HPLC-MS-2

高效液相色谱质谱联用-HPLC-MS-实验-含思考题液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的各种模式探索一、实验目的1、了解LC-MS的主要构造和基本原理；2、学习LC-MS的基本操作方法；3、掌握LC-MS的六种操作模式的特点及应用。

二、实验原理1、液质基本原理及模式介绍液相色谱-质谱法（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry，LC-MS）将应用范围极广的分离方法——液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。

但是，LC是液相分离技术，而MS是在真空条件下工作的方法，因而难以相互匹配。

LC-MS经过了约30年的发展，直至采用了大气压离子化技术（Atmospheric pressure ionization，API）之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。

现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中，LC-MS 已经成为最重要研究方法之一。

质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。

（一）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是化合物的全谱，可以用来进行谱库检索，一般用于未知化合物的定性分析。

实例：（Q1 = 100-259m/z）（二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：不是连续扫描某一质量范围，而是跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。

主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。

实例：（Q1 = 259m/z）本实验采用三重四极杆质谱仪（Q1：质量分析器；Q2：碰撞活化室；Q3：质量分析器），由于多了Q2、Q3的存在，在分析测试的模式上又多了四种选择：（三）子离子扫描模式（Product Scan）：第一个质量分析器固定扫描电压，选择某一质量离子（母离子）进入碰撞室，发生碰撞解离产生碎片离子，第二个质量分析器进行全扫描，得到的所有碎片离子都是由选定的母离子产生的子离子，没有其它的干扰。

AB SCIEX TRIPLE QUAD TM5500的PPG质量准确度校准操作规程一、前期准备1、PPG稀释溶液的准备，对于5500系列采用的标准溶液：正离子模式：POS PPG 2E-7M；负离子模式：NEG PPG 3E-5M2、离子源的垂直旋钮调至“5”位。

3、用质谱仪上的针泵式进样针吸取适量的PPG校准液，检查管路是否连接好。

二、操作步骤1、双击“Hardware Configuration”，激活“MS Only”。

2、菜单栏切换到“Installation”项目。

3、双击“Manual Turning”，打开手动调谐界面。

4、点击“Open File”，选择相对应的采样方法（Q1 Pos PPGs .dam；Q3 Pos PPGs .dam；Q1 Neg PPGs.dam；Q3 Neg PPGs.dam），先正离子再负离子，先Q1调谐再Q3调谐，扫描速率依次为10、200、1000、2000Da/s，对应MCA分别为10、50、50、100 。

5、点击“Start Syringe Pump”，再点击“Start”开始采集数据。

6、将会在界面上出现采集到的质谱图，右键点击右侧质谱图区域，选择“Open Date”。

7、点击工具栏中的“Calibration From Spectrum”。

8、在弹出的菜单中选择合适的校验标准，在“Standard”中选择对应的校准溶液，点击“Start”开始校准前的计算。

9、第一个图形代表的是此次校准与理论值的质量偏差，各点应位于“±0.1Da”线内。

若某质量点超出了设定的范围，则应点击“Update Mass Calibration”，更新那些偏离的质量点的电场参数，使之落到“±0.1Da”线内。

10、第二个图形代表的是PPG校准峰的半峰高宽度，各点应位于“0.6~0.8”范围内。

若某点质谱峰半峰宽超出标准范围，点击界面上的“Advanced”按钮，调节对应的“Offset”电压，使之合规。

梯度洗脱问题－－梯度延迟100 80 60 40 20 021三、HPLC条件的优化IV• 柱温对色谱行为的影响 • 依那普利H3C O OHOOCCH3 NN H O COOH22特殊问题 疏水崩塌H O H H O H H O HH O H H O HH O HH O HH O HH O HH O H H O HH O HH H O H O HHO23四、质谱条件的优化I• HPLC－MS分析的灵敏度之所以比UV 高就在于质谱的灵敏度很高，而且选择 性很好，尤其是MRM方式在生物样品 分析中能有效的排除杂质的干扰。

