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第四章 基因克隆的质粒载体

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基因工程第四章载体

基因工程第四章载体

（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。

基因克隆的质粒载体详解124页PPT

基因克隆的质粒载体详解124页PPT
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谢谢！
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
基因克隆的质粒载体详解
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。

第四章 基因工程的质粒载体

第四章 基因工程的质粒载体
（a）表示位于F-细胞中的ColE1质粒的状，它的mob基因进行了转录，其产物 使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1 DNA 便从超盘旋的的结构 转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合 配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能 够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复， 所以就出现这两种构型之间的平衡状态。
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型

第四章基因克隆的载体

第四章基因克隆的载体
第二节 噬菌体载体
（Bacteriophage，简称phage）
一、λ噬菌体载体
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genome
溶源阶段
(整合到寄主染色体上)
溶菌阶段
(复制和释放)
The phage cos ends(cohesive-end site )
Lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段 引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活 后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。
λgt 10
LA 32.7
cI EcoR I
RA10.6
Charon 16A
LA 19.9
lac Z EcoR I
RA21.9
λ 替换型载体（取代型载体）
MCS
M13mp19
MCS
EcoRI BamHI HindIII PstI BglI
BglI PstI HindIII BamHI EcoRI BamHI & PstI
B P
P B
B
P
B
P
B
P
M13克隆 载体分子 结构图
单链DNA噬菌体载体
M13、f1、fd 优越性： 1.单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这 种复制形式的DNA简称RFDNA； 2. 不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌； 3. 单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多少制约的， 不存在包装限制问题； 4. 容易测定外源DNA片断的插入取向； 5. 可产生含外源片断的单链DNA分子。
1.酶切 3.组装
2.连接
4.侵染

基因克隆的载体

基因克隆的载体

3.常用的质粒载体
第二节 噬菌体载体（phage vectors）
噬菌体的生物学特性 噬菌体载体构建 M13噬菌体的生物学特性
M13噬菌体载体
1. 噬菌体的生物学特性
溶菌周期(lytic cycle)：
噬菌体将DNA注入 寄主细胞后很快环 化，然后进行自我 复制、蛋白衣壳合 成和新噬菌体颗粒 的组装，最后使寄 主细胞破裂而释放 出大量的子代噬菌 体。
基因克隆的载体
引 言（introduction） 第一节 质粒载体（plasimid vectors） 第二节 噬菌体载体（phage vectors） 第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 第四节 人工染色体载体（B/Y/HAC）
引
一、基因克隆的本质
言
是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，
三个确保低拷贝质粒精确分
配至子代细胞的基因座 （ parA , parB , ibrary）
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的 片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入 相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组
cILytic cycle clear plaques
selecting recombinant phage via insertional inactivation of the cI gene
Replacement vectors(替换型载体)
4.M13噬菌体载体
（1）M13噬菌体增殖
或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’ 端分别加上几个C或G，成为粘性末端。
接上人工接头 粘性末端 末端转移%的mRNA时所需要的克隆数目。
N=
ln (1-p) ln:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的 n 比例 N：所需的重组载体数（克隆数）

简述基因克隆载体的主要类型

简述基因克隆载体的主要类型

简述基因克隆载体的主要类型
基因克隆载体是指一类可以携带外源DNA片段并能够被复制的DNA分子。

常用于基因工程中，将特定基因序列克隆到载体DNA上，进而进行转化和表达。

根据不同的功能和应用，基因克隆载体可以分为多种类型，以下是主要的几种：
1. 质粒（Plasmid）：质粒是最常用的基因克隆载体之一，通常起源于细菌，具有自主复制的能力，易于操作和扩增。

质粒通常被用于基因表达、基因敲除和基因突变等领域。

2. 病毒载体（Viral Vector）：病毒载体是一类通过改造病毒而成的基因克隆载体，具有高度的转染效率和生物安全性。

病毒载体通常被用于基因治疗、免疫治疗和癌症治疗等领域。

3. 人工染色体（Artificial Chromosome）：人工染色体是一种可以模拟天然染色体结构和功能的基因克隆载体，通常具有高度的稳定性和扩增性能。

人工染色体通常被用于基因组学研究和治疗复杂遗传病等领域。

4. 原核表达载体（Prokaryotic Expression Vector）：原核表达载体是一类专门用于大肠杆菌等原核生物中进行基因表达的基因克隆载体。

原核表达载体通常具有高度的表达效率和易于操作的特点，被广泛应用于蛋白质制备和生物技术研究等领域。

第四章基因克隆的载体、噬菌体载体

第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
噬菌体再感染。
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。

