引物设计原则-1
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2020分子诊断学习题(2)
《分子诊断学》习题一、名词解释1、基因:是有功能的DNA，合成含有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核苷酸序列是遗传的结构和功能单位。
2、假基因:或称伪基因，是基因家族在进化过程中形成的无功能残留物，在真核生物多基因家族中存在因突变而失活，不能表达出有活性的产物。
3、结构基因:指能编码蛋白质或RNA的基因。
4、基因家族:真核细胞中许多相关的基因常按功能成套组合被称为基因家族。
5、管家基因:是指所有细胞中均要稳定表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。
6、重叠基因:指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列或者一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分。
7、基因组:细胞中一套完整单体的遗传物质的总和，指生物体全套遗传信息，包括所有的基因和基因间区域。
8、人类基因组计划:主要任务是人类的DNA测序，绘制人类基因组图谱。
9、内含子:是指真核生物基因转录区位于相邻外显子之间的序列及初级转录后加工之后保留于成熟DNA中的序列和转录区内的对应序列，属于非编码序列。
不能参与基因表达调控序列。
10、外显子:是基因(真核生物)转录区的初级转录产物，经过转录后加工之后，保留于成熟DNA中的序列和转录区内的对应序列，属于编码序列。
11、基因表达:只将来自基因的遗传信息合成功能性基因产物的过程。
12、核酸分子杂交:互补的核苷酸序列通过碱基互补配对形成稳定的杂合双链DNA或RNA分子的过程。
13、核酸探针:能识别特异碱基序列的带有标记的一段DNA或RNA分子。
14、聚合酶链反应：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性，低温退火，及适温延伸等几步反应组成一个个周期循环进行，使得DNA得以迅速扩增，具有特异性强，灵敏度高，操作简便省时等特点。
15、巢式PCR：使用两队对引物，一对引物序列在模板的外侧，用于扩增含目的基因的大片段，另一对引物序列在模板内侧，用于扩增目的基因。
第一对引物做PCR的扩增产物，作为第二对引物退火的模板，再进行第二轮PCR，这样经过两次PCR放大，灵敏度得以提高。
引物设计原则(必看)
mi引物设计原则1。
引物的长度一般为15—30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。
引物3'端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加.3。
引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A.另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4。
引物序列的GC含量一般为40-60％,过高或过低都不利于引发反应.上下游引物的GC含量不能相差太大。
5。
引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳.Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4（G+C）＋2（A+T），在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method）.6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。
应当选用3'端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。
引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应.7。
引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4。
5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8. 对引物的修饰一般是在5'端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。
引物序列应该都是写成5—3方向的,Tm之间的差异最好控制在1度之内,另外我觉得扩增长度大一些比较好,500bp左右。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
PCR引物设计要点
PCR引物设计要点PCR引物设计要点1. 书写规则设计引物时，5’端引物与目的序列正义链相同，而3’端引物则与目的序列正义链互补，书写时从引物的5’端至3’端（即5’端引物不变，3’端引物与目的序列互补并相反）；2. 引物长度一般引物长度为18~30碱基（不包括5’端添加的修饰），引物太长和太短都不好；3. GC含量一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，不要有聚嘧啶或聚嘌呤，尤其3’端不应超过3个连续的G或C。
若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴，上下游引物的GC含量不能相差太大；4. 退火温度可以用软件PrimePrimer来计算退火温度，在引物短于20bp时，可以用公式Tm=4(G+C)+2(A+T)-5估计Tm值(解链温度)，有效引物的Tm为55~65℃之间较好，如果待扩增基因的GC含量较高（超过50%），引物的退火温度可设计得高一点，例如接近65℃，因为提高退火温度可以降低非特异性扩增。
