Brdu细胞增殖评价方法by HAN

细胞增殖检测的常见方法细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础，是生物体的重要生命特征。

检测细胞在培养基或组织中的生长速率，对于细胞生长和分化研究至关重要。

在药物开发过程中也常被用于评估药物的毒性和对癌细胞生长的抑制情况。

细胞增殖检测通常是基于DNA含量或细胞代谢实现的，主要的研究方向为对活细胞的代谢活性的检测（基于CCK-8、WST、XTT、MTT等）及对DNA合成的检测（基于BrdU、EdU），可通过体内成像、微孔板或流式细胞术检测等多种技术进行细胞示踪。

以下是常见的三种方法：使用四唑盐进行代谢活性检测通过添加四咪唑盐到细胞中可进行线粒体内酶代谢活性的测定。

活细胞能将四咪唑盐（如CCK-8、MTT、XTT、WST-1）还原成有色的甲瓒或甲瓒盐（Formazan），可通过分光光度计或酶标仪进行检测。

其中Cell Counting Kit-8（CCK-8试剂盒）是由同仁化学研究所（Dojindo）开发的检测细胞增殖、细胞毒性的试剂盒，为MTT法的替代方法，CCK-8被细胞内脱氢酶生物还原后生成的橙色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，生成的甲臜量与活细胞数量成正比。

具体是利用四唑盐——WST-8，它在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原成水溶性的甲臜染料。

WST-8法检测细胞增殖、细胞毒性实验的灵敏度比其它四唑盐如MTT, XTT, MTS或WST-1高。

测定ATP水平检测细胞增殖活细胞需要不断以ATP的形式输入自由能，因此通过检测ATP的增加水平可检测细胞增殖。

例如sigma的ATP Bioluminescence Assay Kit HS II及ATP Bioluminescence Assay Kit CLS II)是通过经典的荧光素酶发光对ATP检测定量的试剂盒。

前者主要应用于高灵敏度检测极低浓度ATP的实验，后者主要应用于当有持续信号产生而需要高重复性结果的实验。

brdu检测细胞增殖原理BRDU（溴脱氧尿嘧啶）检测是一种常用的细胞增殖检测方法，可以用于检测细胞的DNA复制活动。

本文将详细介绍BRDU检测细胞增殖的原理。

在细胞增殖过程中，细胞准备进入S期据以复制DNA。

BRDU是一种结构类似于脱氧尿嘧啶（dU）的合成核苷酸，可在DNA合成过程中取代dU。

由于BRDU的存在，DNA序列中会出现一些BRDU的标记，这样可以通过抗-BRDU的特异性抗体来检测BRDU的分布情况。

BRDU检测主要包括以下几个步骤：1.处理组织或细胞：将要检测的组织或细胞培养在含有BRDU的培养基中。

BRDU可以在细胞培养过程中通过核苷酸遵循细胞DNA复制路径进入DNA链中。

2.修复细胞：在BRDU处理后，细胞被固定和穿孔，以便于抗体更好地进入细胞中。

3.渗透化细胞：使用洗涤缓冲液渗透化细胞膜，以保证抗体能够穿透进入细胞内。

4.抗体染色：使用抗-BRDU的特异性抗体与BRDU结合，抗体一般会与细胞中的BRDU-DNA结合物与抗体起反应而形成稳定的复合物。

5.信号增强：使用二抗来增强BRDU的检测信号，并且与抗体结合的酶系统来产生可见的发光或荧光信号。

6.成像和分析：使用显微镜或其他成像系统来观察标记的细胞或组织，并通过图像分析软件进行图像处理和数据分析。

BRDU检测可静态观察其中一时间点细胞的增殖状态，也可动态观察细胞增殖速率。

通过计算BRDU标记的细胞数量与总细胞数量之比，可以得到相对增殖活性或增殖水平。

此外，BRDU检测还可用于检测细胞周期的一些特征，如细胞周期持续时间、细胞周期分布等。

BRDU检测具有以下几个优点：1.原理简单：BRDU检测的步骤相对简单，不需要耗费过多的时间和成本。

2.可定量：通过计算标记的细胞数量可得到具体的增殖活性指标。

3.高灵敏度：BRDU检测可以对细胞增殖水平进行高灵敏度的检测，能够检测到低增殖水平的细胞。

4.适应范围广：BRDU检测适用于多种细胞类型，包括原代细胞和细胞系。

EdU细胞增殖检测法的操作教程（附文献）细胞增殖的能力是评价细胞、代谢、生理、病理状况、细胞活性、基因毒性等的重要指标之一。

细胞增殖虽然与多种因素有关，比如细胞代谢活性、与细胞增殖相关的蛋白表达、ATP的浓度等等，但是检测细胞增殖现象的zui直接zui准确的方法就是用荧光探针直接检测遗传物质DNA的合成，这种方法是研究细胞增殖、信号通路、DNA修复及分化等等方向常用的方法。

目前，基于DNA的合成原理，人们zui初开发了工具是BrdU染色法, 但是这种方法操作耗时长，往往需要过夜处理细胞，操作繁杂，比如需要DNA变性、抗原修复以及抗原抗体反应等操作，后来在BrdU的基础上，人们开发出了革命性的探针--EdU，这种方法不需要繁杂的操作，节约时间，且反应更灵敏和准确。

并且与MTT/WST-1或者CCK-8这种依靠化学显色法只能得到一个折线图的方法相比，EdU 细胞增殖检测法可以得到高清细胞增殖现象数据图，可视化展示数据、更直观、更具视觉效果!EdU的检测原理是什么？EdU可以说是一款革命性的细胞增殖状态检测方法与传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法相比，EdU只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内更容易扩散，不需要严格的样品变性(酸解、热解、酶解)处理，有效地避免了样品损伤，有助于在组织、器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况，具有更高的灵敏度和更快的检测速度。

