LCMS基础1

LC/MS的SOPStep 1：使用LC/MS前的准备工作1．查阅文献，获得目标分析物质或相近物质的液质条件。

2．检查线路是否连接完好。

检查流动相和洗针液是否充足，不足则根据要求添加。

3．有机流动相必须为HPLC级别，水相可使用纯水机出水或娃哈哈纯净水。

流动相中添加的酸或胺类物质必须为色谱纯，其中水相需每天更换以保持新鲜。

4．标样和样品在使用前必须用0.45μm的针头式滤器过滤。

5．在做LC/MS之前，需将样品放置在样品托盘上，并记录相应的位置。

且第一个或最后一个样品为空白采用不含盐或酸的流动相做样，用于清洗进样系统及管路。

Step 2：开机、关机方法Step 2.1：开机方法1．打开质谱电源，即打开质谱主电源开关（Main Power Switch）至On（/）位置；2．打开真空泵开关；真空泵开关开启约一小时后，打开电子开关（Electronics Switch）在Operational状态；3．打开计算机；4．双击桌面LCQ Tune图标，打开Tune Plus界面；5．查看Tune Plus界面右边质谱参数，确认Ion Gauge Pressure小于5×10-6 Torr；6．打开LC部分各模块电源。

Step 2.2：关机方法1．关闭电子开关（Electronics Switch）；2．5~6分钟后关闭质谱主电源开关(Main Power Switch)至Off (O) 位置；3．关闭LC部分各模块电源。

Step 3：LC /MS分析方法建立1．双击桌面Xcalibur图标，打开Xcalibur 工作站；2．在Xcalibur Roadmap 主页上, 点击Instrument Setup按钮, 建立LC/MS方法；3．设置LC部分参数；A.Accela pump的参数设置；1）点击Instrument Setup窗口中Accela pump图标；2）点击Gradient Program标签；3）设置流动相条件（时间、流动相比例、流速等）。

1、如何看质谱图(1)确定分子离子，即确定分子量：氮规那么：含偶数个氮原子的分子，其质量数是偶数，含奇数个氮原子的分子，其质量数是奇数。

与高质量碎片离子有合理的质量差，凡质量差在3~8 和 10~13， 21~25 之间均不能能，那么说明是碎片或杂质。

(2) 确定元素组成，即确定分子式或碎片化学式：高分辨质谱能够由分子量直接计算出化合物的元素组成从而推出分子式，低分辨质谱利用元素的同位素丰度。

M-1，M-15，M-18，M-20，M-31......意味着失H，CH3，H2O，HF，OCH3......(3)峰强度与结构的关系，丰度大反响离子结构牢固：在元素周期表中自上而下，从右至左，杂原子外层未成键的电子越易被电离，容纳正电荷能力越强，含支链的地方易断。

2、离子源EI(Electron Impact Ionization):电子轰击电离—硬电离。

CI(Chemical Ionization):化学电离—核心是质子转移。

FD(Field Desorption):场解吸—目前根本被FAB取代。

FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轰击—也许铯离子(LSIMS, 液体二次离子质谱 ) 。

ESI(Electrospray Ionization):电喷雾电离是最软的电离方式，采用离子蒸发，平时小分子获得 [M+H]+]+,[M+Na]+或 [M-H]- 单电荷离子；化合物无需拥有挥发性，离子在溶液中已生成；样品流速／ min；适合极性分子的解析，能解析小分子及大分子( 如蛋白质分子多肽等 ) ，生物大分子产生多电荷离子，平时只产生分子离子峰，因此可直接测定混杂物，并可测定热不牢固的极性化合物；经过调治离子源电压控制离子的碎裂〔源内CID〕测定化合物结构。

APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization):大气压化学电离也是软电离技术，高压放电发生了质子转移而生成[M＋ H]+或 [M-H]- 离子；化合物要拥有挥发性且热牢固，离子在气态条件中生成；样品流速／ min；只产生单电荷峰，适合测定质量数小于2000Da的弱极性的小分子化合物；适应高流量的梯度洗脱/ 上下水溶液变化的流动相；经过调治离子源电压控制离子的碎裂。

液相质谱（LCMS）离子源1.大气压离子源（API）（包括大气压电喷雾电离ESI、大气压化学电离APCI、大气压光电离APPI）在ESI中，离子的形成是被测分子在带电液滴的不断收缩过程中喷射出来的，即离子化是在液态下完成的。

