江苏农业学报(Jiangsu J.of Agr.Sci.),2013,29(2):341~345h ttp://www.js n y x 李文良,毛 立,张纹纹,等.猪瘟病毒糖基化E2蛋白在重组杆状病毒中的表达与鉴定[J].江苏农业学报,2013,29(2):341⁃345.doi:10.3969/j.issn.1000⁃4440.2013.02.019猪瘟病毒糖基化E2蛋白在重组杆状病毒中的表达与鉴定李文良, 毛 立, 张纹纹, 杨蕾蕾, 王小敏, 江杰元(江苏省农业科学院兽医研究所,农业部兽用生物制品工程技术重点实验室,国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014)收稿日期:2012⁃07⁃02基金项目:江苏省农业科技自主创新基金项目[DCX(10)4129]作者简介:李文良(1984⁃),男,河南开封人,博士,助理研究员,主要从事动物传染病防治和诊断技术研究㊂(E⁃mail)kfliwen⁃liang@通讯作者:江杰元,(Tel)025⁃84391135;(E⁃mail)jieyuanj @hotmail.com 摘要: 为获得糖基化的重组猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白,通过PCR 扩增出去除C 端跨膜区的猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)E2蛋白基因,前面包含糖基化信号肽,末端引入StrepⅡ标签序列,将其克隆到Bac⁃to⁃Bac 杆状病毒表达系统pFastBac TM HT B 载体中,筛选获得阳性重组质粒pF⁃ge2,转化至含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac 感受态大肠杆菌中,经蓝白菌落筛选和PCR 鉴定,获得重组表达载体rBac⁃ge2㊂在脂质体介导下转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rAc⁃gE2㊂Western⁃blot 试验结果表明,重组蛋白得到正确表达,具有良好的抗原性;用糖苷酶PNGase F 处理后重组蛋白分子量减小到40000,证明重组蛋白为糖基化蛋白㊂这为进一步研究E2蛋白的功能及CSFV 新型亚单位疫苗的开发奠定了基础㊂关键词: 猪瘟病毒;E2蛋白;糖基化;杆状病毒表达系统中图分类号: S858.28 文献标识码: A 文章编号: 1000⁃4440(2013)02⁃0341⁃05Expression and identification of the glycosylated E2protein of classical swine fever virus (CSFV )in recombinant baculovirusLI Wen⁃liang, MAO Li, ZHANG Wen⁃wen, YANG Lei⁃lei, WANG Xiao⁃min, JIANG Jie⁃yuan(Institute of Veterinary Medicine ,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences /Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology ,Ministryof Agriculture /National Center for Engineering Research of Veterinary Bio⁃products ,Nanjing 210014,China ) Abstract : In order to get the glycosylated E2protein of classical swine fever virus (CSFV),the gene which con⁃tains glycosylation signal at 5′terminal and StrepⅡmarker sequence at 3′terminal of hog cholera lapinized virus (HCLV)without transmembrane region (TMR)was amplified by RT⁃PCR.The RT⁃PCR product (ge2)was cloned into the donor vector pFastBac TM HT B of Bac⁃to⁃Bac baculovirus expression system.After PCR,enzyme digestion and sequencing analy⁃sis,the purified recombinant plasmid pF⁃ge 2was transformed into Escherichia coli competent cells DH10Bac containingbaculovirus shuttle vector.After twice blue⁃white selections,the white colonies were selected and the recombinant bacmidrBac⁃ge2was verified