EdU细胞增殖检测法的操作教程一、首先用 EdU 来标记细胞注意:本实验样本是Hela 细胞，如果使用其它类型的细胞，实验可能需要做调整。

建议 EdU 起始浓度是10 µM，或者根据细胞类型设置几个梯度预实验摸索zui佳EdU浓度，再进行正式实验。

1.在六孔板里的盖玻片上培养细胞，使其生长至所需密度后处理细胞；2.用 10 mM EdU 溶液在无血清培养基中制备 2x EdU 工作溶液；3.预热 2x EdU 溶液，然后将 2x EdU 溶液添加到等体积含有实验细胞的培养基中，获得 1x EdU 溶液。

Brdu检测细胞删殖真验之阳早格格创做真验支配:1．铺细胞，每个3.5cm dish 10万个，正在37℃、5%CO2孵箱中培植72h（细胞稀度至50-60%安排）.2．Brdu（5-溴-2′-脱氧尿苷）加进培植细胞中，1mg/ml，标记表记标帜48h.(量：Brdu以铺谦所有dish底里为准.)3．牢固：PBS洗细胞爬片3次，屡屡5min，正在摇床上摆动荡涤，4%PFA牢固30min.4．变性：将牢固佳的细胞爬片用PBS洗3次，屡屡5min，2mol/L的HCl正在37℃条件下变性5min，可搁置于37℃恒温孵箱，应用启心膜把培植皿启佳.（120r/m）5．中战：0.1mol/L的硼酸钠（PH8.3）中战10min，PBS洗3次，屡屡5min.（50r/m）6．加进1ml的0.2%TritonX-100，10min.7．吸出TritonX-100，用PBS洗3次，屡屡5min.8．加进1ml 3%的BSA启关，室温1h，可正在摇床上摆动. 9．吸出BSA，用PBS洗3次，屡屡5min.10．加一抗（尿嘧啶脱氧核苷Brdu（鼠单抗）1:200），用1%BSA稀释，4度过夜.11．将孵佳一抗的细胞爬片用PBS洗3次，屡屡10min. 12．加两抗（羊抗鼠IgG/Alexa Fluor5941: 100），用1%BSA稀释，躲光室温孵育1h.（60 r/min）13．将孵佳两抗的细胞爬片用PBS洗3次，屡屡10min. 14．加DAPI染细胞核，储藏浓度为1mg/ml，应将DAPI真足混匀，可用脚弹几下，普遍稀释比率为1:1000（用PBS稀释），躲光室温反应10min.15．将DAPI染佳的细胞爬片用PBS洗3次，屡屡10min. 16．中性树胶启片，荧光隐微镜瞅察，200×镜下与5个视线，计数Brdu阳性细胞战蓝染的细胞核数目，而后举止统计领会.试剂配造：a.Brdu的溶解：室温下，将250mg粉终溶于 2.5ml的DMSO中，储藏浓度为100mg/ml分拆，每管120ul，-20℃死存.b. 2 mol/L HCl：与8.333mL 12mol/L HCl的浓HCl，加进DDW定容至50 mL.c. 0.1 mol/L硼酸钠：称量 1.907g硼砂（Na2B4·10H2O381.36 g/mol），加进DDW定容至50mL，调PH=8.3.d. 0.2% TritonX-100：有0.5%的 Triton-100（2.5mL本液溶解于47.5mL的PBS中），用PBS稀释至0.2%.e. 3%BSA：称量1.5gBSA，溶解于50 mL的PBS中.f. 1% BSA：用PBS稀释3%BSA至1%.g.4%FPS：4%多散甲醛.尔是用DDW配造的，厥后尔创造很易溶，磁力搅拌器加热搅拌，虽然温度统造正在60℃以下，也经常担心多散甲醛领会为甲醛，所以，尔便归纳为如下：提前配造.4%多散甲醛溶液（pH7.2）试剂：多散甲醛（PFA）4g DDW至100ml配造要领：称与4g多散甲醛（粉终状），置于三角烧瓶中，加进80mlDDW，搁进37恒温火浴箱，每隔1-2小时摇摆混匀，16-24小时PFA会真足溶解.补充DDW，安排PH 值.真验本理：1.免疫染色真验的基根源基本理利用牢固剂（常常是甲醛或者多散甲醛）将细胞牢固，使得细胞膜的通透性大大减少，而且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋黑变性，进而使通透性进一步加强.利用仄常羊血浑启关，不妨令许多蛋黑先与血浑内的非特同性抗体分离，而特同性的抗体由于能源教的关系不妨通过比赛性的反应与脚段蛋黑分离，那一历程不妨包管抗体识别的特同性.两抗不妨特同性辨别一抗的Fc天区，利用两抗连交分歧的荧光基团，便不妨正在荧光隐微镜下瞅察到分歧的荧光，进而隐现脚段基果的表黑情况.2.BrdU标记表记标帜本理细胞删殖周期包罗G1、S、G2、M 4个时期，其中S期是DNA合成期，细胞内DNA举止半死存复造，百般形成DNA的本料掺进到DNA中.BrdU动做一种胸腺嘧啶核苷的类似物（其化教结构特性是胸腺嘧啶的碱基嘧啶环上与5位C本子连交的甲基被溴代替），像胸腺嘧啶核苷一般可掺进到细胞合成的DNA中.当细胞处于DNA合成期（S期）而共时又有BrdU存留时, 便会有BrdU掺进新合成的DNA 中，只消细胞不必亡，那种BrdU便正在胞核的DNA中少久存留.掺进到DNA的BrdU可通过抗BrdU单克隆抗体正在构造切片或者细胞爬片上隐现.BrdU抗体比较大，由于DNA单链结构的位阻，BrdU 抗体无法曲交与单链上的BrdU分离，必须先用使DNA部分变性，那样变性了的DNA单链上的BrdU才搞与BrdU 抗体分离，果此搞BrdU细胞删殖真验一定要变性，天然变性的要领包罗酸解，热解等，然而是要注意变性的程度也很要害.修议采与EdU细胞删殖检测要领，无需变性，无需酶解，无需抗体，小分子染色，3小时完毕真验.EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，不妨正在细胞删殖时期代替T渗进正正在复造的DNA分子，通过鉴于EdU与Apollo?荧光染料的特同性反应检测DNA复造活性，通赶快、更敏捷、更准确.EdU检测染料惟有BrdU抗体大小的1/500，正在细胞内很简单扩集，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可灵验检测，可灵验预防样品益伤，正在细胞战构造火仄能更准确天反映细胞删殖等局里.该要领能对于细胞周期举止赶快而宁静的丈量, 而且标记表记标帜BrdU的细胞只消不受到紫中线映照，对于细胞自己不功能益伤.该技能可应用到追踪检测移植细胞的存活、瓦解战功能状态.3.DAPI染色本理DAPI为4’，6两脒基-2-苯吲哚(4’，6—diamidino-2—phenylindole)，能与单链DNA小槽，特天是AT碱基分离，也可拔出少于3个连绝AT碱基对于的DNA序列中.当它与单链DNA分离时，荧光强度巩固20倍，而与单链DNA分离则无荧光巩固局里，果此是一种浅易、赶快战敏感天检测DNA的要领.DAPI的荧光强度虽较Hoechst矮，然而荧光宁静性劣于Hoechst；其特同性较溴化乙啶(ethidlium bromide，EB)战碘化丙啶(propidium iodide，P1)下.DAPI的华文称呼是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种时常使用的荧光染料，其效率机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA单螺旋的凸槽部分不妨爆收相互效率，进而与DNA的单链稀切分离.分离后爆收的荧光基团的吸支峰是358nm而集射峰是461nm，正佳UV（紫中光）的激励波少是356nm，使得DAPI成为了一种时常使用的荧光检测旗号.ANALYSIS OF CELL CYCLE1. INTRODUCTIONCell cycle and apoptosis are very important functional parameters to assess the cellular metabolism, physiology and pathology. Several techniques have been developed to quantitate these parameters utilizing the differential staining of fluorescent dyes. We are describing four different flow cytometric methods, two for the discrimination of cell cycle phases (A and B) and two for the simultaneous assessment of cell cycle and apoptosis (C and D).A) Bromodeoxyuridine/Propidium IodideThe classical method for the analysis of cell cycle distribution is the flow cytometric measurement of DNA content which can simultaneously determine the incorporation of Bromodeoxyuridine (BrdU). The procedure requires that DNA is partially denatured to expose incorporated BrdU to a specific antibody. Denaturation is necessary because antibodies developed so far bind only to BrdU in single-strand DNA. The remaining undenatured DNA is then stained with Propidium Iodide (PI). Green fluorescence from the fluorescein-conjugated antibody is a measure of BrdU incorporation. Red