甚至 于可以不处理生物样品直接进行分析。

24四、质谱条件的优化II• MS条件的优化主要目的是尽量提高待 测物的质谱响应信号。

主要参数有ESI 喷雾电压、APCI的电流、 DP值、 碰撞 能量，雾化气 辅助气的流速，离子源的 温度。

• 另外还有质谱的分辨率也会影响信号强 度25四、质谱条件的优化II• 质谱的分辨率影响信号强度500 peak height709.5 230.3 490.4 1300.4709.5 710.5 711.5300100 0 0 500 1000 m/z 1500 2000709.5H 0.7amu26½H数据采集速度27数据采集速度28质谱扫描时间的影响500 400 peak height 300 200 100 0 0 2 4 6 8 10 12 time (min) 14 16 18 2029如何提高灵敏度—总结™HPLC条件的优化9色谱柱选择 9流动相的选择 ¾流速的影响 ¾洗脱方式 9柱温 9疏水崩塌™MS条件的优化9质谱参数优化 9DP CE Gas 9分辨率调整 9采集速度等30。

世界最新医学信息文摘2019年第19卷第48期 153投稿邮箱：sjzxyx88@HPLC-MS 法测定药品含量的不确定度评定郑文吉（兴安盟食品药品检验检测中心，内蒙古 乌兰浩特）摘要：HPLC-MS 法是目前药品检验中测定药品含量的重要方式，其具有十分广泛的应用，但是在实践中发现，该测定法的测定结果并不是完全准确，其仍旧受到多种因素的影响，因此必须对其不确定度进行评定，以保证其检测的准确性，本文就对HPLC-MS 法测定药品含量的不确定度的评定方法进行探讨和分析，希望能够为相关人员提供帮助。

关键词：HPLC-MS 法；药品含量；不确定度中图分类号：R927.2 文献标识码：B DOI: 10.19613/ki.1671-3141.2019.48.101本文引用格式：郑文吉.HPLC-MS 法测定药品含量的不确定度评定[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(48):153.0 引言液质联用法（HPLC-MS）是药品检验中一种较为有效的分析方法，在该分析法中不需要在进行分析前进行较为繁琐的前处理，并且能够在分析后得到化合物的质核比等诸多信息，在检验中具有高效、快捷以及灵敏的优势，在含量较少且无紫外吸收的化合物分析中具有较好的效果，因此其目前已经作为药物定性定量分析中的标准检测方法在检验中使用。

但是在实践中我们了解到，由于检测方法、仪器等多方面因素的影响，一般情况测定得到的数据往往并非真值，为了保证检测的准确性，使得检查数据具有价值，我们还需要进行不确定度的测定，通过对不确定度进行计算来进一步了解被测定值所应当处于的范围，为药品检验提供了较为有效的数据支持[1]。

而为了保证HPLC-MS 的有效性，我们必须对其测定药品含量的不确定度进行评定。

1 HPLC-MS 法测定中不确定度的来源检验中导致HPLC-MS 法测定出现不确定度的因素较多，包括被测样品以及测定仪器等，而结合实际的测定过程，大致可以将其不确定度出现的来源归纳到以下几个方面：①进行药品称样时，天平以及取样的随机性而出现的随机误差导致不确定度出现；②标准拟合曲线（样品浓度校准）存在的不确定度导致；③使用容量瓶进行定容读取时体积引入出现的误差而导致的不确定度；④样品测定中提取、浓缩以及转移中所出现的误差；⑤标准物质所存在的；⑥标准溶液的配制过程；⑦仪器自身的重复性以及精密度；⑧仪器校准以及测定过程中由于操作的因素；⑨测定方法的不确定性[2]，详情可见图1。

HPLC-MS法测定盐酸二甲双胍片中毒性杂质 N-亚硝基二甲胺（ NDMA）的含量重庆国舒制药有限公司重庆 401338重庆国泰康宁制药有限责任公司重庆 401520摘要：目的建立HPLC-MS法检测盐酸二甲双胍片中毒性杂质N-亚硝基二甲胺的含测定方法。

方法以ACE EXCEL3 C18-AR 4.6mm×100mm，3.0μm为色谱柱，流动相为流动相A：0.1%甲酸溶液流动相B：0.1%甲酸甲醇溶液，柱温40℃，检测波长258nm，流速为0.55ml/min，采用APCI+:MRM扫描模式，定量离子对75.0→43.0 m/z。