by PCR.After the transfection of recombinant bacmid into Sf9insect cells,the recombinant baculov⁃irus rAc⁃gE2was obtained and was further confirmed by Western blot with antibodies against Strep Ⅱmarker and E2protein.After treated with PNGase F ,the molecular weight of recombinant protein reduced to 40000,which suggested that it was glycosylated protein.Key words : classical swine fever virus (CSFV);E2protein;glycosylation;baculovirus expression sys⁃tem1. All Rights Reserved. 猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病,是世界动物卫生组织(OIE)规定的必须报告的疫病,对世界养猪业造成严重危害㊂CS⁃FV属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivir⁃us),基因组为单股正链RNA,长约12.3kb,编码1个由3900个氨基酸组成的多聚蛋白[1]㊂在宿主和病毒蛋白酶作用下裂解成4个结构蛋白[C㊁E0(E rns)㊁E1㊁E2]和8个非结构蛋白(N pro㊁p7㊁NS2㊁NS3㊁NS4A㊁NS4B㊁NS5A㊁NS5B)[1]㊂其中囊膜糖蛋白E2介导病毒的感染,诱导机体产生中和抗体,保护机体抵抗病毒的感染,是重要的保护性抗原之一[2⁃4]㊂因此,E2蛋白是研制新型活载体疫苗㊁亚单位疫苗的候选抗原[1,5⁃8]㊂E2蛋白是糖基化蛋白,最近有研究结果表明,E2㊁E0的糖基化对其免疫保护作用起决定作用,未糖基化的蛋白质不具有免疫保护作用[9]㊂这为新型亚单位疫苗的研制提供了重要的理论依据㊂杆状病毒表达系统具有表达水平高,表达产物可进行翻译后加工,其抗原性㊁免疫原性和功能等生物活性与天然蛋白相似等特点㊂国内外许多学者采用该系统对E2蛋白进行了表达,目前国外已有商品化疫苗上市,如拜耳公司的BAYOVAC®CSF Mark⁃er和英特威公司的Porcilis®Pesti,这两种疫苗还有配合使用的ELISA抗体鉴别检测方法[1]㊂国内许多单位都利用杆状病毒表达系统进行E2蛋白表达鉴定工作,但多为单独表达E2蛋白,没有考虑引入信号肽和重组蛋白糖基化水平的检测[7⁃8,10⁃11],也很少有对其进行糖基化水平的研究[12]㊂本研究试图利用Bac⁃to⁃Bac杆状病毒表达系统构建表达猪瘟病毒糖基化E2蛋白的重组杆状病毒,并对目的蛋白的表达特性及其抗原性进行鉴定,旨在为其免疫学特性和CSFV新型亚单位疫苗的研究奠定基础㊂1 材料与方法1.1 材料与试剂Bac⁃to⁃Bac杆状病毒表达系统(包括转移载体质粒pFastBac TM HT B㊁DH10Bac细菌和Sf9昆虫细胞)由本实验室保存;限制性内切酶㊁T4DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司;Trizol试剂购自Invitrogen公司;反转录试剂盒㊁Taq酶㊁大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自杭州Axygen公司;转染试剂购自Promega公司;HRP标记的兔抗猪IgG和羊抗兔IgG购自北京博奥森生物技术有限公司;DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;兔抗StrepⅡ标签多抗购自南京金斯瑞生物科技有限公司;PNGase F购自New England BioLabs公司㊂1.2 引物设计和ge2基因的扩增参照文献[9]并根据HCLV E2基因序列设计RT⁃PCR扩增用引物,gE2F:5′⁃AT GGATCCATG⁃GTCGTGCAAGGTGTGATATGGCTGTTACTGGTAACTGG GGCACAAGGC CGGCTAGCCTGCAA⁃3′;gE2R:5′⁃GGA CTCGAGTCA CTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCA TTCT⁃GCGAAGTAATC⁃3′,上下游引物分别引入糖基化信号肽序列和StrepⅡ标签序列(斜体部分)以及Bam H I和Xho I位点(下划线部分),引物由南京思普金生物科技有限公司合成㊂取200μl猪瘟兔化弱毒疫苗毒(南京天邦生物科技有限公司提供),加入1ml Trizol试剂,振荡混匀,静置10min,加入200μl氯仿,剧烈振荡,12000 r/min㊁4℃离心10min,小心吸取上清,加入等体积异丙醇混匀,-20℃放置2h,12000r/min㊁4℃离心15min,弃上清,加入75%乙醇洗涤,干燥,加入10μl无Rnase的双蒸水溶解RNA㊂按照反转录试剂盒操作说明用引物gE2R进行反转录,具体为:2×ES reaction