细胞的原代培养和传代培养

原代培养:即第一次培养，是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。

有几方面含义：●培养物一经接种到培养器皿（瓶）中就不在分割，任其生长繁殖；●原代培养中的“代”并非细胞的“代”数，因为培养过程中细胞经多次分裂已经产生多代子细胞；●原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液，也不等于不更换培养器皿。

正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。

所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。

目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。

此细胞系一直延用至今。

原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。

但是有极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去，这些存活的细胞一般能够传到40～50代，这种传代细胞叫做细胞株。

细胞株的遗传物质没有发生改变,在培养过程中其特征始终保持。

当细胞株传至50代以后又会出现“危机”，不能再传下去。

但是有部分细胞的遗传物质发生了改变，并且带有癌变的特点，有可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为细胞系。

原代培养是建立各种细胞系（株）必经的阶段，其是否成功与组织污染与否、供体年龄、培养技术和方法、适宜培养基的选择等多种因素有关。

由于原代培养的细胞转化性极小，对病毒敏感性好，因此适应制备疫苗等生物制品；但也存在有潜在外源因子、不能事先检查标本、且受供体年龄健康状况的影响而导致批间差异大等缺陷。

目前常用的原代细胞培养有鸡胚成纤维细胞及猪肾、猴肾、地鼠肾等原代细胞。

原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养条件下培养等步骤，在所有的操作过程中，都必须保持培养物及生长环境的无菌。

多数情况下，分散的细胞若属于贴壁依赖型细胞，就能黏附、铺展于培养器皿和载体表面生长而形成细胞单层，这种培养方式称为单层细胞培养（monolayer culture），又叫贴壁培养（adherent culture）。

细胞传代培养和原代培养一：原代细胞培养(一)原理：细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。

近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。

由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。

原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。

一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。

(二)操作：1．取材：用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。

然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。

用消过毒的剪刀剪开用和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。

置于无菌平皿中。

2．切割：用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。

移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

3．消化、接种培养：吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。

(三)结果:细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。

二：传代细胞培养(一)原理：体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。

培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。

传代培养和原代培养的概念辨析1．原代培养和传代培养的概念从机体上获取的组织，通过酶或机械方法分散成单个细胞进行培养，在首次传代前的培养一般称为原代培养。

原代培养的最大优点是：组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。

原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养，也就是将细胞按1：2~1：4的比例传代。

但严格说来，不论在进行传代时稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养。

传代代数与细胞的世代（增殖代数）并不是同一个概念。

在细胞培养时，所说的“第10代细胞”，仅指该细胞已经传代10次；细胞传一代后，一般能倍增3~6次，经过三个阶段，即潜伏期、指数生长期和平台期。

当细胞达到平台期时，就需要进行传代培养，否则细胞会中毒，发生形态改变，甚至死亡。

2．关于传代培养在进行传代时，如果是悬浮细胞，只需简单稀释即可，若需完全更换培养液只需低速离心沉淀，再悬浮于合适的培养液中即可。

一般细胞每毫升接种数量为5?104~8?105个，传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。

在培养过程中，培养液会由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。

如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代，多数细胞需用胰蛋白酶处理将细胞从生长物表面分离下来，以促进传代培养。

3．细胞系和细胞株细胞系和细胞株，两者曾一度混用，导致有些文献中概念不清。

下面所指的概念是现在国内外比较通用的，也是绝大多数研究者接受的观点。

原代培养物经首次传代成功即称为细胞系（Cell Line），因此细胞系可泛指一般可能传代的细胞。

其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的称为有限细胞系。

大多数二倍体细胞为有限细胞系。

通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株（Cell Strain），也就是说，细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。

原代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒原代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。

开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。

加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。

消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。

低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。

对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。

原代组织块培养法1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。

细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏细胞培养是指将生物体内分离出的细胞种植在培养基中，供其生长和繁殖的实验过程。