fluorescence from the PI is a measure of DNA. The protocol described hereuses high-molarity HCl for the denaturation of DNA. Furthermore, this method may be utilized either for unfixed or for fixed cells in suspension.B) Cyclins/Propidium IodideCyclins are key components of the cell cycle progression machinery. In particular, the expression of cyclins D, E, A and B1 provides new cell cycle landmarks that can be used to subdivide cell cycle into several distinct subcompartments. In this procedure cyclins expression is detectable using specific monoclonal antibodies (mAbs), and is analysed in respect to DNA content.Generally, the peak of expression of cyclin D1 can be detected in early G1, the peak of cyclin E is typical of G1/S transition, the peak of cyclin A can be detected during G2/M phases and cyclin B1 is typical of late G2/M. Using this method, compared to the above mentioned protocol, it is possible to distinguish G0 from G1 and G2 from M phases. However, it is necessary to keep in mind that not all cell types behave in the same manner (for example, cyclin D1 is detectable not only in G0/G1 but also in G2/M, even if in a very few cell types).C) TUNEL/Propidium IodideOne of the most used protocol for the determination ofapoptosis in the different phases of cell cycle is the enzymatic in situ labeling of apoptosis-induced DNA strand breaks (TUNEL). Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) have been used for the incorporation of fluorescein-labeled nucleotides to DNA strands breaks in situ . DNA content is revealed by red fluorescence from PI. In order to have more details, see the Chapters related to TUNEL technique.D) F-Actin/Propidium IodideThe analysis of apoptotic cells and estimation of their cell cycle specificity is also possible using a recent method. This is based on identification of apoptotic cells which have modified their cytoskleton and their DNA content. In specific, paraformaldehyde (PFA) fixation followed by staining of F-actin with fluorescein-conjugated phalloidin and of DNA with PI, are used. Furthermore, this procedure may be utilized also for adherent cells.A) BrdU/PI PROTOCOLA.2.1 MaterialsBrdU (A2), washing buffer (A1), HCl 4 M, Borax buffer (A1), anti-BrdU antibody (A2), goat-anti-mouse-FITC antibody (A2), PI buffer (A1). A.2.2. Methodology1. Cells (1x106 /mL) are incubated with BrdU 10 m M atfinal concentration, for 30 min at 37 °C in controlled atmosphere.2.Wash twice at 500 g for 1 min using the washing buffer.3. Resuspend in 0.5 mL of washing buffer and 0.5 mL of HCl 4 M.4. Mix accurately and incubate for 30 min at room temperature.5. Wash once as in step 2.6. Resuspend in 1 mL of Borax buffer.7. As in step 5.8. Resuspend in 200 m L of washing buffer and label with 5 m L of mAb ant-BrdU.9. Incubate for 1 hour at 4 °C in the dark.10. As in step 5.11. Resuspend in 200 m L of washing buffer and label with 4 m L of goat-anti-mouse FITC-conjugated antibody.12. Incubate for 30 min at 4 °C in the dark.13. As in step 5.14. Resuspend in 200 m L of washing buffer and 200 m L of PI buffer.15. Incubate for 15-30 min at 4 °C in the dark.16. Analyse with flow cytometer equipped with a 488 nmargon laser.A.3. COMMENTARYA.3.1 Background informationIn this procedure fixed cells by 4% PFA in Phosphate Buffer Saline (PBS) can be utilized. In this case to wash cells once in PBS before to start at step 1 is necessary.Moreover, both direct and indirect immunofluorescence can be used. The BrdU incorporation is more evident using the indirect method.A.3.2 Anticipated resultsIt is recommanded to perform each experiment using a negative and a positive control sample. The negative sample, in order to have a correct setting of instrument, is assessed following all the steps except step 8. The positive sample, in order to make sure that the method works, is assessed by using a proliferating cell line (such as U937, K562, MOLT4, etc.) following all steps. A.3.3 Time considerationsThe protocol is simply but it require a quite long time. Indeed, for few samples, more or less 4 hours are required. The duration of the method is obviously depending on the number of samples. A.3.4 Key references1. Dolbeare, F., Gratzner, H:, Pallavicini, M., Gray, J.W.1983. Proc. Natl. Accad. Sci. U.S.A .80: 5573.。

