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第1讲基因工程基因工程的基本工具及基本程序1．基因工程的概念(1)概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(2)优点①与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
②与诱变育种相比：定向改造生物的遗传性状。
2．基因工程的基本工具(1)限制性核酸内切酶(简称限制酶)。
①来源：主要来自原核生物。
②特点：具有专一性，表现在两个方面：识别——双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。
切割——特定核苷酸序列中的特定位点。
③作用：断裂特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
④结果：产生黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒的特点⎩⎪⎨⎪⎧能自我复制有一个至多个限制酶的切割位点有特殊的标记基因 ③运载体的作用：携带外源DNA 片段进入受体细胞。
3．基因工程的基本程序 (1)目的基因的获取 ①从基因文库中获取 ②人工合成⎩⎪⎨⎪⎧ 利用mRNA 反转录合成通过DNA 合成仪用化学方法人工合成 ③利用PCR 技术扩增(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心①目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
②基因表达载体的组成(3)将目的基因导入受体细胞①转化含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内遗传和表达的过程。
②转化方法4.PCR (1)原理：DNA 双链复制。
(2)条件⎩⎪⎨⎪⎧ 模板：DNA 母链酶：Taq 酶引物：分别与单链相应序列相结合原料：分别为dCTP 、dATP 、dGTP 、dTTP 。
(4)结果：上述三步反应完成后，一个DNA 分子就变成了两个DNA 分子，随着重复次数的增多，DNA 分子就以2n的形式增加。
PCR 的反应过程都是在PCR 扩增仪中完成的。
1．基因工程技术使用限制酶需注意的四个问题(1)获取目的基因和切割载体时，经常使用同一种限制酶(也可使用能切出相同末端的不同限制酶)，目的是产生相同的黏性末端或平末端。
最新考纲1．基因工程的诞生Ⅰ2．基因工程的原理及技术Ⅱ3．基因工程的应用Ⅱ4．蛋白质工程Ⅰ实验：DNA的粗提取与鉴定考纲解读1．基因工程的实质2．基因工程操作的四步曲及其操作实例3．基因工程在农业、医药生产、疾病诊断和治疗中的应用4．蛋白质工程的一般操作过程知识点一基因工程的概念及基本工具议一议：限制酶主要存在于原核生物中，它有什么意义？知识点二基因工程的基本操作程序想一想：什么叫基因文库？建立基因文库有什么意义？看一看：某研究小组在利用基因工程改造棉花时，发现转入的目的基因始终不表达，其原因可能是什么？知识点三 基因工程的应用想一想：基因治疗是针对什么样的病进行的？知识点四蛋白质工程质粒载体质粒是细菌拟核DNA外的环状DNA小分子，可在细菌间转移。
质粒是常用的转基因载体。
病毒载体病毒很适合用于基因治疗。
病毒的蛋白质外壳内能容纳多达7 500个碱基的DNA片段。
当病毒侵染宿主细胞并在细胞内增殖时，也将重组DNA带入到细胞中。
病毒已经多次用于基因治疗的临床实验。
这种方法存在的问题是宿主对病毒的免疫反应。
显微注射法DNA可以通过显微注射法转入动物细胞中。
下图所示的是目的基因的多份拷贝正通过玻璃微型吸管注射到受精卵中。
转基因小鼠和家畜都是利用这种方法产生的，但是成功率很低；只有2%～3%的受精卵发育成转基因动物，在这些动物中只有一小部分表达了转入的基因。
基因枪法这种方法是利用压缩气体产生的动力将包裹在金属颗粒表面的外源DNA打入生物组织中。
常用的金属颗粒有金粉粒子或钨粉粒子。
一些细胞能像表达自身基因一样表达导入的外源DNA。
学习笔记：自我校对：①DNA重组②体外DNA重组③转基因④遗传特性⑤生物类型⑥生物产品⑦限制酶(限制性核酸内切酶)⑧某种特定核苷酸序列⑨特定部位的磷酸二酯键○10黏性末端⑪平末端⑫DNA连接酶⑬磷酸二酯键⑭质粒⑮小型双链环状DNA⑯限制酶⑰复制⑱遗传标记基因⑲λ噬菌体的衍生物⑳编码蛋白质○21PCR技术○22启动子○23终止子○24农杆菌转化法○25显微注射法○26插入了目的基因○27转录出了mRNA○28抗病○29抗逆○30生长速度○31品质○32药物○33器官移植○34蛋白质○35蛋白质○36氨基酸○37脱氧核苷酸议一议：限制酶在原核生物中主要是切割外源DNA，使之失效，从而达到保护自己的目的。
选修三第一讲基因工程[课时作业]一、选择题1．限制酶是一种核酸内切酶，可识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。
下图为四种限制酶Bam HⅠ、Eco RⅠ、HindⅢ和BglⅡ的识别序列和切割位点Bam HⅠEco RⅠHindⅢBglⅡ↓↓↓↓GGATCC GAATTC AAGCTT AGATCTCCTAGG CTTAAG TTCGAA TCTAGA↑↑↑↑切割出来的DNA黏性末端可以互补配对的是() A．Bam HⅠ和Eco RⅠB．Bam HⅠ和HindⅢC．Bam HⅠ和BglⅡD．Eco RⅠ和HindⅢ解析：只有黏性末端相同才可互补，Bam HⅠ和BglⅡ切出的末端相同。
答案：C2．近年来基因工程的发展非常迅猛，科学家可以用DNA探针和外源基因导入的方法进行遗传病的诊断和治疗，下列做法中不．正确的是() A．用DNA探针检测镰刀型细胞贫血症B．用DNA探针检测病毒性肝炎C．用导入外源基因的方法治疗半乳糖血症D．用基因替换的方法治疗21三体综合征解析：镰刀型细胞贫血症是由于基因突变引起的疾病，用β珠蛋白的DNA探针可以检测到；用DNA探针也可以很方便地检测出肝炎患者的病毒；半乳糖血症是由于体内缺少半乳糖苷转移酶，将带有半乳糖苷转移酶的基因导入半乳糖血症患者的体内，可以治疗这种疾病；21三体综合征是由于患者多了一条21号染色体，不能用基因替换的方法治疗。
答案：D3.质粒是基因工程中最常用的运载体，它存在于许多细菌体内。