结果：该方专属性强，NDMA在0.985ng/ml～98.5ng/ml范围内浓度与峰面积呈良好线性，线性方程为y =8×104 x–1.88×104，相关系数r为0.9999，该方法的回收率在98.58%～101.45%之间，9份溶液平均回收率为99.9%，RSD为0.9%，准确度良好。

结论：该HPLC-MS法能准确检出盐酸二甲双胍片中毒性杂质N-亚硝基二甲胺的含量。

关键词：HPLC-MS法；盐酸二甲双胍片；N-亚硝基二甲胺；含量盐酸二甲双胍片在临床上主要用于单纯饮食控制不满意的II型糖尿病病人，尤其是肥胖和伴高胰岛素血症者，用本药不但有降血糖作用，还可能有减轻体重和高胰岛素血症的效果[1]。

国外报道盐酸二甲双胍片中检出NDMA杂质。

目前所知，NDMA杂质可能通过亚硝化机理生成。

即在一定条件下，胺类化合物尤其是仲胺，）或其他亚硝化试剂反应产生亚硝胺类杂质。

盐酸二甲双胍片与亚硝酸钠（NaNO2中NDMA来源分析：（1）原料引入：盐酸二甲双胍合成起始物料分别是二甲胺和双氰胺，原料药二甲胺本身均含有仲胺结果，但整个合成工艺中均未使用或添加）或其他亚硝化试剂（亚硝酰卤化物、亚硝酸酯、三氧化二氮和亚硝酸钠（NaNO2四氧化二氮），也未使用或添加酰胺类溶剂（如N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等），所以引入亚硝胺类杂质的风险很低。

分析检测HPLC-MS/MS测定食糖中4种合成着色剂陈　艳，张　丽，冉艳瑞，黄　立，万　静，马艳红（昆明市食品药品检验所，云南昆明 650000）摘　要：目的：建立高效液相色谱-串联质谱法（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）测定食糖中4种着色剂的分析方法。

方法：样品经80%甲醇超声提取，再用PWA-2固相萃取柱净化后，经VP-ODS C18柱（2.0 mm×150 mm，5.0 μm）分离，以乙酸铵和甲醇为流动相，梯度洗脱，用HPLC-MS/MS检测。

结果：4种化合物在考察范围内线性良好，相关系数均大于0.999；加标回收率在85.36%～102.30%，RSD为0.42%～2.72%；检出限为2～5 μg·kg-1。

结论：该方法灵敏度高、分辨率高、分析速度快，适用于食糖中合成着色剂的快速筛查和定量分析。

关键词：食糖；高效液相色谱-串联质谱法；合成着色剂；快速测定Determination of 4 Synthetic Colorants in Sugar by HPLC-MS/MS CHEN Yan, ZHANG Li, RAN Yanrui, HUANG Li, WAN Jing, MA Yanhong(Kunming Food and Drug Inspection Institute, Kunming 650000, China) Abstract: Objective: To establish an analytical method for the determination of four colorants in sugar using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). Method: The sample was ultrasonically extracted with 80% methanol, purified with a PWA-2 solid phase extraction column, and then separated on a VP-ODS C18 column (2.0 mm×150 mm, 5.0 μm) with a gradient elution using ammonium acetate and methanol as the mobile phases, and detected by HPLC-MS/MS. Result: The four compounds had good linearity within the investigation range, and the correlation coefficients were all greater than 0.999; the standard recovery rate was 85.36%～102.30%, and the RSD was 0.42%～2.72%; the detection limit was 2～5 μg·kg-1. Conclusion: This method has the characteristics of high sensitivity, resolution and fast analysis speed, and is suitable for rapid screening and quantitative analysis of synthetic colorants in sugar.Keywords: sugar; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; synthetic colorant; rapid determination.食糖作为人们日常生活中的必需品，其安全问题备受关注。

HPLC—MS同时测定小鼠血浆中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸和东莨菪内酯的含量青蒿素是一种常用的抗疟药，但青蒿中其他组分的药效作用很少被考察。

