牛流行热检测方法及疫苗研究现状

牛流行热检测方法及疫苗研究现状

牛流行热（bovine ephemeral fever，BEF）又称三日热、暂时热，是一种由节肢动物传播的病毒性疾病[1-2]。BEF的主要症状表现为突发高热（41~42 ℃）、食欲不振、关节肿胀、跛行。该病的特点是发病快，病程仅持续1~3 d，恢复迅速。1867年，BEF首次在南非被报道，随后传入中东、澳大利亚、日本、中国等国家及地区[3]。BEF病死率低，发病率高，主要导致泌乳牛产奶量突然下降、肉牛状况不良、役用牛瘫痪，造成养殖业经济损失惨重。近年来，BEF的发病率和病死率不断升高。2002年，河南省BEF流行病学报告病死率达到17%~18%；2012年，土耳其一牧场BEF病死率高达20%；2015年，西藏和甘肃天祝地区牦牛BEFV抗体阳性率为23.8%~45.09%[4-7]。因此，检测和防控BEF已成为畜牧业的首要任务。

牛流行热病毒（bovine ephemeral fever virus，BEFV）属于弹状病毒科暂时热病毒属，由负义单链RNA基因组组成。BEFV共编码5种结构蛋白，包括核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）、RNA依赖RNA聚合酶大蛋白（L）[8]。G蛋白是一类跨膜糖蛋白，负责病毒细胞黏附、进入和致病性，表面有4个抗原中和位点（G1~G4），能够诱导抗体分泌和保护性体液免疫[9-10]。研究发现，G1位点仅与BEFV的血清发生反应，而G2、G3、G4抗原位点与同科其他病毒会产生血清学交叉反应[11]。G蛋白作为中和抗体的靶标，广泛应用于BEFV检测方法建立和新型BEF疫苗开发。本文对BEF的检测方法以及疫苗开发的研究近况进行梳理总结，以期为BEF的防控提供一定参考。 1 BEF检测方法的研究近况

1.1 病原学检测方法

临床上常将采集的患病牛抗凝血白细胞接种于1~3日龄的乳鼠脑中，经鼠脑传代分离得到病毒后，进行病毒中和试验鉴定；或将负染分离的白细胞置于电镜下，观察病毒颗粒的形态。BEFV可在牛肾细胞（MDBK）、仓鼠肾细胞（BHK-21）、非洲绿猴肾细胞（Vero）、白纹伊蚊细胞（C6/36）等细胞系中分离培养。Karayel-Hacioglu等[12]将疑似感染BEFV的牛血样品中的白细胞层接种于Vero细胞培养物中，盲传2代，感染后48 h内观察到特异性细胞病变反应（CPE），后续的传代中接种后24 h内即可观察到CPE，最终经过RT-PCR确认分离株是BEFV。病毒分离鉴定是最传统也是最准确的诊断方法，但该方法对实验室条件要求过高，且操作复杂，不适用于BEFV快速诊断，无法在基层养殖场推广应用。

1.2 血清学检测方法

1.2.1 微量血清中和试验

微量血清中和试验（neutralization test）是检测病毒常用的方法。1988年，白文彬等[13]应用BEF北京毒株制备了微量血清中和试验抗原和高免血清，进行特异性和重复性试验，结果表明，BEF微量中和试验特异性强、敏感性高，与常量中和试验对比，结果一致。BEF微量中和试验是我国农业农村部首次推荐检测BEFV的标准方法，但该方法操作烦琐，结果误差较大，难以应用于临床大批量血清样品检测。 1.2.2 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）是血清学检测最常用的检测方法，灵敏度高、检测结果相对准确、适用范围广。目前以体外表达重组BEFV G蛋白建立了几种ELISA方法。黄德萱[2]以BEFV G 蛋白制备的兔源多克隆抗体作为捕获抗体，以G1表位单克隆抗体为检测抗体，建立了BEFV抗原捕获ELISA。采用该方法对弹状病毒科其他病毒以及牛病毒性腹泻病毒进行特异性验证，结果显示，该方法特异性较好，可为BEFV临床样品的筛查提供技术支持。但该方法制备抗体成本较高，且BEFV感染病程较短时会影响检测结果的准确性。汪祥斌[14]基于原核表达的重组蛋白BEFV G1，建立了检测BEFV抗体的间接ELISA方法，利用该方法验证微量中和试验检验的牛血清，结果显示，临界值为0.347，敏感性为96%，特异性为92%，表明该方法具有较好的敏感性和特异性，为BEF的防控提供一定帮助。