《基因克隆的载体》课件

《基因克隆的载体》课件

噬菌体
适用于大批量表达分泌蛋白的研究，转化后可产生 高水平的基因表达。
Cosmid
BAC
可容纳大型外源DNA片段，适用于聚合酶连锁反应、 基因组构建和定位大片段DNA序列等研究。
适合于构建大型基因组和物种基因组序列的物 理/遗传图谱。
基因克隆的步骤
1
下载或制备载体
获取可自主复制的载体，或通过人工合成的方法制备载体。
特点
常见的基因克隆载体质粒具 有如下特点： 1. 大小适中； 2. 构建简单方便； 3. 易于操作且可大量扩增； 4. 可以自主复制； 5. 便于基因操纵和定向表达 等。
类型
常见的载体类型包括质粒、 噬菌体、Cosmid和BAC等。
常见的基因克隆载体
质粒
最常见的基因克隆载体，易于操作且可大量扩增。
基因克隆的载体
克隆技术是现代生命科学研究的重要手段之一。基因克隆技术作为克隆技术 的重要组成部分，因其应用领域的广泛性及重要性而备受关注。本课程将为 您详细介绍基因克隆的载体知识。
载体的定义和特点
定义
基因克隆载体是指具有自主 复制能力的DNA分子，具有 携带外源DNA片段进入细胞 和定向操纵目的基因表达等 功能。
基因克隆的验证
1 检测重组载体
常用方法包括PCR，南方杂交等。通过检测 目的基因的插入，判断载体是否重组成功。
2 验证目的基因的插入
常用方法包括Sequencing和Southern blotting等，验证目的基因是否插入到载体中。
总结和展望
总结
基因克隆载体是基因克隆技术的重要组成部分， 应用领域广泛。核心在于选取合适的载体、构 建载体、将基因植入载体并最终将载体转化到 受体细胞中。
2

(整理)基因克隆的质粒载体

(整理)基因克隆的质粒载体

基因克隆的质粒载体在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较 详尽研究的主要有质粒、质粒和 质粒。

①质粒又叫因子或性质粒（ ）m 它们能够使寄主染色体上 的基因和 质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。

②质粒通称抗药性因子。

它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且 通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的 抗菌素抗性能力。

③ 质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。

它们编码有控制大肠杆菌素合成 的基因。

大肠杆菌是一类可以使不带有 质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死 的蛋白质。

第一节 质粒的一般生物学特性一、质粒细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。

绝 大多数的质粒都是由环形双组成的复制子（图 ）。

Q 大肠杆菌质粒分子的结构示意图质粒是细菌染色体外能够自我复制的环形双链的DNA 分子.编码抗菌素抗性基因的 质粒叫R 质粒，大部分质粒是可以转移的，但也存在着不能够转移的质粒 环形质粒分子 环形染色体DNA大肠杆菌细胞质粒分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

环形双链的质粒分子具有三种不同的构型：1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形（），这样的通常呈现超螺旋的构型；2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环（）N此即构型；3若质粒经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子l ），通称构型（见图—l。

(a) (b)质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图由于琼脂糖中加有嵌入型染料漠化乙锭.因此, 在紫外线照射下DNA电泳条带呈橘黄色。

（a）道中的SC DNA走在凝胶的最前沿.OC DNA则位于凝胶的最后边Mb）道中的LDNA是经核酸内切限制醉切割质粒之后产生的.它在凝胶中的位置介于OC DNA 和SC DNA 之间在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。

基因工程的质粒载体

基因工程的质粒载体

E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞
病毒载体 穿梭载体
动物细胞
动物细胞 和细菌
结构 环状 线状 环状 环状 环状 环状 线性染色体
线性染色体 环状 环状
插入片断 〈 8*
9 - 24kb
〈 10 kb 35- 45kb ≈300 kb
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列
OC L
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒: 能自我转移
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
自主复制基因，转移基因，细 菌染色体区段
（5）分子量要相对较小 （6）在细胞内稳定性要高 （7）易分离纯化 ※表示载体必须具备的条件
（四）基因工程中常用的载体
基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
载体的种类和特征
质粒*
受体细胞 E.coli
M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
第一节 质粒载体
一、质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的 双链闭合环状DNA分子。

四、基因克隆载体(一)