研究发现，当青蒿中的青蒿乙素、青蒿酸、东莨菪内酯3种组分与青蒿素按照质量比为1∶1∶1∶1的比例在小鼠体内考察药效时，与等剂量青蒿素单用组相比可以起到显著的抗疟增效作用。

建立血浆中同时检测青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸和东莨菪内酯4种组分含量的HPLC-MS方法，有助于这种增效现象在药动学层面研究的进一步开展。

采用Agilent公司1200-6130液质联用系统，电喷雾电离源，正离子和负离子检测方式，SIM模式；色谱分离采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，5 μm），流动相乙腈-0.5%乙酸水溶液（60∶40），流速0.3 mL·min-1 ，柱温为40.0 ℃，进样量5 μL。

结果显示，4组分血浆浓度在5～3 000 μg·L-1 呈现良好线性关系，方法专属性、准确度、精密度良好，无基质效应。

该方法适用于小鼠血浆中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸和东莨菪内酯的含量测定，可用于开展4组分小鼠体内药物动力学研究。

标签：青蒿素；青蒿乙素；青蒿酸；东莨菪内酯；液质联用世界卫生组织为了延缓疟原虫青蒿素类药物抗药性的产生，自2001年开始推荐使用基于青蒿素类抗疟药的联合治疗方案（artemisinin-based combination therapies，ACTs）。

ACTs目前在全球疟疾治疗中发挥着重要作用[1-2]。

为了更好利用我国的青蒿资源以及发展新型天然ACTs组合药物，我国学者开展了青蒿多组分配伍抗疟研究。

纪晓光等发现以青蒿素、青蒿酸、青蒿乙素和东莨菪内酯1∶1∶1∶1的比例配伍后，青蒿素用量仅为原剂量的1/4，抗疟药效与青蒿素单用组相当[3-4]。

为了进一步明确4组分配伍增效的机制，需要进一步开展药物相互作用研究。

2,3-二甲基-2,3-二苯基丁烷是一种重要的有机化合物，在化工生产和科研领域具有广泛的应用。

为了准确分析和检测其中的含量，科学家们提出了许多液相检测方法。

本文将就2,3-二甲基-2,3-二苯基丁烷液相检测方法进行深入研究和探讨。

1.方法一：气相色谱-质谱联用法（GC-MS）气相色谱-质谱联用法是目前分析化学领域中一种常用的分析方法，它将气相色谱技术和质谱技术相结合，能够高效地分离和鉴定化合物。

在检测2,3-二甲基-2,3-二苯基丁烷时，首先需要通过气相色谱将混合物中的化合物分离开来，然后再将各个化合物通过质谱进行鉴定和定量。

GC-MS法具有高灵敏度、高分辨率和高选择性的优点，能够对2,3-二甲基-2,3-二苯基丁烷进行准确可靠的检测。

2.方法二：高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法是另一种常用的液相分析方法，它具有分离效果好、分析速度快、对待测物质适应性强等优点。

在检测2,3-二甲基-2,3-二苯基丁烷时，可以选择不同的固定相、流动相和检测条件，以实现对化合物的分离和检测。

HPLC法在分析化学领域中应用广泛，对于检测2,3-二甲基-2,3-二苯基丁烷也具有一定的优势。

3.方法三：毛细管电泳法（CE）毛细管电泳法是一种基于电动力学原理的分析方法，它能够高效地分离离子和中性溶质，对待测物质的种类、结构和物理化学性质要求较低。

在检测2,3-二甲基-2,3-二苯基丁烷时，毛细管电泳法能够通过微小的管道和高电场强度实现对化合物的快速分离和检测，具有潜在的应用前景。

总结：从以上分析可得出，针对2,3-二甲基-2,3-二苯基丁烷的液相检测方法有气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、高效液相色谱法（HPLC）和毛细管电泳法（CE）三种。