EdU法细胞增殖检测——Brdu方法的革命性突破细胞增殖的研究方法有很多，主要包括：BrdU，EdU，CCK8等方法。

其中EdU检测方法是zui新的细胞增殖检测方法。

一、什么是细胞增殖呢？细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。

单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。

多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老或死亡的细胞。

二、细胞增殖的意义和方式意义：细胞增殖是生活细胞的重要生理功能之一，是生物体的重要生命特征。

细胞的增殖是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础。

方式：真核生物的分裂依据过程不同有三种方式，有有丝分裂，无丝分裂，减数分裂。

其中有丝分裂是人、动物、植物、真菌等一切真核生物中的一种zui为普遍的分裂方式，是真核细胞增殖的主要方式。

减数分裂是生殖细胞形成时的一种特殊的有丝分裂。

三、关于EdU检测方法EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替T渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo®荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。

与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。

EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。

细胞增殖伴随着多细胞生物生命体运作的一生，越来越多的研究者们已经把目光集中到了细胞增殖检测，关于细胞增殖检测的方法也在不断更新。

那么到目前为止，研究细胞增殖有哪些手段呢？EdU法检测试剂盒是Brdu方法的革命性突破。

EdU（5-溴-2-脱氧尿嘧啶）试剂盒是一种嘧啶类似物，可以在DNA合成期整合入DNA双链。

通过以上原理图的对比，大家不难发现，EdU法检测细胞增殖，无须抗体，无变性步骤，保持细胞形态和DNA完整性，是一种简单，可靠，省事的创新方法。

BrdU细胞增殖检测试剂盒原理用途介绍BrdU 作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物（其化学结构特点是胸腺嘧啶的碱基嘧啶环上与5位C 原子连接的甲基被溴代替），像胸腺嘧啶核苷一样可掺入到细胞合成的DNA 中。

当细胞处于DNA 合成期（S 期）而同时又有BrdU 存在时, 就会有BrdU 掺入新合成的DNA 中，只要细胞不消亡，这种BrdU 就在胞核的DNA 中长期存留。

BrdU细胞增殖检测试剂盒基本参数：中文名称：CytoSelect BrdU细胞增殖分析ELISA试剂盒英文名字：CytoSelect BrdU Cell Proliferation ELISA Kit编号：CBA-251规格：96assays保存条件：将1000X BrdU溶液和抗BrdU单克隆抗体储存在-20ºC。

将所有其他部件储存在4ºC。

BrdU细胞增殖检测试剂盒检测原理：当将细胞在含有BrdU的培养基中孵育时，嘧啶类似物代替胸苷掺入新合成的增殖细胞DNA中。

除去标记介质后，将细胞固定，并用固定/变性溶液一步一步将DNA变性（DNA变性对于改善掺入的BrdU 的可及性是必需的，以进行检测）。

然后加入抗BrdU小鼠单克隆抗体，然后加入HRP偶联的二抗以检测掺入的BrdU。

显色颜色的吸光度与掺入细胞中的BrdU数量成正比，并且可以与细胞增殖直接相关。

BrdU细胞增殖检测试剂盒优点：1、灵敏度高、没有放射性污染，2、可以检测的最低检测限度为50-100 个细胞，并且只检测新增殖细胞。

主要用途：1、细胞因子、生长因子、分裂素和营养因子刺激后，监测和定量细胞增殖；2、分析药物的细胞毒性个，如抗癌药物等；3、分析不同成分对细胞增殖的抑制或者刺激作用。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610646905.5(22)申请日 2016.08.09(71)申请人 杨琴地址 400015 重庆市渝中区袁家岗友谊路1号申请人 余萍萍(72)发明人 杨琴　余萍萍　(51)Int.Cl.G01N 33/533(2006.01)G01N 33/532(2006.01)G01N 33/53(2006.01)G01N 1/30(2006.01)(54)发明名称BrdU标记免疫荧光检测细胞增殖的改良方法(57)摘要本发明公开了一种免疫荧光检测BrdU标记增殖细胞的改良方法。