四、基因克隆载体(一)
把非洲爪蟾核糖体基因片段同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并 在菌体内成功转录出相应的mRNA。 这是第一次成功的基因克隆实验。
2、pBR322
p—plasmid，BR分别为该质粒的两位主要构 建者F. Bolivar和R.L. Rodriguez姓氏的头一个字 母，“322”为实验编号。
含有双抗基因（Apr，Tcr）和Col E1复制起始 子。
融合型蛋白表达载体：pET28a
非融合型蛋白表达载体：pKK223-3（强启动子Ptac）
（三）、质粒载体的构建
构建质粒克隆载体的基本策略如下：
① 构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行 有效的复制并且作为质粒克隆载体，希望在受体细胞中 有较多的拷贝数。 * 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
克隆载体(cloning vector)： 指能够把外源DNA片段带入受体细胞，并进
行稳定遗传的DNA或RNA分子
穿梭载体(shuttle vector)： 带有两种不同的复制起始位点，可以在两种
不同的生物体中复制的质粒载体
表达载体(expression vector) 一种克隆载体，可以使插入的外源DNA片段
严紧型质粒(stringent plasmid)：拷贝数少，1－数个， 松弛型质粒(relaxed plasmid) ：拷贝数多，10个以上
（提取质粒时，可添加氯霉素）
4. 质粒的不亲和性(Incompatible):
两种类似的不同质粒不能存在于同一细胞中。 亲和质粒、不亲和质粒
5. 质粒的可转移性：
D） Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物， 促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移
E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr， F） 产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒） G） 降解基因：降解重金属、有机物和农药等 H) 致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒

4第四章 基因克隆的载体-3柯斯质粒

4第四章 基因克隆的载体-3柯斯质粒

因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外 包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式 将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬 菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内并自 我复制。 柯斯质粒（cosmid）
cos位点 cos site-carring plasmid 质粒
二、柯斯质ห้องสมุดไป่ตู้载体的特点
Formation of a cosmid clone
Digestion
Ligation
C) Packaging and infect
Ligation to cleaved cosmid vector molecules can produce vector-target concatemers, resulting in a large exogenous DNA fragment flanked by cos sequences.
③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，不易 于检测：因此如用柯斯质粒制备基因文 库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌 落很费时间。现虽建立了高密有可能通过同宿主基因组交换而致丢失 等，所以最常使用的还是噬菌体载体。
第三节 柯斯质粒(cosmid)
一、柯斯质粒（cosmid）概述
1、定义：是由λ噬菌体与质粒（plasmid）共同构 建而成的杂合载体。 2、柯斯质粒DNA:
λ噬菌体的cos位点:使其可被包装蛋白识别包装； 质粒的复制起点：使其在宿主细胞中可自主复制。
另外还含有与cos位点相邻的控制包装作用的序列， 质粒中的抗性标记基因（如：AmpR，TetR），以 及酶切位点（EcoRⅠ、HindⅢ）。
四、柯斯质粒作载体的优、缺点
1、优点： 可携带外源基因大， 30～44.5 kb 。

第四章 基因克隆的质粒载体

第四章 基因克隆的质粒载体
2021/8/4
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（ SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2021/8/4
2021/8/4
2021/8/4
碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
2021/8/4
2021/8/4
8.质粒ＤＮＡ的分离与纯化
(1)氯化铯密度梯度离心法 (2)碱变性法 (3)微量碱变性法
2021/8/4
氯化铯密度梯度离心法
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%； 2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子
量的细菌染色体易断裂成线性片段，而质 粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的 状态； 3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链 的碱基中，导致链的解旋；而且形成的 EB- DNA复合物中，EB含量越高，密度会 越低。
线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而 形成。称L构型。
2021/8/4
什么是超螺旋(superhelix 或supercoil) ？ DNA是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺
旋DNA的这个轴再弯曲缠绕时，DNA就处于超螺旋状态， DNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNA三级结构 的一个重要特征。
迁移作用(mobiligation): 由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.
2021/8/4
2021/8/4
从基因工程安全角度考虑，接合型质粒不宜作为克隆载体。 因为从理论上存在着发生使ＤＮＡ跨越生物种间遗传屏障 的潜在危险.