每种方法均有其独特的优势和适用范围，可以根据具体的实验要求和待测化合物的性质选择合适的检测方法。

希望未来在2,3-二甲基-2,3-二苯基丁烷检测方法的研究中，能够继续完善和发展更加高效、快速、准确的分析技术，推动相关领域的科学研究和应用发展。

高效液相色谱-串联质谱法高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）是一种现代化分析技术。

它结合了高效液相色谱（HPLC）和串联质谱（MS/MS）两种分析方法，能够快速、准确、灵敏地分析复杂的混合样品中的多种化合物。

HPLC-MS/MS技术的基本原理是将样品通过高效液相色谱进行分离，然后以极高的分辨率将分离后的化合物导入串联质谱分析仪中进行质谱检测和分析。

HPLC部分能够通过改变流速、温度、化合物间隔、载气、反应物、固相分离等方法来分离样品中的成分。

MS/MS 部分则能够通过改变离子源、离子传输、离子选择和离子检测等方式检测化合物。

具体来说，HPLC-MS/MS技术的实现过程如下：需要准备一定量的样品。

样品通常是一种混合物，需要进行分离和净化。

这可以通过一系列的化学方法和生物技术实现。

将样品注入到高效液相色谱仪中进行分离。

高效液相色谱仪通过改变环境条件可以分离出复杂混合物中的单个分量，比如改变洗脱剂的浓度、PH值、离子强度来调整样品中化合物的排列顺序。

高效液相色谱仪具有高速分离和高效洗脱的特点，具有处理大量和复杂样品的能力。

接着，通过HPLC输出的流缓和制备离子源，离子源生成的离子对化合物分子进行离子化。

这个过程利用化合物分子上的R基或者H+来形成游离气态的化合物离子。

然后，将产生的离子通过串接质谱进行分析。

在离子进入串联质谱仪的离子源之前，需要将它们选择性的分离为固定质量和电荷比的离子，这可以通过一系列的电子和电场进行控制来实现。

所得到的离子被送至陷入式离子阱，通过对离子的激发和断裂等过程，形成包含多种离子片段的离子质谱图谱。

这些离子片段遵循一定的质量电荷比的规律，可以通过特征峰和离子质量比等独特的质谱性质来鉴别。

将这些片段的数据输入到质谱数据库中，与已知化合物的质谱数据进行比对。

这样，就能够得到混合物中的每个化合物的特定质谱图谱，从而通过质量分析进行结构确认和鉴定。

HPLC-MS/MS技术的优点是明显的，该技术具有高效和灵敏的特点，能够分析非常低的浓度样品成分。

第52卷第11期 辽 宁 化 工 Vol.52，No.11 2023年11月 Liaoning Chemical Industry November，2023基金项目： 吉林省医药健康产业发展专项引导资金项目（项目编号：YYZX201905）。

收稿日期： 2022-09-27UPLC -MS 法测定磷酸西格列汀中的2种磷酸酯杂质的含量朱红茹1，王广祁1,2*，王健1,3，王芳1，姜斌4（1. 通化东宝药业股份有限公司，吉林 通化 134123； 2. 沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院，辽宁 沈阳 110016；3. 沈阳药科大学 制药工程学院，辽宁 沈阳 110016；4. 山东汇智药物研究有限公司，山东 济南 250101）摘 要： 建立了UPLC -MS 法测定磷酸西格列汀中2种磷酸酯杂质含量的检测方法。

采用C 18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm ）分离，0.01%甲酸和乙腈为流动相进行梯度洗脱，采用单极四级杆检测器，电喷雾离子源，正离子模式进行监测，外标法定量，分析方法时长13 min。

结果表明：该方法的线性关系相关系数r ≥0.995；磷酸西格列汀样品加标回收率为82.05%~105.53%（n =9）；磷酸三甲酯（TMP）检测限为0.007 4 μg·mL -1，磷酸三异丙基酯（TIP）检测限为0.007 8 μg·mL -1。

与常规高效液相方法相比，该方法简单快速，灵敏度高，准确度好，适用于磷酸西格列汀中磷酸三甲酯和磷酸三异丙基酯杂质的检测。

关 键 词：UPLC -MS；磷酸西格列汀；基因毒性杂质；磷酸三甲酯；磷酸三异丙基酯 中图分类号：O657.7 文献标识码： A 文章编号： 1004-0935（2023）11-1702-04药品在生产的过程中，由于工艺条件、环境温度、生产设备的多种影响，往往可能产生杂质，杂质的存在对患者更是“有害无益”。