一对引物的退火温度应尽量接近，相差范围应在5℃之内；一般初次PCR使用的退火温度比计算出的解链温度低5℃，如果扩不出，可试着将退火温度降低5℃和升高5℃再试一下，但一般不要1℃1℃升，或1℃1℃降，因为这样效果不大；5. 避免与靶DNA的错配引物要具有特异性，与非特异扩增序列的同源性不应超过70%或有连续8个互补碱基同源，可针对基因组BLAST检测，看是否能错配到其它非特异顺序上；6. 避免引物及模版的二级结构区域引物自身避免有连续4个碱基的互补，若不能避开这一区域时，可尝试7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP。
若有可能，也应尽量避免扩增含稳定二级结构的目的片段(可用软件估计，一般待扩区域自由能△G小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功)；7. 避免引物二聚体引物之间避免有连续4个碱基的互补以免形成二聚体，尤应避免3’端的互补重叠；8. 引物3’端1) 3’端不应超过3个连续的G或C，以免使引物在G+C富集序列区错误引发；2) 除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3’端不能发生错配；3) 如扩增编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率；4) 避免在引物的3’端使用碱基A，以免增加使用Taq酶时的错配效率；5）如果片断连入表达载体或转基因载体，基因后面带有其它tag，如His tag,或Fast tag, GFP, GUS 等，注意设计引物时一定要去掉基因的stop codon，否则tag 就没有了；但如果这些tag是在基因之前，则注意去掉基因的start codon，因为此时基因跟在tag之后，用的是载体上tag的start codon。
引物设计原理
引物设计原理引物设计是一种在分子生物学中使用的技术，它可以用来控制基因的表达或用于获取某些基因组的一部分分子序列。
因此，引物设计的准确性和特异性非常重要，它可以满足分子生物学研究对高质量特异性DNA序列的需求。
引物设计原理是引物设计的基础，它涉及到基因组学、分子生物学、基因工程等科学领域，是研究引物设计的思路和方法标准。
分子生物学中的引物设计是基因组学研究的重要组成部分，通过建立特异性的引物，可以提高基因表达的特异性和准确性，从而加快对基因的研究和理解。
因此，引物设计的原理和方法是指其能够实现的标准，也是指DNA、RNA以及含有引物序列的模板的分子结构和表达特异性。
引物设计原理的基础是基因组学研究，由基因组学所获得的结果有助于分子生物学研究，特别是在揭示基因的功能和调控机制上。
利用基因组学获取的序列信息，可以设计具有特定功能的引物，如在载体上的引物序列设计、基因的PCR扩增、连锁反应以及基因编辑，都能够从引物设计获得有效的特异性和准确性。
生物信息学技术经常被用于引物设计，通过运用相关的软件和算法，结合基因组序列和已知的信息，可以进行引物设计。
这些软件有很多种，如OptiMAGE、OligoPerfect、PrimerSelect和GeneRunner 等，它们可以提供一些方便的工具来实现特定的引物设计。
此外，引物设计也应考虑到合成能力，即根据特定条件确定的引物的长度、GC含量和结构，以确保引物的有效性和可生物合成性。
一般而言，引物的最佳长度为18-25个核苷酸，其中包含一个或多个T节段，以简化引物合成过程。
引物的GC含量应保持在30-70％之间，并且不应含有太多的碱基重复（优先选择三个及以下的碱基重复），这有助于避免引物的自反应。
最后，引物设计应考虑引物的热稳定性，即引物在特定条件下的稳定性，引物的Tm值（融合温度）应保持在55-65℃，从而保证引物的有效性。
对于一号引物（环状），Tm值应高于3’端，以减少反应体系的复杂性；对于二号引物（键合），Tm值应与一号引物相同或略低，以减少反应体系的复杂性。
引物设计基本原则
引物设计基本原则引物设计是指在引导读者进入文章主题或者吸引读者注意力的过程中，通过恰当选择和运用引言来达到预期效果的设计过程。
引物的设计不仅能够引导读者入文、稳定读者情绪，还能提高文章的可读性和吸引力。
下面是引物设计的几个基本原则：第一，引物设计要与文章主题相关。
引物在一定程度上是文章的立意之所在，它几乎决定了读者是否会继续阅读。
因此，引物与文章主题要密切相关，能够准确传达出文章的核心思想和信息。
引物与文章主题的相关性是一个引物是否成功吸引读者的关键因素。
第二，引物设计要具有足够的吸引力。
引物要能够立刻吸引读者的注意力，使其对文章产生兴趣。
可以通过新颖的观点、有趣的故事、强烈的情感或者悬疑的描述等方式来增加引物的吸引力。
同时，引物要注意与读者的背景和兴趣相关，尽量选取读者感兴趣的内容，以便更好地吸引读者。
第三，引物设计要具有引导性。
引物不仅要吸引读者，还要能够引导读者进入文章的主题或内容。
可以通过提出问题、引用权威观点、展示案例等方式来引导读者产生思考或者兴趣，从而使其进一步阅读下去。
引物的引导性在一定程度上决定了读者是否会对文章产生深入的理解和共鸣。
第四，引物设计要与写作目的相一致。
不同的写作目的对引物的要求也不同。
如果是科普文章，引物可以采用生活常识或者实验事实等方式；如果是讲故事的文章，可以使用引人入胜的故事片段或者引用名人的话语等方式。
引物与写作目的的一致性能够更好地达到写作的目的，并且使读者在读者的过程中不会产生迷惑或者矛盾感。
第五，引物设计要注意其长度和位置。
引物的长度要适当，过长容易让读者感到疲惫，过短则不足以吸引读者的注意力。
同时，引物一般放在文章的开头或者段落的开头，这样能够更好地引导读者进入文章，提高文章的连贯性和阅读流畅性。
综上所述，引物设计是一项重要的写作技巧，它能够引导读者进入文章主题，并且提高文章的可读性和吸引力。