(整理)质粒特性

(整理)质粒特性

第四章基因克隆的质粒载体在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。

①F质粒又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。

它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。

②R质粒通称抗药性因子。

它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。

③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。

它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。

大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。

第一节质粒的一般生物学特性一．质粒DNA细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。

绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。

质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。

在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。

其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA（图4-3）。

凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。

二．质粒DNA编码的表型质粒DNA仅占细胞染色体组的1%～3%左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。

基因克隆载体-质粒

基因克隆载体-质粒
4. 载体DNA分子应尽可能小 5. 根据需要组装各种小原件
pSC101质粒
第一个用于克隆真核基因的大肠杆菌质粒载体
有四环素抗性基因 含有EcoR I等酶的酶切位点 严谨型复制质粒
ColE1 质粒
编码大肠杆菌毒素E1基因和使宿主细胞对
E1免疫的基因
松弛型复制质粒
pBR322质粒
添加多克隆位点 MCS
pUC18/19
TA载体
TA载体是针对PCR而设计的一种质粒载体
耐热性DNA聚合酶（Taq酶）具有一种非模板依 赖活性，可在PCR产物的3’端加上一个非配对的 A，根据该特性，设计出一种5’端带一个不配对 的T，通过该质粒，可以直接将PCR产物以TA连 接方式进行克隆，即TA克隆克隆载体是一种能携带外源DNA片段进入 受体细胞，并在受体细胞中得以维持或表 达的DNA分子。
生物学本质：质粒、噬菌体、动植物病毒改造后的产物。 特 点：能在受体细胞内稳定存在和复制。
载体的一般特征
1. 容易进入受体细胞
2. 自主复制功能
3. 显著的筛选标记
pBR322 质粒的使用 使用同一种酶切割pBR322和目的基因
正确连接目的基因的质粒 自身连接的质粒 细菌没有吸收 pBR322 质粒
通过筛选基因进行筛选
pUC18/19
pUC18/19 由pBR322衍生构建而成
删除了pBR322的抗四环素基因 保留氨苄青霉素的抗性基因 添加乳糖操纵子的一个片段lac Z’（启动子、调 节因子、β -半乳糖苷酶的α -肽基因）
pBR322质粒是由多个质粒通过DNA重组技 术构建的质粒。
pSC101质粒 四环素抗性基因 提供复制起始点 ColE1 -> pMB1质粒 R1drd19质粒 缩小体积

第四章 基因克隆的质粒载体

第四章 基因克隆的质粒载体

rRNA操纵子 3
菌毛合成
表面多糖
结瘤，固氮
表面多糖
固氮
5、隐蔽质粒(cryptic plasmid)
•
不显示任何表型效应的质粒
三、质粒DNA的转移
（一）质粒的类型

接合型质粒：具有自主复制的遗传信息，
一套控制细菌配对和质粒结合转移的基因 非接合型质粒：只具有自主复制基因，不 能从一个细胞转移到另一个细胞。
Plasmid Substrates Strain Size (bp) Catabolic gene References
Nylon Flavobacterium K172 45519 nylA oligomers nylBC pNL1 Biphenyl,naphthalene Sphingomonas 184457 pbh, xyl, m-xylene, p-cresol aromaticivorans F199 nah, pch pADP-1 Atrazine Pseudomonas ADP 108845 atzA,atzB atzC,atzDEF pWWO Xylene,Toluene P. putida mt-2 116580 xyl pAO1 Nicotine Arthrobacter nicotinovorans P. resinovorans CA10 165137

同一大肠杆菌细胞，一般不能够同时含有两 种不同的pMB1派生质粒或ColE1派生质粒 质粒的不亲和性：在没有选择压力的情况下， 两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同 一寄主细胞中稳定的共存的现象。


在细胞的增值过程中，其中必有一种被稀释， 这两种质粒称为不亲和质粒。
2、不亲和群

pMB1的派生质粒（或ColE1的派生质粒）

第四章克隆载体的特征及类型

第四章克隆载体的特征及类型
用于外源基因的高效表达
lacZ’ PT7 MCS
pGEM-3E 2743 bp
PSP6
ori
注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合 酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如： E.coli BL21（DE3）等
在重组的 pGEM3Z载体中 加入相应的RNA 聚合酶，可以 发生外源基因 转录。
质粒的构建
质粒
天然存在的两种质粒 colE1宿主细菌大肠杆菌，6.5kb，松弛型复制20-
30/cell
pSC101宿主细菌沙门氏菌，8.8kb，严谨型复制5/cell ，标记基因为Tcr
理想的质粒载体应具备的条件
1. 分子量较小。 2. 松驰型，在受体细胞中有较多的拷贝数。 3. 具有一个以上的选择标记基因，形成重组质粒后，至少还要有
质粒载体总体评价
操作简便 克隆容量有限（< 10kb）
第二节 噬菌体或病毒DNA
噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染 宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏 起来。
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增
噬菌体或病毒DNA
质粒
质粒的基本特征
3. 质粒的可转移性 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用 如Col、R的其它成员 值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒 的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和 mob 基因决定
载体的功能
第一节 载体的功能及特征
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成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离 心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最 后用乙醇沉淀，获得质粒DNA