经液相色谱分离的样品溶液流入离子源。

在N2流下汽化后进入强电场区域，强电场形成的库仑力使小液滴样品离子化，借助于逆流加热N2分子离子颗粒表面液体进一步蒸发，使分子离子相互排斥形成微小分子离子颗粒如图所示。

这些离子可能是单电荷或多电荷，这取决于所得的带有正、负电荷的分子中酸性或碱性基团的体积和数量。

多电荷离子峰的形成使质量范围为3000u的四极杆滤过器质谱仪也能检测到生物大分子的准确分子量。

APCI技术与传统的化学电离接口不同，它并不采用诸如甲烷一类的反应气体，而是借助电晕放电启动一系列气相反应以完成离子化过程，就其原理，它也可被称为放电电离或等离子电离。

从液相色谱流出的样品溶液进入一具有雾化气套管的毛细管，被氮气流雾化，通过加热管时被气化。

在加热管端进行电晕尖端放电，溶剂分子被电离，充当反应气，与样品气态分子碰撞，经过复杂的反应过程，样品分子生成准分子离子。

APPI是一种被分析物在气相中吸收由真空-紫外发出的电子（10eV或10.6eV）后放出电子而离子化的过程，APPI使用较少。

APPI是直接将待测物电离，比较适合非极性或弱极性化合物的分析。

ESI的优点：可生成高度带电的离子而不发生碎裂，这样可将质荷比降低到各种不同类型的质量分析仪都能检测的程度。

通过检测带电状态，可计算离子的真实分子量。

同时，解析分子离子的同位素峰也可确定带电数和分子量，因同位素峰间的质荷比差与带电数相对应。

最大优势是可方便地与分离技术联用。

ESI的缺点：ESI的主要缺点是它只能接受非常小的液体流量（1-10μl/min），这一缺点已被1987年研制出来的离子喷雾接口（ISP）所克服（离子喷雾接口是一种借助气动的电喷雾接口，它可适应较高的流速）。