mix10μl,EasyScript RT/RI enzyme mix1μl,引物gE2R1μl,RNA5μl,无Rnase的双蒸水补足至20μl㊂42℃反应45min, 85℃加热5min灭活反转录酶,以反转录产物为模板,进行PCR扩增㊂PCR反应体系为:gE2F㊁gE2R (10pmol/L)各1μl,dNTPs(2.5mmol/L)2μl,10×PCR buffer2.5μl,模板4μl,Taq酶(5U/μl)0.5μl,灭菌双蒸水补至25μl㊂循环参数:94℃5min; 94℃30s,56℃30s,72℃1min,35个循环;72℃10min㊂10g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物㊂1.3 重组载体质粒pF⁃ge2的构建与鉴定将回收的目的基因用Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切,回收纯化之后克隆入同样酶切处理的转移载体质粒pFastBac TM HT B中,转化E.coli DH5α感受态细胞㊂对PCR和Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定为阳性的质粒进一步测序,将序列正确的阳性重组质粒命名为pF⁃ge2㊂243江苏农业学报 2013年第29卷第2期. All Rights Reserved.1.4 重组质粒rBac⁃ge2的构建按照Bac⁃to⁃Bac杆状病毒表达系统操作说明,将阳性质粒pF⁃ge2转化含Bacmid质粒的感受态细胞DH10Bac,经两次蓝白菌落筛选,挑取白色菌落培养,提取Bacmid质粒,利用gE2F和M13R进行PCR鉴定,获得含ge2基因的重组质粒rBac⁃ge2㊂1.5 重组杆状病毒的获得㊁PCR鉴定与病毒扩增按照转染试剂的操作说明将重组质粒rBac⁃ge2转染Sf9细胞,27℃静置培养,每天观察细胞病变情况㊂在转染后第5d收获细胞培养上清, 500g离心10min得到上清,获得第1代重组杆状病毒,命名为rAc⁃gE2,置4℃避光保存㊂提取第1代杆状病毒DNA,用引物gE2F和gE2R PCR扩增目的基因,以鉴定外源基因是否整合进重组杆状病毒基因组㊂将第1代病毒继续接种对数生长期的Sf9细胞,27℃培养3~4d至细胞出现明显病变时,即可收获上清得到第2代病毒,用同样的方法获得第3代病毒,每一代病毒均置4℃避光保存㊂1.6 重组E2蛋白在Sf9细胞中的表达与West⁃ern⁃blot鉴定 将第3代重组杆状病毒感染Sf9细胞,同时设野生型杆状病毒感染Sf9细胞作为对照,72h后收获细胞培养物,弃去细胞培养上清,加入预冷的PBS (0.01mol/L㊁pH7.2),反复冻融3次,超声裂解细胞,4℃㊁12000r/min离心15min,吸取上清,加入2×Loading buffer煮沸10min㊂取20μl样品进行SDS⁃PAGE,Western⁃blot鉴定采用StrepⅡ标签多抗和CSFV阳性猪血清(购自中国兽医药品监察所)进行㊂SDS⁃PAGE电泳结束后,采用半干转印法将蛋白质转印到硝酸纤维素膜上,50g/L脱脂乳室温封闭4h,分别加入1∶1000稀释的StrepⅡ标签多抗和1∶200稀释的CSFV阳性猪血清,37℃孵育2h, PBST洗涤3次,加入1∶2000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG和兔抗猪IgG,37℃孵育1h,PBST洗涤3次,加入DAB显色液,观察特异性蛋白条带㊂1.7 重组蛋白糖基化检测参照PNGase F操作说明书,取重组蛋白18μl,加入2μl10×变性缓冲液,100℃处理10min,然后加入3μl10×反应缓冲液㊁3μl10%NP⁃40和4μl 糖苷酶PNGase F,37℃作用1h㊂与野毒蛋白㊁未处理蛋白一起,以StrepⅡ标签多抗为一抗进行West⁃ern blot,操作同方法1.6,观察处理前后蛋白质分子量的变化㊂2 结果2.1 基因扩增与重组转移载体的构建将PCR扩增的目的基因(图1A)克隆入pFast⁃Bac TM HT B中,转化E.coli DH5α感受态细胞,挑单菌落提取质粒,进行PCR鉴定㊂取PCR阳性质粒进行Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切,获得一条约1100bp 的片段(图1B)㊂测序结果证实ge2基因正确克隆入pFastBac TM HT B,且序列与原有序列完全一致,符合原有阅读框,将该重组质粒命名为pF⁃ge2㊂1:PCR产物;2㊁3:Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切pF⁃ge2;M:DNA marker DL2000㊂图1 ge2基因的RT⁃PCR扩增(A)和重组质粒pF⁃ge2的酶切鉴定(B)Fig.1 Amplification of ge2gene(A)and identification of the recombinant plasmid pF⁃ge2(B)2.2 重组质粒rBac⁃ge2的构建与鉴定将pF⁃ge2转化含Bacmid质粒的感受态细胞DH10Bac,发生位点特异性的转座,经3种抗生素(卡那霉素㊁四环素㊁庆大霉素)抗性筛选和蓝白菌落筛选,挑白色菌落培养,提取质粒,用gE2F和M13R进行PCR鉴定,扩增出大小约1800bp的条带(图2),而以Bacmid为模板的对照中未扩出条带,证明成功获得重组质粒rBac⁃ge2㊂2.3 