1.3 分子生物学检测

1.3.1 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术检测速度快、敏感性和特异性高，尤其适用于鉴定体外分离不到病原的情况。国内外研究人员针对BEF开发了一系列高灵敏度和特异性的PCR方法，如反转录PCR、一步式反转录PCR和实时荧光定量PCR。由于RNA病毒易降解，为简化试验步骤，避免操作过程中的污染，廖承球等[15]建立了BEFV一步法RT-PCR，并使用该方法对采集的17份疑似BEF患牛全血进行检测，与常规PCR检测结果完全一致。该方法中反转录和PCR扩增均在一个反应管中进行，与常规PCR相比，不仅可缩短检测时间，还可节约试剂、降低污染。

近年来，在RT-PCR的基础上，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）的应用更加广泛。因RT-qPCR具有交叉污染率低、反应时间短和检测结果精确等特点，多应用于兽医诊断实验室。汪祥斌等[11]基于BEFV G蛋白的保守序列设计探针和引物，建立了BEFV TaqMan实时定量PCR检测方法，最低检测限为1×101copies/μL，与牛蓝舌病毒、牛赤羽病毒无交叉反应，表明该方法特异性强，稳定性、重复性良好，可节省病毒核酸用量。Gao等[16]基于SYBR green Ⅰ技术开发了一种低成本的RT-qPCR检测方法，并对BEFV G设计了简并引物，能够检测广谱BEFV毒株，其灵敏度与TaqMan RT-PCR检测不分高下，比常规PCR高百倍，而且可应用于定量分析牛体内病毒动力学。

LUXTM荧光RT-PCR是一种扩增体系简单，成本比TaqMan探针技术低，特异性比核酸染料技术强，但敏感性和特异性与TaqMan探针技术不相上下的实时核酸扩增技术[17]。刘志玲等[18]在BEFV G基因保守区设计了特异LUXTM荧光RT-PCR引物，首次建立了特异性BEFV

LUXTM荧光RT-PCR快速检测方法，其敏感性比传统RTPCR方法高100倍，对临床BEF的检测具有应用价值。虽然RT-qPCR具有高通量扩增的能力，但热循环仪价格昂贵并且需要专业的技术人员，导致该方法在应用上存在局限性，难以在基层推广使用。

1.3.2 等温扩增技术 环介导逆转录等温扩增技术（reverse transcription

loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）是一种新型核酸扩增方法。RT-LAMP扩增的各个步骤均在同一温度进行，不需特定的仪器设备，其灵敏度、特异性和检测范围等指标优于PCR技术，检测成本远低于RT-PCR。贾坤等[19]建立了一种高效、简便、可视化的RT-LAMP检测方法，与传统PCR相比，RT-LAMP的检测灵敏度提高至10倍以上。由于RT-LAMP反应本身特异性强、灵敏性高，所以对于操作环境要求严格，稍有不慎便可能出现假阳性结果。

重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase

amplification，RPA）被认为是可取代PCR实现便携式快速核酸检测的一种等温扩增技术，具有操作简便、灵敏度高、设备要求低等优点，但准确检测RPA产物还需进一步优化。侧流层析试纸条检测法（recombinase polymerase amplification combined with lateral

flow dipstick，RPALFD）可对RPA产物进行可视化检测，与其他检测方法相比，该方法用时短，5~10 min内即出可视化检测结果，适用于基层养殖场检测。Hou等[20]以BEFV G基因为目标对象设计RPA引物和LF探针，建立应用于检测BEFV的可视化RPA-LFD检测技术，通过肉眼直观判断横向流动试纸条上的扩增产物；结果表明，扩增产物在38 ℃下进行20 min即可被检测到，其临床检测结果与RT-PCR相比，符合率高达96.09%（123/128），高于常规PCR的符合率。RPA比其他BEFV核酸检测方法快，不需要昂贵且复杂的热循环仪，非常适合BEFV核酸现场快速检测。 1.4 其他检测方法