LC/MS质谱仪概念LC/MS质谱仪是一种结合了液相色谱（LC）和质谱（MS）技术的仪器，主要用于复杂混合物中化合物的分离、鉴定和定量分析。

LC/MS 质谱仪在科学研究和工业应用中具有广泛的应用，如药物研发、环境监测、食品安全等领域。

1. 液相色谱(LC)部分液相色谱是一种基于色谱技术的分离方法，通过流动相和固定相之间的相互作用，实现对不同化合物的分离。

在LC/MS质谱仪中，液相色谱主要用于将混合物中的化合物进行分离，以便后续的质谱分析。

液相色谱部分主要包括输液泵、色谱柱、进样器和柱温箱等部分。

2. 质谱(MS)部分质谱是一种通过离子化样品并测量其质量的技术，可以实现对化合物的鉴定和定量分析。

在LC/MS质谱仪中，质谱部分负责对经液相色谱分离后的化合物进行鉴定和定量分析。

质谱部分主要包括离子源、质量分析器和检测器等部分。

3. 数据系统数据系统是LC/MS质谱仪的重要组成部分，负责采集和处理质谱数据。

数据系统可以记录每个化合物的质量、强度和保留时间等信息，并通过数据库或数据处理软件进行处理，生成化合物的质谱图和鉴定结果。

4. 真空系统真空系统是LC/MS质谱仪中必不可少的部分，负责维持系统的真空状态。

在质谱分析过程中，离子化样品后需要进行加速和聚焦，而这些过程需要在高真空条件下进行。

真空系统通常包括机械泵和涡轮泵等设备，以保证系统的真空度要求。

5. 接口技术接口技术是连接液相色谱和质谱的关键部分，负责将液相色谱分离后的化合物转移到质谱中进行鉴定和定量分析。

接口技术的好坏直接影响到LC/MS质谱仪的整体性能和使用效果。

目前常用的接口技术包括喷针接口、电喷雾接口和大气压电离接口等。

总之，LC/MS质谱仪是一种功能强大的分析仪器，它结合了液相色谱和质谱两种技术，能够实现对复杂混合物中化合物的分离、鉴定和定量分析。

通过LC/MS质谱仪的应用，我们可以更好地了解和研究化合物的性质和行为，为科学研究和工业应用提供有力的支持。

LCMS 簡易操作流程(一) 為提升分析數據品質，請依下列方式進行樣品前處理1、純化。

鹽類會干擾質譜訊號，故樣品含有鹽類請先去除。

2、樣品應適用溶於水、Methanol及Acetonitrile等溶劑之高極性樣品，並控制濃度為0.5-10μM。

(1m g樣品以20-60μl相容溶劑溶解後以50%ACN +0.1%FA水溶液稀釋50×300倍) 。

3、無法全溶且有懸浮固體時應過濾或離心取澄清液以免阻塞管路。

(二) 測樣流程1、以syringe取100μl 80%ACN手動推針沖洗管路。

再以syringe取150μl配樣溶液並將syringe固定在樣品推送台上。

2、質譜儀參數設定。

(1) Capillary voltages: 2.5-3.5kV。

(2) Cone voltage:10-60V。

3、開氮氣，啟動氮氣供應系統(選按Gas)，穩定後按操作按鈕(operate)。

4、設定注射速度(50μl/min)啟動樣品注射(syringe pump)，推針50μl後將流速緩降至10μl後按(Acqu)。

5、設定存檔參數：file name、tex t、range) ，按(Start)開始測background。

6、樣品測定時可即時監看。

測樣完成按(Standby)並停止樣品注射。

7、取150μl濃度0.5-10μM之樣品。

質量監測得穩定peak或推針50μl後將流速緩降至10μl，按下(Acqu) 設定存檔參數後按(Start)。

8、測樣完成後取150μl配樣溶液沖洗管路至無樣品殘留。

9、降溫至100℃以下時按停氣體供應系統，關氮氣，簽使用記錄本。

10、印出質譜圖。

關螢幕。

L C /M S 原理及基础知识介绍沃特斯中国有限公司应用部W a t e r s C h i n a L t d .M S 的历史1910年世界上第一台现代意义质谱仪在英国剑桥 C a v e n d i s h 实验室出现 1917年电喷雾 (E l e c t r o s p r a y 物理现象被发现 (并非为了 M S1918年世界上第一台实际意义质谱仪在美国芝加哥大学实验室出现 (扇型磁场 M S1943年世界上第一台商业质谱仪 1953年四极杆质量分析器质谱仪 1955年飞行时间质量分析器质谱仪1960’ s 开发 G C /MS 60’ s -70’ s 大气压电离 (A P c I 源被发现 (但并未被广泛应用70’ s -80’ s 开始广泛研究 L C /MS 1979年传送带式 L C /M S 接口成为商业产品 1982年离子束 L C /M S 接口出现 1984年第一台电喷雾 M S 仪宣告诞生 1988年电喷雾离子源 M S 首次应用于蛋白质的分析… . . .W a t e r s C h i n a L t d . L C /M S 中的液相色谱H i g h P e r f o r m a n c e L i q u i dC h r o m a t o g r a p h y -高效液相色谱液质联用的前提和基础 =进样 +分离根据化合物的化学特性分离样品 (比如极性化合物 , 非极性化合物 , 酸性化合物 , 碱性化合物等等• 分离技术• 分离效率高• 流动相参与分离• 连续流出 , 峰宽有限• 有时需要使用缓冲盐提高分离度• 高压环境工作 (> 1000 p s iW a t e r s C h i n a L t d .L C /M S 中的质谱M a s s S p e c t r o m e t r y -质谱质量是物质固有特征之一 , 不同的物质有不同的质量谱分析物被转化为气相离子而被分析这些离子按其质荷比 (m /z 被分离而被检测质谱图即是相关的离子流对 m /z 的图• 灵敏度高• 定性 /定量本领高• 脉冲扫描采集数据• 高真空环境工作• 溶剂参与反应W a t e r s C h i n a L t d .L C /M S 数据形式G a m a b u f o t a l i n 保留时间W a t e r s C h i n a L t d .质 谱 的 种 类 及 相 关 联 用 技 术液质联用系统的常见部件离子化质子过滤器离子检测器色谱分离样品引入数据采集及控制W a t e r s C h i n a L t d . 从 L C 到 M S 的转变物态转变 : 液态 -气态带电状态: “ 中性” -离子真空变化 : 760 t o r r -10-5t o 10-8t o r rW a t e r s C h i n a L t d .L C /M S 系统构成E I 电离源样品引入A P I 电离源样品引入W a t e r s C h i n a L t d .