细胞培养已成为生命科学和医学研究中不可或缺的基础工具。

在细胞培养中，常见的术语有原代培养、传代培养、冻存和复苏。

原代培养原代培养是将从组织中分离出的细胞直接进行培养，即首次培养。

通常将组织切割成小段或分散成单细胞悬液，加入培养基中，使其中的细胞粘附在培养基表面上生长。

原代培养中所得细胞经常受到组织来源、细胞类型和培养条件等因素的影响，因此可能表现出较高的细胞异质性。

传代培养传代培养是将进行了原代培养的细胞进行维持和扩增的过程。

在细胞生长到足够数量时，将细胞分散到更大容量的培养器中，以继续扩增细胞数量。

传代培养次数过多时可能导致细胞老化并失去功能。

在细胞传代培养过程中，注意以下几点：•选择合适的培养基和培养条件；•周期性检测细胞的形态、生长状态和细胞数目；•保持细胞复合度和细胞同型性。

冻存为了保存细胞株，通常会将细胞用特殊培养基和添加剂冻存。

冻存过程中，细胞首先保护在保护剂中，然后在液氮的温度下迅速冷冻，以避免细胞深受冰晶形成的伤害。

冻存后的细胞可保存数年，并可进行后续的实验研究。

## 复苏冻存后，需要将细胞复苏。

推荐以下步骤：•用生长培养基预热，将细胞移植到生长培养基中，尽量使样品在细胞数目、时间和温度上保持一致；•在细胞培养箱中培养，控制CO2浓度（通常为5％）和口袋气体混合在空气中的湿度；•更换完整的生长培养基，加入所需的辅助剂，如血清或其它所需的生长因子。

如上所述，细胞培养是生物学和医学研究中不可或缺的基础工具。

正确地进行细胞培养和细胞处理很重要，因为不同的操作条件将影响最终培养出的细胞的数量和质量。

在实验中进行细胞培养和处理时，应该遵守正式的安全和操作规程。

细胞培养技术的实验原理是
细胞培养技术的实验原理是通过提供适宜的培养基、温度、湿度和气氛等条件，将细胞从体内或体外分离出来，然后在无菌环境下培养和繁殖。

细胞培养可以分为原代培养和细胞系培养两种。

原代培养是从体内获取原发细胞，并将其传代培养。

首先，需要从组织或器官中获得细胞，通常通过消化和分散组织，使用酶来降解细胞间的黏连物质，并加入一种细胞培养基，提供细胞所需的氨基酸、维生素、糖类、盐类等营养物质。

培养基中的血清可以提供生长因子、激素等促进细胞生长的成分。

随着时间的推移，细胞会逐渐分裂和繁殖，形成细胞群体。

细胞系培养是从原代细胞中筛选出生长良好的细胞，然后进行传代培养。

传代培养时，细胞需要周期性地移至新的培养器皿中，并提供新的培养基。

细胞系培养的培养基中通常会去除血清，换成类似血清的添加物，例如人血清蛋白或胎牛血清蛋白，以减少细胞培养中传递的疾病风险。

细胞培养的实验原理是为了研究细胞的生物学特性、生长过程、分化、代谢、免疫特征等。

通过细胞培养，可以更好地理解细胞的功能和基本机制，以及开发新的药物和治疗方法。

此外，细胞培养也可用作细胞工程和组织工程的基础，用于器官和组织的再生和修复。

动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法1. 引言嘿，大家好！今天咱们聊聊动物细胞的培养，听起来可能有点高大上，但其实就像种花一样，只是“花”是细胞，养护的方法也有讲究。