非接合型质粒比较小，自身不能编码全部转 移体系所需的酶，不能实现自我转移，如果 在寄主细胞中有共存的接合型质粒，可以引 发非接合型的转移。（图 4-7）
五、质粒DNA的复制类型

严谨型复制控制质粒：低拷贝数的质粒，每 个寄主细胞中仅含有1～3份拷贝 松弛型复制控制质粒：高拷贝数的质粒，每 个寄主细胞中含有10～60个拷贝 接合型质粒一般属于严谨型 非接合型质粒一般属于松弛型 （表 4-3）
3、降解质粒

许多环境污染物的降解途径由质粒基因编
码，降解基因组成几个操纵子，操纵子的表 达受调节基因控制。

目前，已经测定全序列并注释基因的降解
质 粒 有 10 余 种 ， 如 尼 龙 寡 聚 体 降 解 质 粒 pOAD2，芳香烃降解质粒pNL1等。
The catabolic plasmids that complete sequence has been determined
氯化铯：是一种离子性介质、水溶性大， 最高密度可达1.91g/ml。由于它是重金属盐 类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率， 被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白 的分离，但价格较贵。
（二）流程

首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（ SDS ） 来促进大肠杆菌的细胞裂解。

将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆 菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链的碱基中去。
的非染色体控制的遗传性状。

抗性特征、代谢特征、修饰寄主的生活方
式等。
1、抗性质粒
包括抗菌素抗性（R）质粒和金属抗性 质粒。

R质粒的进化、转移和扩散给抗菌素治 疗带来很大麻烦，是医学所面临的重大 问题之一。

2、毒力质粒

许多细菌的致病力和毒性与质粒有关，如
大肠杆菌肠毒素和定居抗原，破伤风毒素， 炭疽毒素，溶血毒素，苏云金芽孢杆菌的杀 虫晶体蛋白，植物冠瘿病（ Ti 质粒）和发根 病（Ri质粒）。
Plasmid Substrates Strain Size (bp) Catabolic gene References
Nylon Flavobacterium K172 45519 nylA oligomers nylBC pNL1 Biphenyl,naphthalene Sphingomonas 184457 pbh, xyl, m-xylene, p-cresol aromaticivorans F199 nah, pch pADP-1 Atrazine Pseudomonas ADP 108845 atzA,atzB atzC,atzDEF pWWO Xylene,Toluene P. putida mt-2 116580 xyl pAO1 Nicotine Arthrobacter nicotinovorans P. resinovorans CA10 165137
E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli
酵母细胞 哺乳类细胞 动物细胞 动物细胞 和细菌
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等
EMBL系列，λ gt系列 M13mp系列 pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV Pel oBAC系列 PCYPAC1
第四章 基因克隆的质 粒载体
载体
载体（vector）是由在细胞中能够自 主复制的 DNA 分子构成的一种遗传成 分，通过实验手段可使其它的 DNA 片
段连接在它的上面，进行复制。
• 作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能
1、分子较小，可携带比较大的DNA片段。 2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
Ent质粒
例：F质粒的接合转移机制
F质粒的分子大小为 94 kb，编码接合转移功 能的 tra 基因区位于遗传和物理图谱的 66.6 － 100 kb位置，编码37个蛋白质和1个反义RNA，这些
分子分别负责性菌毛的合成和装配，杂交对的稳
定，表面排斥， DNA 转移，以及 tra 区基因表达
的调节。（图 4-4）
4、共生质粒
在许多根瘤菌属细菌中存在与结瘤和固氮有 关的共生质粒，质粒的大小在 1000 kb 以上， 与细菌染色体基因一起行使固氮功能

Sinorhizobium meliloti 的豆科共生复合基因
组由3部分组成：染色体为3654135 bp，pSymA 为 1354226 bp （ 结 瘤 和 固 氮 ） ， pSymB 为 1683333 bp。