传统的样品电离方式 :E I 源E I 源 :电子轰击电离源可得经典的质谱谱图可查询质谱库 , 质谱结果可用工业标准谱库检索 , 是绝对的化合物鉴定相对易得 , 耐受性好谱图可解析 , 阐明结构信息但是 , 电离效率较差 , 测定的分子量范围、流速范围有限 ; 可测的化合物类型有限样品灯丝集电极离子聚焦透镜子去析器-E I 源 L C /M S 系统 :W a t e r s I n t e g r i t y 系统E I 的 宝 贵 遗 产HO O G a m a b u f o t a l i n (I I IM -18+M +M -36+341402 38436691 107123145 175191 79201135M - 162 +24191 107 123145 175191 79201 34138436M -18 +M +M -36+M - 162+24102H i g h R e s M a s s S p e c , B r o w n , K a m a n o , P e t t i t , O r g . M a s s S p e c . , 1972W a t e r s I n t e g r i t y L C /M S S y s t e m , P f i z e r , 1996W a t e r s C h i n a L t d .大气压电离技术电喷雾电离 (E l e c t r o s p r a y I o n i z a t i o n - 大气压化学电离(A t m o s p h e r i c P r e s s u r e C h e m i c a l I o n i z a t i o n -相转化过程W a t e r s C h i n a L t d .3 离子从液滴表面蒸发出来1 含各种离子的液滴-++++-----+++--++++-----+++-2 随着液滴的挥发 , 电荷密度增大 , 离子集中到液滴表面++-+-+++-++-+-+++-W a t e r s C h i n a L t d .x xx H H +M1 电离产生起决定作用的溶剂离子2 样品分子与反应离子发生反应 , 形成离子簇M H +xx xxX H +xx H +M H +3 离子去簇后被传输到质谱的质量分析器X = 溶剂分子 , 比如 H 2O , N H 3等等一般适合分析挥发性化合物 , 也常分析从中性到极性的化合物纯气相离子化过程 , 只产生极少的添加离子谱图简单流速范围大 , 从 0.2 到 2. 0m L /m i n , 而不用分流W a t e r s C h i n a L t d . A P I 电 离 源 (E S I + 电 离 模 式 :软 电 离 产 生 [M +H ]+准 分 子 离 子 峰W a t e r s C h i n a L t d .A l l i a n c e Z Q L C /M S 系统W a t e r s C h i n a L t d . W a t e r s Z Q . . .W a t e r s C h i n a L t d .同 一 样 品 的 质 谱 图 可 能 并 不 一 样 !S a m p l e D e s c r i p t i o n80150 m /z 10S A L I C Y L A M I D E 1 (0. 067 C n (C e n , 2, 80. 00, A rS c a n E S + 1. 19e 8138. 01370121. 2100. 290. 18818293. 9. 8114. 0110. 22. 013303. 98. 9143. 0149. 32-H y d r o x y b e n z a m i d e M W : 137 F o r m : C 7H 7 N O 2 C A S R e g N o : 65-45-225225250162839658092120137C O N H 2O HF i g u r e 1. W i l e y L i b r a r y R e f e r e n c e S p e c t r u m o f S a l i c y l a m i d eW a t e r s C h i n a L t d .C ID 产生的过程A n a l y s i s o f S u l f a m e t h a z i n e b y E l e c t r o s p r a y1000, 000, 000, 000S u l f a m e t h a z i n e[M +H ]+2772782792802812822, 0004, 0006, 0008, 00010, 000000P a r e n t I o n R e g i o nM W 278m /zP o s i t i v e i o n m o d e , E S I , 2 u l /m i n , 50% M e O H :49% H 2O :1% H O A c, 00012, 0, 000, 000150200250300m /zW a t e r s C h i n a L t d .优异的 C I D 技术 (可编程A n a l y s i s o f S u l f a m e t h a z i n e b y E l e c t r o s p r a yS u l f a m e t h a z i n e 10002, 0004, 0006, 0008, 00010, 000[M +H ]+2, 0004, 0006, 0008, 00010, 000F r a g m e n I o n R e g i o nM W 186m /zC 6H 8N 3O 2S150200250300m /zW a t e r s C h i n a L t d .多种 C I D 方式 :一次进样得到全部质谱信息C 4H 9-W a t e r s C h i n a L t d .四极杆质量分析器W a t e r s C h i n a L t d .L C /M S 联用中的转变过程液相色谱的现实情况 :从高效液相色谱流出的化合物存在于大气压条件下的溶液之中质谱的现实情况 :在高真空工作条件下的质谱仅接受气相的离子因此液质联用的接口必须完成:去除溶剂保留样品电离化合物W a t e r s C h i n a L t d .L C /M S 面临的挑战W a t e r s C h i n a L t d .接口E I 电离源的液质联用接口 -热束接口 (T B 雾化 , 去溶剂然后电离E S I 和 A P C I 接口 -Z S p r a y 雾化 , 去溶剂和电离同时完成W a t e r s C h i n a L t d .热束接口原理 :喷雾作用和动量分离雾化室动量分离器 (第 1 & 2级压力为 5 T o r 并且 90% 的溶剂和载气(H e 被去除, 压力为 1. 5 T o r r 并且剩余的 1 0%溶剂和氦气被去除。