在引物设计时，需要注意与文章主题相关、具有足够的吸引力、具有引导性、与写作目的相一致，以及注意引物长度和位置等方面的要求。
引物设计原则
引物设计原则
1.合适的引物长度：引物长度通常在18-30个碱基对之间，过长或过
短的引物都不利于PCR扩增的稳定性。
2.适当的引物GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过
低的GC含量都会影响引物和模板DNA的特异性结合。
3.引物特异性:引物应具有高度特异性，可以通过引物序列在数据库
中进行BLAST分析来评估引物的特异性。
4.避免引物自身的二聚体和结构性：引物序列中要避免出现自身二聚
体和结构性，这会干扰PCR扩增的效果。
5.选择高峰结构引物：在引物设计时，优先选择会形成高峰结构的引物，这有助于提高扩增效率。
6.引物末端碱基的特异性：在引物末端碱基选择时，尽量使用能够增
强特异性和避免非特异性扩增的碱基。
7.引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度直接影响PCR扩增反应的
特异性和效率，应根据目标DNA的长度和序列来确定引物的Tm。
8.避免引物之间的交叉杂交：在多引物PCR反应中，引物之间的交叉
杂交会干扰扩增效果，可以通过软件模拟或实验确认引物之间没有相互杂交。
9.引物序列中避免多个重复碱基：引物序列中的多个重复碱基可能导
致非特异性扩增，应避免在引物序列中出现连续的多个重复碱基。
10.引物设计的可操作性和经济性：引物设计时，要考虑到引物合成
的成本和操作的方便性，选择价格适中的合成方法，并确保引物容易操作。
以上是引物设计的原则和考虑因素，通过合理设计和优化引物序列，可以提高PCR扩增实验的特异性、敏感性和效率，从而获得准确和稳定的实验结果。
PCR技术简介
Mg2+浓度：
Mg2+浓度对PCR扩增效率影响极大，浓 度过高可降低PCR扩增的特异性；浓度过 低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失 败，出现假阴性。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
Mg2+浓度引起假阴性解决方案： 设置一组反应，其中每一反应中
的其他离子浓度相同（如Tris.Cl,KCl 等），而MgCl2浓度不同（由 0.5~6mmol/L,每次增加0.5mmol/L)， 由此来摸索最佳Mg2+浓度。
PCR技术的应用
研究领域：
基因克隆；DNA测序；分析突变； 基因重组与融合；检测基因的修饰； 鉴定与调控蛋白质结构的DNA序列； 转座子插入位点的绘图；合成基因的构建；
构建克隆或表达载体； 检测某基因的内切酶多态性等。
PCR技术的应用
临床诊断： 细菌；病毒；螺旋体；支原体；衣原
体；立克次氏体；分枝杆菌等病原体 的鉴定； 人类遗传病的鉴定；
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
模板因素引起假阴性解决方案：
1.配制有效而稳定的消化处理液; 2.提取程序固定,不宜随意改动； 3.模板DNA的溶解液应固定不变。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
酶失活：
1.酶本身的质量问题(供应商的问题）； 2.酶存放时间太长； 3.酶存放方式不当，或其他意外原因； 4.忘记添加Taq酶。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
酶失活引起假阴性解决方案：
1.检查加样程序及过程，看是否忘记加Taq 酶；
2.更换新的Taq酶; 3.新旧两种Taq酶同时使用。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
引物：
1.引物质量； 2.引物浓度； 3.两条引物的浓度是否对称等。
Mg2+浓度对PCR扩增效率影响极大，浓 度过高可降低PCR扩增的特异性；浓度过 低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失 败，出现假阴性。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
Mg2+浓度引起假阴性解决方案： 设置一组反应，其中每一反应中
的其他离子浓度相同（如Tris.Cl,KCl 等），而MgCl2浓度不同（由 0.5~6mmol/L,每次增加0.5mmol/L)， 由此来摸索最佳Mg2+浓度。
PCR技术的应用
研究领域：
基因克隆；DNA测序；分析突变； 基因重组与融合；检测基因的修饰； 鉴定与调控蛋白质结构的DNA序列； 转座子插入位点的绘图；合成基因的构建；
构建克隆或表达载体； 检测某基因的内切酶多态性等。
PCR技术的应用
临床诊断： 细菌；病毒；螺旋体；支原体；衣原
体；立克次氏体；分枝杆菌等病原体 的鉴定； 人类遗传病的鉴定；
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
模板因素引起假阴性解决方案：
1.配制有效而稳定的消化处理液; 2.提取程序固定,不宜随意改动； 3.模板DNA的溶解液应固定不变。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
酶失活：
1.酶本身的质量问题(供应商的问题）； 2.酶存放时间太长； 3.酶存放方式不当，或其他意外原因； 4.忘记添加Taq酶。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
酶失活引起假阴性解决方案：
1.检查加样程序及过程，看是否忘记加Taq 酶；
2.更换新的Taq酶; 3.新旧两种Taq酶同时使用。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