六、质粒的不亲和性(Incompatibility) 1、质粒的不亲和现象

同一大肠杆菌细胞，一般不能够同时含有两 种不同的pMB1派生质粒或ColE1派生质粒 质粒的不亲和性：在没有选择压力的情况下， 两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同 一寄主细胞中稳定的共存的现象。


在细胞的增值过程中，其中必有一种被稀释， 这两种质粒称为不亲和质粒。

在EB达到饱和时，进行氯化铯密度梯度离心。
二、碱变性法

根据共价闭合环状质粒 DNA与线性染色体 DNA片断 之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。

在 pH 值 12.0 ～ 12.5 范围内时，线性的 DNA 会被变性
而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。

通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形

按接合转移功能分类 非接合型
主要基因 自主复制基因，产生 大肠杆菌素基因 自主复制基因，产生 抗菌素抗性基因
按抗性记号分类 Col质粒
R质粒 F质粒
接合型
自主复制基因，转移 基因，细菌染色体区 段 自主复制基因，产生 大肠杆菌素基因
Col质粒 R质粒
自主复制基因，产生 抗菌素抗性基因
自主复制基因，产生 大肠杆菌素基因
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%； 2、在细胞裂解及 DNA 分离过程中，大分子量的细 菌染色体易断裂成线性片断，而质粒DNA分子量 小，结构紧密仍保持完整的状态；
3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱基 中，导致链的解旋；而且形成的EB-DNA复合物 中，EB含量越高，密度会越低。
•
中华苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）1021的基因组组成
性质 染色体 pSymA pSymB 基因组
长度(bp)
蛋白基因 tRNA基因 共生功能
3654135
3341 51 菌毛合成
1354226
1293 2 0
1683333
1570 1 0
6691694
6204 54 3
图1-10 F质粒接合转移区的结构（66.6-100 kb区）
traA：性菌毛亚基； traS和traT：表面排斥； traY：缺口酶； traN和traG：杂交对稳定； traM：转移信号； traI：DNA解旋酶；
traD：驱动单链DNA转移；traJ、finO、finP：调节基因
四、质粒DNA的迁移作用
促旋酶
形成 拓扑异构酶Ⅰ
ccc DNA
解旋
3、分子量

最小的质粒仅能编码2～3种中等大小的蛋白 质，分子量约106dal 最大的可达108dal 复制基因 选择性标记 克隆位点

4、基因克隆用的质粒载体必需具备：

二、质粒DNA编码的表型

质粒 DNA 占染色体组的 1 ～ 3 ％，编码重要
pOAD2
pCAR1 Carbazole
199035
210205 67066 87688 101858 83042
pBD2 Isopropylbenzene Rhodococcus Erythropolis BD2 pUO1 Haloacetates Delfitia Acidovorans B pJP4 2,4-D Ralstonia 3-chlorobenzoate eutropha JMP134 pND6-1 naphthalene Pseudomonas ND6 pDTG1 naphthalene P. putida NCIB 9816-4
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要 最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。 5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且 尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些 实验室内特殊菌种内才可复制等等。
rRNA操纵子 3
菌毛合成
表面多糖
结瘤，固氮
表面多糖
固氮
5、隐蔽质粒(cryptic plasmid)
•
不显示任何表型效应的质粒
三、质粒DNA的转移
（一）质粒的类型

接合型质粒：具有自主复制的遗传信息，
一套控制细菌配对和质粒结合转移的基因 非接合型质粒：只具有自主复制基因，不 能从一个细胞转移到另一个细胞。
MAC (Mammalian Artificial Chromosome)
病毒载体 穿梭载体
线性染色体 环状 环状
第一节 质粒的一般特性 第二节 质粒DNA的分离与纯化 第三节 质粒载体的构建与类型 第四节 重要的大肠杆菌质粒载体
第五节 质粒载体的稳定性问题
第一节 质粒的一般特性 一、质粒DNA
Microbiology 1995,141:2585 J. Bacteriol. 1999,181:1585 J. Bacteriol. 2001,183:5684 Envi.. Microbiol. 2002,4:856 ndh, 6hlno J. Bacteriol. kdh, dhph 2003,185:1976 carABCDEF J. Mol. Biol. antABC 2003,326:21 ipbA1A2A3A4 J. Bacteriol. 2003,185:5269 dehH1, dehH2 J. Bacteriol. 2003,185:6741 tfdA, tfdB Envi..Microbiol. tfdCDEF 2004,6:655 nah Gene 2004,336:231 nah J. Mol. Biol. 2004,341:753