液质联用（LCMS）原理简析1.质谱法质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。

质谱的样品一般要汽化，再离子化。

不纯的样品要用色谱和质谱联用仪，是通过色谱进样。

即色谱分离，质谱是色谱的检测器。

离子在电场和磁场的综合作用下，按照其质量数m和电荷数Z的比值(m/z，质荷比)大小依次排列成谱被记录下来，以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的条状图就是我们常见的质谱图。

2.质谱仪质谱仪由以下几部分组成数据及供电系统┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓进样系统离子源质量分析器检测接收器┗━━━━━╋━━━━━━┛真空系统质谱仪一般由进样系统、离子源、分析器、检测器组成。

还包括真空系统、电气系统和数据处理系统等辅助设备。

（1）离子源：使样品产生离子的装置叫离子源。

液质的离子源有ESI，APCI，APPI，统称大气压电离(API)源，实验室常用液质的离子源为ESI源。

电喷雾（ESI）的特点通常小分子得到[M+H]+ ]+,[M+Na]+ 或[M-H]-单电荷离子，生物大分子产生多电荷离子。

电喷雾电离是最软的电离技术，通常只产生分子离子峰，因此可直接测定混合物，并可测定热不稳定的极性化合物；其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和DNA等生物大分子；通过调节离子源电压控制离子的碎裂（源内CID）得到化合物的部分结构。

（2）质量分析器： 由它将离子源产生的离子按m/z分开。

离子通过分析器后,按不同质荷比(M/Z)分开,将相同的M/Z离子聚焦在一起,组成质谱。

质量分析器有：磁场和电场、四极杆、离子阱、飞行时间质谱、傅立叶变换离子回旋共振等。

实验室目前液质的质量分析器类型：三重四极杆（QqQ）：离子源→第一分析器→碰撞室→第二分析器→接收器MS1 MS2Q1 q2 Q3QqQ仪器可以方便的改变离子的动能，因此扫描速度快，体积小，常作为台式进入常规实验室，缺点是质量范围及分辨率有限，不能进行高分辨测定，只能做到单位质量分辨。

LCMS基础LCMS是有机合成中重要的分析工具，解析LCMS谱图也是一项基本技能。

LCMS基本原理和特性1）LCMS的特性：是HPLC和MS的结合，有两者的功能，有没有两者精确。

2）流动相方法：常见0-30，0-60，10-80，30-90四种方法，0，10，30都是指乙腈的含量，乙腈含量越大，流动相极性越小，出峰越靠前。

3）正离子源适用于碱性化合物：含氮化合物更容易粘附氢正离子，在正离子源中容易出分子离子峰。

负离子源适合酸性化合物：酸性化合物更容易轰击掉氢正离子，如酸，酚类化合物。

看LCMS步骤1）先看MS部分, 看有没有所要离子峰, 并且要看清楚该化合物是否有MS信号, 是否掩盖周围的峰。

2)再看HPLC部分, 看含量有多少, 并且要看清楚该化合物是否有强的HPLC信号, 是否掩盖周围的峰。

3) 两者结合起来看, 推测反应进行的程度和反应产生的杂质。

常见加合离子峰[M+Na]+ = [M+23]+ 加钠离子；[M+K]+ = [M+39]+加钾离子；[M+NH4]+ = [M+18]+加铵离子；[M +H +H2O]+ = [M+19]+加水；[M+X]+ 这里X 是指溶剂缓冲液中的阳离子；[M+H+Solvent]+溶剂加合峰，如[M+H+CH3CN]+ =[M+42 ]+ 是CH3CN加合离子，[M+H+CH3OH]+ = [M+33 ]+ 是CH3OH加合离子；减峰：M-56(脱叔丁基）和M-100(脱Boc)，M-16（脱NH3)和M-17（脱水）以及M+2/2（比较常见），其他少见。

同位素峰特别注意精确分子量和摩尔分子量的区别常见氯和溴同位素的表现: 一个氯峰高比M+2/M=1:3;一个溴为峰高比M+2/M=1:1；多个同位素的表现可以用Chemdraw精确模拟。

注意事项1.在LCMS报告中，MS响应强的组分有可能掩盖MS响应弱的组分，可通过提取离子流或扣除背景等方式进行判断，LCMS报告必须将LC和MS两部分结合，相互佐证。