, 2005,214(1-2):151-161.［4］ Moret TI, Sanmartin I, Marco FM, et al. Nonviral therapeuticcell vaccine mediates potent antitumor effects［J］. Vaccine, 2006,24 (18):3937-3945.［5］ Fifis T, Lam I, Doris L, et al. Vaccination with in vitro grown whole tumor cells induces strong immune responses and retards tumor growth in a murine model of colorectal liver metastases［J］. Vaccine, 2008,26(2):241-249.［6］刘宏利，赵建平，倪兵，等. 颗粒性肽复合疫苗抗肿瘤免疫的研究［J］. 现代免疫学，2004，24：391-394.［7］马文学，余海，王青青，等. 跨膜型超抗原SEA融合蛋白的表达及其对小鼠黑色素瘤的免疫治疗作用［J］. 中华微生物学和免疫学杂志, 2003,23（7）：567-571.［8］王少彬,陈理明，陈俊辉. 热休克蛋白与肿瘤研究进展［J］. 现代肿瘤医学，2005，13（1）：131-133.［9］ Nishikama M, Takemoto S, Takakura Y. Development of heat shock proteins with controlled distribution properties and their application to vaccine delivery［J］. Yakugaku Zasshi,2007,127(2):293-300.［10］ Chu NR, Wu HB, Wu TC, et al. Immunotherapy of a human papillomavirus type 16 Efusion protein comprised of Mycobacterium bovis BCG Hsp65 and HPV16E7［J］. Cell Stress Champerones, 2000,5(5):401-405.［11］ Rafiee M, Kanwar JR, Berg RW, et al. Induction of systemic antitumor immunity by gene transfer of mammalian heat shockprotein70.1 into tumors in situ［J］. Cancer Gene Ther,2001,8(12):974-981.［12］ Chang CC, Hernandez Guzman FG, Luo W, et al. Structural basis of antigen mimicry in a clinical relevant melanoma antigen system ［J］. J Biol Chem, 2005,280(50):41546-41552.［13］ Ullenhag GJ, Spendlove I, Watson NF, et al. Aneoadjuvant/adjuvant randomized trial of colorectal cancer patients［J］. Clin Cancer Res, 2006,12(24):7389-7396.［14］罗晨. 疫苗与肿瘤免疫治疗［J］. 国际病理科学与临床杂志, 2006,(26):4333-4336.［15］郝葆青,刘鲁蜀,张晓冬.。

·综述·*通信作者:崔诗允,主治医师,E-mail :******************.cn结直肠癌肿瘤疫苗研究进展汪雨彤1,叶凡1,张霄1,邹睿涵1,崔诗允2*1.南京医科大学第一临床医学院,江苏南京2111662.南京医科大学第一附属医院肿瘤科,江苏南京210029【摘要】结直肠癌作为全球三大常见恶性肿瘤之一,每年约有数百万例新病例产生。

在生物免疫治疗的迅速发展下,免疫疗法为结直肠癌的治疗带来新的方案。

肿瘤疫苗通过放大抗肿瘤免疫应答,激活患者体内特异性抗肿瘤反应,从而对肿瘤进行预防或治疗。

本文就结直肠癌肿瘤疫苗的研制基础、临床研究进展以及疫苗开发遇到的挑战进行综述。

【关键词】结直肠癌;肿瘤疫苗;研究进展;解决策略Advances in vaccines for colorectal cancerWang Yutong 1,Ye Fan 1,Zhang Xiao 1,Zou Ruihan 1,Cui Shiyun 2*1.Nanjing Medical University,Nanjing 211166,Jiangsu,China2.Department of Oncology,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,Jiangsu,China【Abstract 】Colorectal cancer is one of the three most common malignant tumors worldwide,with millionsof new cases predicted each year.With the rapid development of biological immunotherapy,immunotherapy has brought new solutions to the treatment of colorectal cancer.Tumor vaccines can prevent or treat tumors by ampli ⁃fying anti-tumor immune responses and activating specific anti-tumor responses in patients.Here,we conduct a comprehensive review concerning the advance of vaccine for colorectal cancer in preclinical and clinical research.【Key words 】Colorectal cancer;Tumor vaccine;Advance;Resolvent结直肠癌(colorectal cancer ,CRC )是全球第三大常见的恶性肿瘤,在美国,CRC 是癌症相关死亡的第二大原因[1]。