将变性温度固定在4℃，复性统一采用0.01M Tris-HCL处理，之后进行单标、双标及三标染色，并与常规方法进行比较。

结果显示本发明方法具有非常好的染色效果，成功率高，重复性好，操作简单且节约实验时间。

权利要求书1页 说明书4页 附图1页CN 107703292 A 2018.02.16C N 107703292A1.BrdU标记免疫荧光检测细胞增殖的改良方法，其特征在于：将变性温度固定为4℃，复性统一采用0.01M Tris-HCL，进行单标、双标及三标染色。

2.根据权利要求1所述的染色方法的特征，其具体步骤如下：a、破膜：取组织切片室温下晾15分钟，然后加0.4％triton室温下反应20分钟。

b、修复：经过步骤a处理后的组织切片PBS洗5分钟/3次，用0.01mmlol/L枸橼酸盐进行微波热修复，大火5分钟，小火20分钟，待自然冷却约1h。

c、变性：经过步骤b处理后的组织切片PBS洗5分钟/3次，加2M HCL于4℃下作用30分钟。

d、复性：经过步骤c处理后的组织切片PBS洗5分钟/3次，加0.01M Tris-HCL室温下反应10分钟。

e、封闭：经过步骤d处理后的组织切片PBS洗5分钟/3次，山羊血清封闭2小时。

细胞生物学中的细胞循环和细胞增殖检测技术细胞生物学是研究细胞结构、功能和生命活动的学科。

细胞循环和细胞增殖是细胞生物学中的两个重要概念。

本文将介绍细胞循环和细胞增殖的基本概念以及常用的细胞增殖检测技术。

一、细胞循环细胞循环是指细胞从一个分裂到下一个分裂的过程。

细胞循环包括两个主要阶段：有丝分裂期和间期。

有丝分裂期是指细胞核分裂的过程，包括前期、中期、后期和末期四个阶段。

间期是指有丝分裂期之间的时间，包括G1期、S期和G2期三个阶段。

细胞循环的调控是非常复杂的，包括多种信号通路和调节因子的参与。

其中，细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）和其调节因子是细胞循环调控的核心。

CDK的活性受到其结合的调节亚基的影响，而调节亚基的表达和降解受到多种信号通路的调控。

二、细胞增殖细胞增殖是指细胞数量的增加。

细胞增殖是细胞生物学中的一个重要过程，包括细胞分裂和细胞生长两个方面。

细胞增殖的调控与细胞循环密切相关，其中CDK和其调节因子也是细胞增殖调控的核心。

细胞增殖异常与多种疾病的发生和发展密切相关，如肿瘤、心血管疾病等。

因此，细胞增殖的检测对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。

三、细胞增殖检测技术1. MTT法MTT法是一种常用的细胞增殖检测技术。

MTT是一种黄色的化合物，可以被细胞内的还原酶还原成紫色的产物。

MTT法通过测定细胞内还原酶的活性来反映细胞增殖情况。

2. CCK-8法CCK-8法是一种新型的细胞增殖检测技术。

CCK-8是一种水溶性的化合物，可以被细胞内的还原酶还原成橙色的产物。

CCK-8法通过测定细胞内还原酶的活性来反映细胞增殖情况。

3. BrdU法BrdU法是一种常用的细胞增殖检测技术。

BrdU是一种类似于胸腺嘧啶的化合物，可以被细胞内的DNA合成酶嵌入到DNA分子中。

BrdU法通过测定细胞内BrdU的含量来反映细胞增殖情况。

四、结论细胞循环和细胞增殖是细胞生物学中的两个重要概念。

细胞循环包括有丝分裂期和间期两个阶段，调控非常复杂。

检测细胞增殖能力的方法细胞增殖能力是生物学和医学研究中极为重要的指标，它反映了细胞的生长、繁殖和生命活力。

本文将详细介绍几种常用的检测细胞增殖能力的方法，以供研究者参考。

一、MTT法MTT法（甲基噻唑基四唑法）是一种经典的检测细胞增殖的方法。

其原理是利用活细胞内的琥珀酸脱氢酶将MTT还原为蓝紫色的甲臜，甲臜的量与活细胞数成正比。

具体步骤如下：1.将细胞接种于96孔板中；2.加入MTT溶液，培养一定时间；3.弃去上清，加入DMSO溶解甲臜；4.使用酶标仪测定吸光度，判断细胞增殖能力。

二、CCK-8法CCK-8法（细胞计数试剂盒-8）与MTT法类似，但操作更简便，毒性更低。

CCK-8试剂在细胞内被还原后生成橙色的甲臜，通过测定吸光度可以评估细胞增殖能力。

三、EdU法EdU法（5-乙炯基-2"-脱氧尿嘧啶法）是一种新兴的细胞增殖检测方法。

EdU是胸腺嘧啶类似物，可以代替胸腺嘧啶插入到DNA中。

通过荧光显微镜或流式细胞仪检测EdU标记的DNA，可以评估细胞增殖情况。

四、Brdu法Brdu法（5-溴脱氧尿嘧啶法）与EdU法类似，也是一种检测细胞增殖的经典方法。

Brdu在细胞周期中代替胸腺嘧啶插入DNA，通过免疫荧光或免疫组化方法检测Brdu标记的DNA，从而评估细胞增殖能力。

五、细胞计数法细胞计数法是最直接的检测细胞增殖能力的方法。

通过细胞计数板或流式细胞仪对细胞进行计数，可以直接得到细胞数量，从而判断细胞增殖能力。

六、其他方法除了以上几种方法外，还有其他检测细胞增殖能力的方法，如：1.克隆形成实验：通过测定细胞克隆的形成数量来评估细胞增殖能力；2.细胞周期分析：利用流式细胞仪检测细胞周期各阶段的细胞比例，间接反映细胞增殖能力；3.报告基因法：通过构建带有报告基因的细胞株，检测报告基因的表达水平来评估细胞增殖能力。