引物：
1.引物质量； 2.引物浓度； 3.两条引物的浓度是否对称等。
引物设计（特别有用,良心推荐）
引物设计（特别有用,良心推荐）引物篇1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
1)引物设计
引物设计的主要原则
（1）引物长度：15-30bp，常用为20bp左右，太短会降低退火温度影响引物 与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难条件下可扩增长至10kb的片段。 （3）引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多 易出
大肠杆菌基因组DNA的提取
基因组DNA的提取通常用于PC物、微生物）的基因组DNA提取方 法有所不同；同种生物的不同各种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及 所含的成分不同，分离方法也有差异。无论何种生物基因组DNA，其提取方 法基本可分为两步：先是温和裂解细胞及溶解DNA，接着采用化学或酶学的 方法，去除蛋白、RNA及其它大分子，再用乙醇沉淀出DNA。常用的经典提 取方法有CTAB法和SDS法。提取基因组DNA总的原则包括： （1）保证核酸一级结构的完整性； （2）其它生物大分子，如蛋白质、多糖、酚类、脂类分子的污染应尽量降到最 低； （3）核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； （4）其它核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
35个循环
• 最终得到引物序列如下：
• 上游引物5‘GTTGGATCCATGAAAGCATTACATTTTC GCG-3‘（BamHI）
• 下游引物5‘TGGGAGCTCATTATTGCATTGCTTTATAA GCG-3‘（SacI）
反应参数： 94℃ 5min 94℃ 1min 55℃ 1min 72℃ 2min 72℃ 10min
现非特异条带。 （4）避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，
否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 （5）引物3”端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避
引物的设计原则
1、引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp；2、引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5'到3’的下降形状也有利于引物与模板的结合；4、ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3'端的ΔG值相对要低，且绝对值不要超过9，否则不利于正确引发反应，3'末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，但在-6时只达到40%，-8时少于20%，-10时接近于0；5、错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带。
但对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。
如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为340以上，而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的；6、Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个指标，解释了序列片段存在的重复几率大小，选取引物时，应该用Frq值相对较低的片段；7、引物二聚体及发卡结构的能量的绝对值一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从而导致PCR不能正常发生；8、3'端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3'端最后一个碱基最好不要是A或T，若是，会导致错配；9、以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5计算Tm值，也就是退火温度。
选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度，最好保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内；10、模板与稳定性较小的引物之间的Tm的差异越小，PCR的效率越高。
因为解链温度也取决于它的长度，如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用端的引物（16-18bp），如果产物长5kb，则用24bp的引物；11、在DNA测序和PCR中最好用5'末端稳定（GC含量多），而3'端不稳定（AT含量多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应；12、引物和产物之间的Tm值相差别太大，20摄氏度范围内最好。
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英文名primer
概念
引物，是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH 上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。