卡介菌多糖核酸对正常小鼠免疫功能影响的研究目的：研究卡介菌多糖核酸对正常小鼠免疫功能的影响。

方法：将ICR小鼠随机分成照组和12.5、25、50mg/kg bw 3个剂量组。

肌内注射28天，进行胸腺指数、脾脏指数、细胞免疫、体液免疫、单核巨噬细胞活性的测定。

结果：高剂量组胸腺指数显著高于对照组，高剂量组促进淋巴细胞增值能力，中、高剂量组提高小鼠巨噬细胞吞噬功能，对脾脏指数无影响。

结论：卡介菌多糖核酸具有增强小鼠免疫功能作用。

标签：卡介菌多糖核酸；细胞免疫；体液免疫我国自主研制的卡介菌多糖核酸（BCG-PSN），是将卡介苗进行纯化，通过热酚法提取其有效成分（多糖、核酸等），配以灭菌的生理盐水制成的免疫调节剂，BCG-PSN的成功研制，填补我国卡介苗系列产品的空白[1]。

临床上广泛用于预防和治疗慢性气管炎、感冒、哮喘、病毒感染性疾病、自身免疫性疾病。

本实验是以卡介菌多糖核酸为研究对象，研究其对正常小鼠脾脏指数、胸腺指数、细胞免疫、体液免疫和巨噬细胞活性的影响。

探讨卡介菌多糖核酸的作用机制。

1材料与方法1.1药品与试剂：卡介菌多糖核酸注射液、刀豆蛋白A、脂多糖、MTT、DMSO、支链淀粉、PBS（pH7.4）、中性红、台酚蓝、IMDM培养液。

1.2实验动物：ICR小鼠，6-8周龄18-22g，雌性120只。

1.3仪器：离心机，酶标仪，细胞培养箱，电子天平，倒置显微镜。

1.4方法1.4.1给予受试动物途径：实验动物分成4组，每组30只小鼠，分别注射卡介菌多糖核酸低、中、高三个剂量组（12.5mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg）和对照组（生理盐水），肌内注射，每周2次，持续4周。

1.4.2小鼠T、B 淋巴细胞转化功能的测定：每组取10只小鼠，脱臼处死，制备脾细胞悬液。

IMDM洗涤细胞，调整细胞浓度，每个样品设3个重复，每孔100μl 培养于96孔培养板，每孔加Con A 100μl和LPS 100μl，每组设1个空白对照。

OK432优化的内皮细胞疫苗抗小鼠乳腺癌作用研究徐茂磊;周玲;杨小平【摘要】目的：探讨 OK432优化的人脐静脉内皮细胞( HU-VECs)疫苗对小鼠EAC乳腺癌的生长抑制作用。

方法体外培养HUVECs,与佐剂OK432混合,制备HUVECs-OK432疫苗,以小鼠 EAC 乳腺癌皮下移植瘤模型考查 HUVECs-OK432疫苗的抗肿瘤效应,并通过ELISA、脾细胞增殖及细胞毒性T淋巴细胞( CTL)杀伤实验检测疫苗免疫后体液及细胞免疫应答水平。

结果在预防性免疫中, HUVECs-OK432疫苗可以明显抑制EAC乳腺癌生长；HUVECs-OK432疫苗诱导小鼠产生了高滴度的特异性 HUVEC 抗体；HU-VECs-OK432疫苗能有效刺激免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖；HUVECs-OK432组小鼠脾细胞诱导产生了明显的靶向HU-VEC 细胞的CTL杀伤作用。