综上所述，检测细胞增殖能力的方法多种多样，研究者可以根据实验需求和条件选择合适的方法。

细胞增殖检测技术
--BrdU法
一、基本原理
BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）法检测细胞增殖原理：BrdU是胸腺嘧啶的衍生物，常用于标记活细胞中新合成的DNA，可代替胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞中新合成的DNA中（细胞周期S期）。

这种掺入可以稳定存在，随着DNA复制进入子细胞中。

BrdU 特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力。

二、操作步骤
（1）细胞以1.5×105 /ml细胞数接种于直径35 mm培养皿中（内放置一盖玻片），培养1 d，用含0.4％FBS培养液同步化3 d，使绝大多数细胞处于G0期。

（2）加入BrdU（储液：1.0 mg/ml,终浓度为0.03 μg/ml），37℃，孵育40min。

（3）弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。

（4）甲醇/醋酸固定10 min。

（5）经固定的玻片空气干燥，0.3％H2O2-甲醇30 min灭活内源性氧化酶。

（6）5％正常兔血清封闭。

（7）甲酰胺100℃，5 min变性核酸。

（8）冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1：50），阴性对照加PBS或血清。

（9）按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数（LI）。

三、注意事项
1.BrdU配制方法：10 mg溶于10 ml双蒸水，4℃下避光保存
2.BrdU会肌体造成不可逆损伤，使用时注意安全，避免吸入BrdU 粉尘。

细胞增殖实验(Brdu法)1.将盖玻片放入到24孔板中，将长满的大盘细胞用胰酶消化后，按1-2万个细胞/孔加入到24孔板中。

2.待细胞长至50%-60%的密度后，更换培养液，导入相应质粒，4-6小时后更换培养液。

3.培养24h后，于每孔板加入10µm的Brdu，继续培养4h。

4. 4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

5. 0.2％Triton X－100通透10分钟，PBS洗三遍。

6. 按1:1000稀释Brdu抗体，于每孔中加300µl，4度过夜后，PBS洗三遍。

7.0.5ug/ml DAPI染核，然后直接照荧光片。

8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周。

4%20min甲醇+30%丙酮）PBS3×5min穿孔15min()PBS×5min加入5%BSA Brdu，于4℃杂交过夜PBS×5min染色2min1.将盖玻片放入到24孔板中，将长满的大盘细胞用胰酶消化后，按1-2万个细胞/孔加入到24孔板中。

2.待细胞长至50%-60%的密度后，取出细胞爬片，3. 4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗两遍。

4. 2N HCL in PBS(1:5 用PBS稀释盐酸) 室温10分钟5. neutralize by incubating the samples in borate buffer (0.1 M) for 10 min at room temperature.硼酸中和，PBS 3次4. Blocking buffer (5% BSA, PBS, Tween-20 0.2%)。

Goat serum 10%5. Blocking buffer封闭（5%BSA）1 小时6. BrdU(rat)/Cdk5(rabbit) 一抗4度过夜，PBS洗三遍。

7.二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。

（一抗，二抗稀释到blocking buffer）Dip the cover silp into DD-H20, and air-dry in filter-paper.8. Anti-fade with DAPI,put the coversilp up-side down,然后直接照荧光片。

流式细胞仪检测细胞增殖方法有哪些？在生物学和医学研究中，细胞增殖是一个关键过程，对于理解生命活动的基本规律以及疾病的发病机理具有重要意义。

随着科技的发展，流式细胞仪作为一种高效、灵敏的分析工具，广泛应用于细胞增殖的检测。

流式细胞仪通过快速分析单个细胞，可以对细胞周期、细胞增殖活性、细胞凋亡等多个方面进行研究。

本文将探讨流式细胞仪在检测细胞增殖方面的主要方法，包括但不限于溴脱氧尿苷（BrdU）掺入法、细胞周期蛋白检测法以及细胞大小分析法等，为读者提供全面的技术应用概览。

流式细胞仪检测细胞增殖方法：1、3H（氚离子）掺入法原理：是在细胞DNA合成时，用3H脱氧胸腺嘧啶核苷代替普通的脱氧胸腺嘧啶核苷掺入新合成的DNA中，增殖的细胞因为掺入3H而具有放射性，通过定量检测样品细胞的放射性大小而反映细胞的增值活性缺点：1）使用的是具有放射性的同位素，操作较为复杂，同时需要采取放射性保护措施2）低比例高活跃增殖和高比例低活跃增殖可能得到的是相同的结果，用此方法无法进行鉴别3）此方法无法进一步得到具有活性的增值细胞用于下一步的研究4）此方法时间较短，无法检测加入前细胞的增殖情况，而且检测到放射性只能说明细胞DNA合成，而不能提供合成DNA的细胞是否进入增殖阶段的信息2、相对计数法原理：将对照组和各实验组控制在相同条件下直接计数然后比较计数结果得到增殖结论注意点：对照组与实验组每种细胞所加浓度必须相同，每组至少设置3个复孔，这样每个孔可以得到1个细胞数，将3个复孔取平均值后就是这个组的结果。

如果同时需要得到每孔目标细胞增殖后的绝对参数，在每孔细胞中加入1*105PE标记的人工微球作为内参收集各组的细胞于EP管中，注意必须尽量将各组的所有细胞都收集起来。