类型
存在有自然中生物的DNA复制引物（RNA引物）和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物（通常为
DNA引物）。
一般所说引物，指DNA引物，以下简称引物。
引物设计原则
引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA 模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。
在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DN A序列。
如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
6. 碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。
降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mo l）。
否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。
△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。
应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。
引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。
（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）
9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。
因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。
3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。
10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mo
l时，扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dG TP对扩增的成功是有帮助的。
11. 引物应具有特异性。
引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。
如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。
有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的P CR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。
在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
做Real Time时,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。
引物设计的要求：
●避免重复碱基，尤其是G.
●Tm=58-60度。
●GC=30-80%.
●3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
●正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
●PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。
●引物的退火温度要高，一般要在60度以上；
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DN A污染的影响。
做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。
对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。
关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。
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常用引物设计软件
■Oligo 6
Oligo 6是目前使用最为广泛的一款引物设计软件，除了可以简单快捷地完成各种引物和探针的设计与分析外，还具有很多其他同类软件所不具有的高级功能：
● 已知一个PCR引物的序列，搜寻和设计另一个引物的序列；
●按照不同的物种对MM子的偏好性设计简并引物；
● 对环型DNA片段，设计反向PCR引物；
●设计多重PCR引物；
●为LCR反应设计探针，以检测某个突变是否出现；
●分析和评价用其他途径设计的引物是否合理；
●同源序列查找，并根据同源区设计引物；
●增强了的引物/探针搜寻手段。
设计引物过程中，可以"Lock"每个参数，如Tm 值范围和引物3’端的稳定性等；
● 以多种形式存储结果；支持多用户，每个用户可保存自己的特殊设置。
■Primer Premier 5.0
Primer Premier 5.0 是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件利用它的高级引物搜索引物数据库巢式引物设计引物编辑和分析等功能可以设计出有高效扩增能力的理想引物也可以设计出用于扩增长达50kb以上的PCR产物的引物序列。
该软件主要由GeneTank 序列编辑，Primer 引物设计，Align 序列比较，Enzyme 酶切分析和Motif 基序分析等几个主要功能板块组成。