结论 HUVECs-OK432疫苗可以有效诱导机体产生靶向HUVEC的特异性体液及细胞免疫应答,从而有效抑制了小鼠EAC乳腺癌的生长。

%Aim To investigate the anti-EAC breast cancer effects of viable human umbilical vein endothe-lial cells ( HUVECs) vaccine. Methods Subconflu-ent HUVECs were mixed with OK432 to prepare HU-VECs-OK432 vaccine, and the anti-tumor efficacy of HUVECs-OK432 was investigated using a subcutaneous tumor model of EAC breast cancer. ELISA, splenic lymphocyte proliferation assay and cytotoxic T lympho-cytes ( CTL ) killing assay were adopted to detect the humoral and cellular immune responses after HUVECs-OK432 immunization. Results HUVECs-OK432 im-munization significantly inhibited the growth of EAC tumor in mice in the prophylactic procedures. High ti-ter of anti-HUVEC antibody was elicited by HUVECs-OK432 immunization. The proliferation activity ofsplenocytes from mice immunized with HUVECs-OK432 was significantly increased. T lymphocytes iso-lated from HUVECs-OK432-immunized mice were dose dependently killing HUVECs in vitro. Conclusion Strong humoral and cellular immune responses targeting HUVEC are elicited by HUVECs-OK432 immuniza-tion, which results in a significant inhibition on the growth of EAC tumor in mice.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2014(000)010【总页数】6页(P1425-1429,1430)【关键词】内皮细胞疫苗;抗血管生成;OK432;肿瘤免疫治疗;EAC乳腺癌;ICR小鼠【作者】徐茂磊;周玲;杨小平【作者单位】滨州医学院药学院，山东烟台 264003;滨州医学院药学院，山东烟台 264003;滨州医学院药学院，山东烟台 264003【正文语种】中文【中图分类】R-332;R392.7;R737.903抗血管生成疗法因其具有药物容易到达靶细胞，不易产生耐药性，抗瘤谱广泛，毒副作用小，以及与放化疗存在联合增效等优点，已经成为肿瘤临床治疗的研究热点。

·综述·应用热休克蛋白!肽复合物疫苗防治肿瘤!陈继营袁玫卢世璧中图分类号"#$%文献标识码&文章编号’(()*%+#%（,((,）()*()((*(,!本课题受解放军总医院“十五”研究基金资助。

作者单位：解放军总医院骨科研究所，北京复兴路,%号’((%)$作者简介：陈继营（’-.$/），男，山东淄博人，主治医生，博士学位，主要研究方向：骨病及神经伤的治疗。

电话：（(’(）..-$#-(,肿瘤手术切除后能否根治，最关键的是防止复发和转移，目前所用的化疗或放疗往往不仅杀死了肿瘤细胞，也摧毁了机体的免疫功能，最终难以根治。

如何调动机体的免疫功能来杀伤肿瘤细胞是人们长期以来的设想，这方面的研究持续了百年的历史，仅在近’(余年来，随着免疫学和分子生物学等基础医学的突破性进展，开始展现了调动机体特异性免疫功能杀伤肿瘤细胞（肿瘤疫苗）的可喜的苗头。

机体能识别和杀灭非我的外来微生物，而不能消灭自身的肿瘤，这一现象归结为肿瘤细胞逃逸了机体的免疫监视。

因此，长期以来人们从事于两个方面的研究，一是肿瘤是否存在不同于正常组织的特异抗原？二是机体为什么不能识别和排斥肿瘤细胞？对于前者，人们用单克隆抗体和0细胞识别抗原的方法证实了一大批肿瘤相关抗原、一些特异性抗原以及0细胞表位抗原，证实了肿瘤细胞具有可被机体识别的抗原，当然，还有大量未知的抗原。

对于后者，人们也证实了细胞免疫在抗肿瘤中起主要作用，但由于肿瘤细胞缺少或不表达组织相容复合物（123）及共刺激因子，因而不能活化0细胞，导致细胞免疫处于功能低下状态；此外，它还分泌免疫抑制因子，从而抑制了免疫功能。

基于这些研究，取得的共识是：（’）肿瘤细胞具有可被机体识别的抗原。

（,）细胞免疫在机体抗肿瘤作用中起主要作用。

（$）诱发与增强机体的抗肿瘤免疫作用是可行的，包括特异性抗原的发现、增强共刺激因子和多种细胞因子的作用。

（+）肿瘤抗原肽与123锚定位点分子结构的逐渐探知（已有近’(种）。