标记需要计数细胞的标志表型的荧光素偶联抗体，4℃静置30minPBS洗涤一次，洗去游离的抗体3、示踪染料标记法示踪染料与细胞结合的方式：1）能够与细胞内的蛋白质上的氨基发生非特异性的共价结合2）能够非特异性地嵌入细胞膜的脂质双分子层中与细胞发生非共价性结合原理：示踪染料的荧光信号都很强，当细胞分裂时，母细胞内的染料会被平均分配到子细胞中，细胞荧光信号会被减弱一半，所以通过检测减弱的、发射示踪染料荧光信号的细胞比例就可以判断细胞增殖的强弱。

细胞增殖试验方法细胞增殖试验就像是窥探细胞世界里的“人口增长”秘密呢。

一、直接计数法。

这是最直白的一种啦。

就像数星星一样，不过是在显微镜下数细胞。

把细胞放在特制的计数板上，然后瞪大眼睛，一个一个数。

这个方法简单直接，但是也有点费眼睛哦。

而且呢，它只能反映某个特定时间点的细胞数量。

要是细胞们正处于活跃的增殖状态，可能刚数完，下一秒就又变多啦。

二、MTT法。

MTT法就像是给细胞们做一个小测验。

MTT这种物质可以被活细胞里面的一些酶变成有颜色的东西。

把细胞放在有MTT的培养液里，活细胞就会让MTT发生变化，然后我们通过测量颜色的深浅来判断细胞增殖的情况。

颜色越深，就说明活细胞越多，也就意味着细胞增殖得越好。

不过呢，这个方法也有小缺点，MTT本身有点毒性，可能会对细胞有点小影响，就像给细胞一点小压力啦。

三、CCK - 8法。

这个方法和MTT法有点像亲戚呢。

CCK - 8也是一种可以被细胞里面的东西改变颜色的试剂。

它比MTT法更友好一点，毒性更小。

细胞在增殖的时候，会让CCK - 8变色，然后我们用仪器测量颜色变化对应的数值，就知道细胞增殖得怎么样啦。

操作起来也不是很难，就像做一个简单的小实验，看着颜色一点点变化，就像看着细胞在悄悄长大呢。

四、BrdU掺入法。

这个方法就有点像给细胞做个小标记。

BrdU是一种可以像细胞自己的原料一样被细胞吸收的东西。

正在增殖的细胞会把BrdU掺入到新合成的DNA里面。

然后我们可以用特殊的方法检测到BrdU的存在，这样就知道哪些细胞在增殖啦。

就像是给增殖的细胞发了一个独特的小徽章，然后我们把戴徽章的细胞找出来数一数。

细胞增殖、凋亡-检测方法汇总1.直接计数法面单粗暴、傻瓜式的检查方法！利用计数板或计数仪得出细该数目•然后对数目逬行比较。

方法需要对不同时间原的细胞分别固定•而后在光疑下计数,可绘制出细胞生长曲线。

而具不足之处在于无法区分壇蓿细胞与非增殖抵胞，下适合样品奴星參和评估特定亚群的情况。

2「H・TdR渗入法OH腺龜碇核百(TdR )是DNA持有的滅基「也是DNA合成的必需物氐用同位素中标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体渗入DNA合成代谢过程,通过液体闪烁计数器可迴走细胞的放射性强虐，间接放映出细胞增殖情况。

该方法优点在于敏感性高”客观性强,盍每性好.但是爲要一走设备集件，也存在放时性核素污染问题。

3、Brdu/EdU检测法Brdu&EdU均是胸腺嚅睫的衍生物r均可代替胸腺嚅噪在DNA合成期掺入细胞中。

不同的是J Brdu检测法可利用B「du专性抗体和具他細胞标记物对细'进行双重染色,可判断増殖细胞的种类及増殖速度，不仅适用于体外实验也能用于活体实验。

这个方法最大的缺点需要变性DNA才能与抗体结合,破坏了DNA双链结构r导致染色弥散、准确性降低等问题。

EdU检测法则基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性r适用于细胞増殖、细胞标记示踪筈方IEI的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。

EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500,®田胞内很容易就扩散,无需DNA变性。

rdU与EdU检测优缺点综合比较BrdU EdU 检测分子大很小检测方式免疫反应化学反应影响其他标记是否DNA变性需要不需要实验时间过夜 2.5小时检测灵敏度一般灵敏4、WITT检测法&CCK8检测法MTT检测法反映细胞的能臺代谢「是检测细胞増殖活力的一种简便准确方法°其原理是在活纟田胞生长和增殖过程中,线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT分解为蓝紫色的水不溶性的甲瓒(Formazan ),并沉积在细胞中(死细胞无此功能。

BrdU免疫组化检测细胞增殖一实验目的用5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-deoxyuridine,BrdU）免疫组化检测小鼠肝肾细胞增殖情况，评估碘乙酸（Iodoacetic Acid, IAA）的致癌作用。

二实验原理BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷的类似物，能选择性的渗入到处于细胞周期S期细胞的单链DNA核苷酸序列中。

在活体引用合成DNA的可示踪的前体物质BrdU，是增殖期细胞可竞争性的代替胸腺嘧啶而掺入，且掺入合成的强度可直接显示细胞增殖的能力，再取其相应组织制作切片，应用于BrdU特异反应的单克隆抗体，对已完成了BrdU标记的正常或病理状态下细胞的DNA复制进行免疫组织化学检查。