说白了，细胞也有自己的“家”，咱们得给它们创造个舒适的环境，让它们在里面嗨起来！接下来，我就带你走进这个充满神奇和乐趣的细胞世界。

2. 原代培养2.1 什么是原代培养？原代培养，简单来说，就是从活体动物身上直接提取细胞，然后把它们放在培养皿里，就像把新鲜的花插进水里一样。

你知道吗，这些细胞就像刚从大自然里来的小家伙，特别活泼，适应能力强。

不过，这可不是随便就能搞定的，得有点技术活。

2.2 原代培养的方法首先，咱得准备好一切工具，这可是基础中的基础，不能马虎。

咱们要用到无菌技术，确保培养环境干净得像新洗的碗，不然细胞们就会遭殃。

提取细胞时，通常会用胰酶把它们从组织中“松开”，就像剥开一个大榴莲，里边的果肉才好吃嘛。

然后，把这些细胞放到培养基里。

培养基就像细胞的“快餐”，里面有细胞需要的各种营养物质和生长因子。

要记得，细胞也要“吃好”，才能长得壮壮的，不然就不成气候了。

培养的环境也不能小看，温度、pH值、二氧化碳浓度都得保持稳定。

咱们得把细胞放在适合的温度下，就像给它们开个温暖的“家庭聚会”。

如果环境不合适，细胞就会抗议，甚至罢工！3. 传代培养3.1 什么是传代培养？说到传代培养，那就是把原代培养中的细胞继续繁殖，让它们“生儿育女”。

这就像一个大家庭，越来越壮大，热闹得不得了。

传代培养可以让我们获得更多细胞，方便后续的实验和研究。

3.2 传代培养的方法传代培养的关键在于及时分离细胞，咱不能让细胞们挤在一起，这样容易“打架”。

通常，当细胞长满培养皿后，就需要把它们分离开。

这个过程又得用到胰酶，跟原代培养一样，轻轻松松把它们从皿里“请”出来。

接下来，咱们需要把细胞分到新的培养皿里，再给它们加上新鲜的培养基，确保它们能继续健康成长。

注意，细胞们需要一点时间适应新环境，就像搬家后要习惯新居的味道一样。

原代和传代细胞的培养和维持一、原代细胞的培养与维持1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度为10%～80%．在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。

贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。

其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。

2、悬浮细胞的培养凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞．若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失），待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。

悬浮细胞在未达到饱和密度时，但培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求时，只能采用半量换液的方式．二、原代细胞培养的首次传代 (Subculture)这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。

每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5～10代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代细胞系）。

传代细胞系的建立，关键是初代培养的首次传代。

应注意如下几点：(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急于传代。

(2)原代培养的贴壁细胞多为混杂细胞，形态各异，往往是上皮样细胞和成纤维样细胞并存，采用胰蛋白酶消化时要掌握好消化时间，因成纤维细胞易于脱壁，上皮细胞不易脱壁，因此，可根据需要选用适当的消化时间及时中止消化。

细胞的原代培养与传代培养原代培养通过组织块直接长出单层细胞或用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。

原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。

特别是在细胞培养会合时，原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈。

在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。

在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，采用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化等，效果很好。

但应注意，原代培养组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。

即使全为同一类型的细胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍具有异质性，在分析细胞生物学特性时比较困难。

其次，由于供体的个体差异及其他一些原因，细胞群生长效果有时也不一致。

原代培养也是建立各种细胞系（株）必经的阶段。

假如原代培养能够维持几小时甚至更长，即可进行进一步筛选。

有的细胞具有继续增殖能力，有的细胞类型只是存活而不增殖，而另外一些细胞只是在特殊条件下应用而不存活，因而细胞类型的分布将会改变。

在单层培养的情况下，瓶底全部铺满细胞，达到会合以后，对密度有依赖性的细胞则逐渐减少生长，而失去密度依赖敏感性的细胞则生长增加，天然或自发转化的细胞则过度生长。

借助于频繁传代，保持细胞低密度生长，有利于保存细胞的正常表型（如小鼠成纤维细胞）。

而自发转化则倾向于高细胞密度的过度生长。

细胞密度过大，培养基消耗将尽，细胞代谢产物积聚过度，细胞增殖变慢，应进行传代培养。

传代培养原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。

原代培养在首次传代时即为细胞系，能连续培养下去的为连续细胞系；不能连续培养的为有限细胞系。

通常，传代培养是指扩大培养，也就是将一份细胞一分为二或者一分为三进行培养等。

但严格说来，不论稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。