1微生物学基础技术

微生物学基础技术---培养基、包扎、灭菌

一、学习目的

•了解微生物学实验课程和教学方法；

•学习培养皿包扎等常规微生物学基础技术；•学会高压蒸汽灭菌锅的使用；

观看在线视频,学习并实践以下技术：

•学习培养基的制备，全班分组制备本学期所需的各种培养基；

•微生物的接种和培养技术;

•培养基及其他材料的灭菌，无菌倒平板的技术；

第I部分

培养基的制作

实验目的

•学习药品的称量方法，

•掌握培养基的配置方法，

•学会高压蒸汽灭菌锅的使用；

•配制本学期实验课程需要的培养基。

实验试剂与器材

▪试剂：

乳糖，牛肉膏，酵母粉，蛋白胨，NaCl，葡萄糖，琼脂粉，1mol/L NaOH，1mol/L HCl；

▪器材：

试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸(pH 5.5-9.0),棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。

实验原理

▪培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。培养基种类繁多。但无论如何，一般均应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐以及生长因素等。

▪基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨、和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。

培养基

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基。液体培养基斜面培养基

平板培养基

固体培养基

微生物的培养

固体平板培养固体斜面培养

液体振荡培养

液体静置培养

各种培养基配方（1L）

1.细菌LB：Tryptone(胰蛋白胨)：10g, Yeast Extract(酵母提取物)：

5g,NaCl(氯化钠)：10g，琼脂粉15克；pH 7.2，121℃灭菌20 min。

2.放线菌高氏1号：可溶性淀粉20g（先用少量冷水把可溶性淀粉调成糊状，用文火加热，再加入水和其他药品）；NaCI0.5g；KNO31g ；

K2HPO4.3H2O 0.5g；MgSO4.7H2O 0.5g ；FeSO4.7H2O 0.01g; 琼脂粉15克,pH 7.4～7.6，121℃灭菌20 min。

各种培养基配方（1L）

3.霉菌PDA：马铃薯200g，去皮，切小块，用电磁炉煮30min，用4层纱布过滤，取滤液定容，再加蔗糖20g，琼脂粉18克，121℃灭菌20min；

4.酵母YPD：酵母粉10g，蛋白胨20g，无水葡萄糖20g，琼脂粉18g，115℃灭菌20min；

培养皿的包扎

•培养皿通常用旧报纸包紧。一般取10套培养皿作一包。注意培养皿的取向应一致。包装时，一边卷滚，一边将两头的报纸往内覆折。

•收尾时将露出来的纸头一并折入里面。最后，将包好的培养皿放在手上轻轻

1、天平的调节

调节天平底部两侧手轮至水平仪气泡处于中心

*称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。称取完毕，立即盖好瓶盖，不要盖错（注意内盖）。

按培养基配方比例依次准

确地称取各种药品放入烧

杯中。

2、称量

3、溶化

水量，用玻棒或磁力棒搅拌溶

解。也可以在电炉、微波炉上

加热使其溶解。待药品完全溶

解后，补充水定容。

4、调pH

在未调pH前,先测量培养基的原始pH,如果偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌,并随时用pH试纸测其pH,直至pH达本实验所需；反之,用1mol/L HCl进行调节。

琼脂的使用

琼脂的特点：

▪凝点和熔点之间的温度相差很大。在水中需加热至95℃时才开始熔化后的溶液温度需降到40℃时才开始凝固，所以它是配制固体培养基的最好凝固剂。琼脂的浓度，通常是液体培养基的1～2%之间。

固体培养基配制中琼脂的使用：

▪方法1：琼脂可以与其他药品同时称量，但需要加热煮沸才能熔化，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。

▪方法2：琼脂也可以待其他药品溶化好，调节pH后，再按照分装的量称入锥形瓶中，注意灭菌前一定充分摇匀；注意：斜面不可以用这样方法配制！

•试管的分装：利用分装器将配制好的培

养基分装入试管内。以其高度的1/4左右

为宜。

•锥形瓶的分装：以量筒或烧杯向锥形瓶

分装培养基，以其高度的1/4--1/3左右为

宜。

分装过程中，注意不要使培养基沾在管(瓶)

分装器

口上，以免沾污塞子而引起污染。（分装

完毕后马上清洗）

•培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上硅胶塞(双层铝箔纸、8层纱布、棉塞等，后两种外面需要报防潮纸)，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。

•在瓶外写好培养基名称和制作日期。

6、加塞和标记

、灭菌

7

将上述培养基进行高压蒸气灭菌

第II部分

高温高压湿热灭菌

121℃

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。

待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能逸出，而增加了锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

高压蒸汽灭菌原理