三实验材料二甲苯、乙醇、蒸馏水、PBS缓冲液、苏木精、荧光显微镜、试管、水浴箱、离心机、致癌实验灌胃结束的小鼠。

四操作步骤处死前5天，用渗透迷你泵（osmotic minipumps）给小鼠15mg/ml的BrdU，共0.2ml。

处死小鼠后取出组织（肝组织或肾组织），切成0.5cm厚的长条，置于10%的福尔马林磷酸缓冲液中24小时，然后石蜡包埋并切成5μm厚的薄片。

（1）将制作的5μm厚的石蜡切片于60℃烘箱中烤片24 h。

（2）二甲苯（Ⅰ、Ⅱ）各10 min。

（3）梯度乙醇水化各5 min，100%、95%、85%、75%乙醇。

（4）流水冲洗5 min。

（5）3%H2O2室温避光孵育20 min，阻断内源性过氧化物酶的活性。

（6）PBS浸泡5 min，3次，在低速摇床上振摇水洗。

（7）加入0.1%胰酶抗原修复20min.（8）PBS洗2-3次，各5 min。

（9）山羊血清室温下封闭20min。

（10）封闭后倒去血清，勿洗，滴加按说明书稀释的免疫染色一抗稀释液，4℃过夜或者37℃两小时。

（11）PBS冲洗，5 min×3次。

（12）滴加1：100稀释的免疫荧光染色二抗稀释液，37℃孵育30 -60min，PBS冲洗，5 min ×3次。

EdU 与BrdU 在检测细胞增殖中的特点及应用进展
罗涛(综述);王彤敏;李力燕(审校)
【期刊名称】《重庆医学》
【年(卷),期】2015(44)32
【摘要】细胞增殖是细胞在周期调控因子的作用下,通过DNA复制、RNA转录和蛋白质合成等一系列复杂反应而进行的分裂过程,是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础[1]。

细胞增殖检测广泛应用于分子生物学、免疫学、肿瘤生物学、药理学等研究领域,是评价细胞代谢、生理和病理状况的重要方法[2]。

目前,常用的方法包括胸腺嘧啶核苷渗入法、MTT检测法、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法等。

【总页数】3页(P4581-4583)
【作者】罗涛(综述);王彤敏;李力燕(审校)
【作者单位】昆明医科大学神经科学研究所，昆明650500;昆明医科大学神经科学研究所，昆明650500;昆明医科大学神经科学研究所，昆明650500
【正文语种】中文
【中图分类】R-1
【相关文献】
1.盐酸抗原修复Brdu免疫组化检测在脑组织中的应用∗ [J], 王坦;郑婉君;高剑峰
2.人肝癌细胞培养中CCK-8法与BrdU-ELISA法检测细胞增殖的比较 [J], 张大伟;邢雪;邓乃梅;谭雪莹;汤海涛
3.BrdU标记检测慢性吗啡对C6胶质瘤细胞增殖的影响 [J], 刘剑凯;洪敏;张家颖;周航
4.小鼠局部淋巴结实验(BrdU-ELISA)在25％氰氟草酯乳油皮肤致敏性检测中的应用 [J], 秦珩;王玉邦;环飞;程洁;靳苏香;钱雯;章婉;严婷;董昊;张成香;张璐璐
5.MTT法与BrdU ELISA法检测成纤维细胞增殖的可靠性比较 [J], 刘苹;李平;熊仁平;周元国
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Bｒdu检测细胞增殖实验实验操作:1．铺细胞,每个3。

5cm diｓh 10万个,在3７℃、5％ＣO2孵箱中培养７2h(细胞密度至5０－６0%左右)。

2．Ｂrdu(5－溴—2′－脱氧尿苷)加入培养细胞中,1mｇ/ml,标记48h。

(量:Brdu以铺满整个diｓｈ底面为准。

)3．固定:PＢS洗细胞爬片3次,每次5ｍin,在摇床上晃动清洗,4%ＰＦA固定30miｎ。

4．变性:将固定好得细胞爬片用PBS洗3次,每次５mｉn,2ｍol/L得HＣl在３7℃条件下变性5min,可放置于37℃恒温孵箱,应用封口膜把培养皿封好。

(12０r／ｍ)5．中与:0。

1moｌ／L得硼酸钠(PH8.3)中与10miｎ,PBS洗3次,每次5ｍｉn、(5０r／ｍ) 6．加入1ml得0、２%TritoｎX-1０0,10ｍin。

7．吸出ＴｒｉtｏnX-1００,用PBS洗3次,每次5min。

8．加入1ｍl 3％得BSＡ封闭,室温1h,可在摇床上晃动、9．吸出BSA,用PＢＳ洗3次,每次5mｉn。

10.加一抗(尿嘧啶脱氧核苷Brdu(鼠单抗)1:200),用1％BSA稀释,4度过夜。

11.将孵好一抗得细胞爬片用PBS洗3次,每次１0min。

1２.加二抗(羊抗鼠IgG/Ａleｘa Ｆluor 594 1:１00),用1%BSA稀释,避光室温孵育1ｈ。

(６０r/min)１3.将孵好二抗得细胞爬片用PBS洗３次,每次1０mｉn。

14.加ＤAPI染细胞核,储存浓度为1mg/ml,应将DＡＰＩ完全混匀,可用手弹几下,一般稀释比例为1:1００0(用PBＳ稀释),避光室温反应1０ｍiｎ。

1５。

将DＡＰI染好得细胞爬片用PBS洗3次,每次１０min。

16.中性树胶封片,荧光显微镜观察,20０×镜下取5个视野,计数Brdu阳性细胞与蓝染得细胞核数目,然后进行统计分析。

试剂配制:ａ、Brｄｕ得溶解:室温下,将250ｍg粉末溶于２。

5ml得DＭＳO中,储存浓度为100mg／ml分装,每管1２0ul,—２0℃保存。