重组病毒的获得与重组蛋白的Western⁃blot 鉴定 用rBac⁃ge2转染第1代Sf9病毒细胞病变出现不明显,第2代接种后3d就可看到明显的细胞病变:细胞变大㊁变圆㊁脱落㊂提取重组病毒rAc⁃gE2基因组DNA,采用PCR方法用引物gE2F和gE2R 扩增ge2基因,在1100bp左右可见明显条带㊂取343李文良等:猪瘟病毒糖基化E2蛋白在重组杆状病毒中的表达与鉴定. All Rights Reserved.1:野生型Bacmid;2㊁3:重组质粒rBac⁃ge2;M:DNA marker DL2000㊂图2 rBac⁃ge2的PCR鉴定Fig.2 Identification of rBac⁃ge2by PCR感染后72h细胞裂解上清用StrepⅡ标签多抗和CSFV阳性猪血清对重组蛋白进行Western⁃blot鉴定,结果如图3所示㊂两种抗体均能与重组蛋白产生特异性结合,而野生型病毒感染的细胞无此染色反应条带㊂A:一抗为StrepⅡ多抗;B:一抗为阳性猪血清;1:野生型杆状病毒接种Sf9细胞后72h收获样品;2:重组病毒rAc⁃gE2接种Sf9细胞后72h收获样品;M:蛋白质分子量标准㊂图3 重组病毒rAc⁃gE2的Western⁃blot鉴定Fig.3 Western⁃blot analysis of gE2protein expressed in rAc⁃gE22.4 重组蛋白糖基化水平的检测将重组蛋白用PNGase F处理后与野毒蛋白㊁未处理蛋白一起进行Western⁃blot㊂如图4所示,未处理蛋白分子量约50000,处理后蛋白分子量减为40000,符合E2蛋白的预计分子量,表明成功获得糖基化的E2重组蛋白㊂3 讨论杆状病毒表达系统是目前常用的真核表达系统1:蛋白质分子量标准;2:野生型杆状病毒感染对照;3:未处理的gE2;4:PNGase F处理的gE2㊂图4 重组蛋白糖基化水平的检测Fig.4 Detection of glycosylation of gE2protein之一,其表达外源蛋白具有产量高㊁抗原性好㊁操作简便快速等优点,已在多种疫病研究中得到广泛应用㊂此外,杆状病毒表达系统具有与动物细胞相似的转录翻译及翻译后加工等功能,包括糖基化㊁磷酸化㊁酰基化㊁信号肽切除等,外源蛋白在细胞内可以进行正确的折叠而基本保持原有的生物活性㊂因此,杆状病毒表达系统经常用来表达具有特定结构功能的糖蛋白㊂E2蛋白76位氨基酸含有1个O⁃糖基化位点,在116㊁121㊁185㊁229㊁260和297位氨基酸含6个N⁃糖基化位点[9,13⁃14]㊂对于病毒的糖蛋白来说,糖基化会影响蛋白质的构象和中和抗体的产生,去除这些糖基化位点对其抗原性影响可能有3种结果:增强㊁降低或无关㊂研究结果表明E2蛋白76㊁116㊁121㊁185㊁229位氨基酸的突变会明显降低重组E2蛋白诱导中和抗体产生的滴度[9]㊂因此,获得正确糖基化的E2蛋白对于CSFV诊断方法的建立和新型疫苗的研制至关重要㊂本研究克隆了包含信号肽的E2蛋白基因,采用StrepⅡ多抗和阳性猪血清进行Western blot检测证明获得了糖基化的重组E2蛋白,且2种抗体检测均可见2个明显条带,这可能是蛋白糖基化程度不同所致㊂而采用针对杆状病毒表达载体N端His标签的单抗鉴定未见目的条带,表明成熟的蛋白质不包含信号肽和融合的载体蛋白部分㊂用PNGase F处理重组蛋白,蛋白质分子量减小到40000,进一步证明表达的重组E2蛋白是糖基化蛋白㊂443江苏农业学报 2013年第29卷第2期. All Rights Reserved.E2蛋白的羧基端含有约40个氨基酸组成的跨膜区(Transmembrane region,TMR),该区域中疏水性氨基酸的比例高达65%以上,尤其是第356~375位的氨基酸,疏水性极强,它的存在对重组蛋白的表达有影响,而该区域不含有关键的抗原表位㊂研究结果表明去掉跨膜区可明显提高蛋白质的表达量和可溶性[15]㊂本研究在去除跨膜区的基础上在蛋白质末端引入8个氨基酸的StrepⅡ标签序列,利于切除信号肽后的E2糖蛋白的鉴定和纯化,且可以作为亚单位疫苗的阳性标记与非结构蛋白的阴性标记共同用于野毒感染抗体的检测㊂总之,本研究结果表明E2蛋白在重组杆状病毒中得到正确表达,且可以糖基化,具有良好的抗原性,可以与相应抗体发生特异性反应,这为CSFV基因工程亚单位疫苗的研制和诊断方法的建立奠定了基础㊂参考文献:[1] DONG X N,CHEN Y H.Marker vaccine strategies and candidateCSFV marker vaccines[J].Vaccine,2007,25(2):205⁃230.[2] WEILAND E,STARK R,HAAS B,et al.Pestivirus glycoproteinwhich induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide⁃linked heterodimer[J].J Virol,1990,64(8):3563⁃3569. 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