国内外学者一直在开发和应用传感器技术，利用动物身上的传感器检测皮毛、体温和行为指标实现特定伤害或疾病的自动诊断[21]。Tobin等[22]利用牛身上加速度传感器远程监测BEF相关行为变化，通过分析加速度计读数变化，结果发现，使用加速度计读数具有诊断BEF和其他疾病的潜力，有望成为新的有力检测工具。

2 BEF疫苗的研究近况

疫苗接种是预防和控制BEF最有效的措施。迄今为止，国内外已经研究出多种候选疫苗应用于预防BEF感染，并在临床实践中发现不同疫苗的保护效果不同。

2.1 灭活疫苗

灭活疫苗是将病原体在细胞基质上进行培养，通过加热或用化学剂（福尔马林、甲醛、β-丙内酯、结晶紫等）使病原体失去致病力而保留抗原性的一类疫苗。BEFV只有一个血清型，但已分离了多种变异BEFV毒株，一些分离株灭活后，免疫牛表现出良好的免疫原性和保护效力。国内市售的BEFV灭活疫苗使用的是1976年在中国分离的JB76H毒株。朱雁等[23]对淮海经济区多个县市养殖场进行了BEF流行病学调查分析及BEFV疫苗免疫效果评估，结果发现，2011年之前未免疫BEF灭活疫苗的县市出现了暴发式流行；2011—2017年免疫BEF灭活疫苗的县市只出现了零星病例；而其他未免疫BEF灭活疫苗的县市均多次发生BEF，连续两次免疫BEF灭活疫苗后，免疫中和抗体合格率达到了80%，表明BEF灭活疫苗具有良好的保护作用。近年来，也有研究报道了接种BEFV灭活疫苗的牛群出现疫苗接种失败[24]的案例。研究人员使用不同佐剂的灭活疫苗诱导产生高效价的抗体，从而提高BEF灭活疫苗的保护效力。Aziz-Boaron等[25]基于以色列当地毒株开发了水包油灭活疫苗，并对其进行测试，结果显示，接种3次或4次疫苗后，中和抗体滴度保持稳定（1∶256），但4个月后检测到中和抗体滴度有所下降。Yang等[26]通过杆状病毒表达系统表达缺失重组弧菌鞭毛蛋白制备的灭活赤羽病毒（AKAV）＋BEFV疫苗，结果显示，在小鼠和豚鼠试验中，灭活AKAV+BEFV疫苗对AKAV和BEFV的VNA滴度略高于活BEFV疫苗；在猪和牛中抗AKAV和BEFV可诱导高VNA滴度（1∶64~1∶512），表明AKAV+BEFV灭活疫苗具有高免疫原性和良好的安全性，但仍需进一步开展田间试验，研究疫苗的免疫效力和持久性。

2.2 减毒活疫苗

减毒活疫苗是通过传统方式减弱病原体的毒性或敲除病原体的毒力基因，但保留了病原体在宿主体内增殖的一类疫苗。已有商品化减毒活疫苗在BEF流行的国家使用，如澳大利亚、日本、南非。南非通过每年给易感牛皮下接种由Onderstepoort Biological Products（OBP）生产的减毒B-Phemeral疫苗控制BEF疫情[27]。BEF减毒活疫苗免疫力持久，但存在安全隐患，可能出现毒力返强、RNA病毒易突变等情况。

2.3 基因工程疫苗

与传统灭活疫苗和减毒疫苗相比，基于BEFV抗原基因进行开发