质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。
外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，下表是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是()A．①是c；②是b；③是aB．①是a和b；②是a；③是bC．①是a和b；②是b；③是aD．①是c；②是a；③是b解析：对①细菌来说，能在含青霉素的培养基上生长，也能在含四环素的培养基上生长，说明抗青霉素基因和抗四环素基因没有被破坏，插入点是c；对②细菌来说，能在含青霉素的培养基上生长，说明其抗青霉素基因正常，不能在含四环素的培养基上生长，说明其抗四环素基因被破坏，插入点应为b；对③细菌来说，不能在含青霉素的培养基上生长，说明其抗青霉素基因被插入而破坏，故插入点为a。
第三章基因工程知识点梳理第一节重组DNA技术的基本工具1.实施基因工程的最终目的：定向改造生物的遗传性状2.DNA酶的作用：断开磷酸二酯键使DNA分子水解为它的基本单位脱氧核苷酸3.限制酶（限制性内切核酸酶）的作用：断开磷酸二酯键使DNA分子水解为DNA分子的片段4.DNA连接酶的作用：能连接两个具有碱基互补配对的DNA片段之间的磷酸二酯键5.DNA聚合酶的作用：能把游离的脱氧核苷酸连接在引物的3，端6.解旋酶的作用：断开DNA两条链之间的氢键7.基因工程的基本工具：（1）分子手术刀—限制性内切核酸酶简称限制酶功能：识别和断开DNA分子的特定核苷酸序列如：EcoR1识别的脱氧核苷酸序列：GAATTC，断开G,A之间的磷酸二之间,形成黏性末端Sma1EcoR1识别的脱氧核苷酸序列：CCCGGG，断开C,G之间的磷酸二之间,形成平末端（2）分子缝合针—DNA连接酶功能：将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。
DNA连接酶有上千种，可以分为两类，一类是从大肠杆菌中分离得到的E.coliDNA连接酶，只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段。
T4DNA 连接酶既可以缝合黏性末端又可以缝合平末端，但连接平末端的效率相对较低。
（3）分子运输车—基因进入受体细胞的载体外源基因怎样送入细胞? 通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。
8.质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
在基因工程中使用的载体除了质粒还有噬菌体，动植物病毒等。
9.成为载体的条件：（1）能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上随受体DNA同步复制（2）有特殊的标记基因便于重组DNA分子的筛选。
（3）有一个或多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中（4）对受体细胞无害10.DNA的粗提取与鉴定（1）选择富含DNA的生物组织使细胞内容物溶出。
2009高考生物选修复习选修3导学提纲（一）专题1 基因工程第1节 DNA重组技术的基本工具【学习目标】1、说出DNA重组技术所需的三种基本工具的作用【自主学习】1、基因工程的定义： ___________________________________________________________________________________________________________________________________。
2、基因工程（DNA重组技术）的基本工具（1）基因工程的“分子手术刀”名称：__________________________。
来源：__________________________。
作用：能识别双链DNA分子的___________________序列，并且使每一条链中__________的两个核苷酸之间的_____________断开。
（例如EcoRI、SmaI限制酶识别的序列和切割位点）结果：形成______________________________。
（2）基因工程的“分子缝合针”名称：__________________________。
种类：①__________________；只能_____________________________________________。
②__________________。
既可以___________________________________________,又可以________________________________________。
作用：形成_____________________。
结果：形成_____________________。
（3）基因工程的“分子运输车”名称：_____________________。
种类：____________________；______________________；______________________。
最新考纲1．基因工程的诞生Ⅰ2．基因工程的原理及技术Ⅱ3．基因工程的应用Ⅱ4．蛋白质工程Ⅰ实验：DNA的粗提取与鉴定考纲解读1．基因工程的实质2．基因工程操作的四步曲及其操作实例3．基因工程在农业、医药生产、疾病诊断和治疗中的应用4．蛋白质工程的一般操作过程知识点一基因工程的概念及基本工具议一议：限制酶主要存在于原核生物中，它有什么意义？知识点二基因工程的基本操作程序想一想：什么叫基因文库？建立基因文库有什么意义？看一看：某研究小组在利用基因工程改造棉花时，发现转入的目的基因始终不表达，其原因可能是什么？知识点三 基因工程的应用想一想：基因治疗是针对什么样的病进行的？知识点四蛋白质工程质粒载体质粒是细菌拟核DNA外的环状DNA小分子，可在细菌间转移。
质粒是常用的转基因载体。
病毒载体病毒很适合用于基因治疗。
病毒的蛋白质外壳内能容纳多达7 500个碱基的DNA片段。
当病毒侵染宿主细胞并在细胞内增殖时，也将重组DNA带入到细胞中。
病毒已经多次用于基因治疗的临床实验。
这种方法存在的问题是宿主对病毒的免疫反应。
显微注射法DNA可以通过显微注射法转入动物细胞中。
下图所示的是目的基因的多份拷贝正通过玻璃微型吸管注射到受精卵中。
转基因小鼠和家畜都是利用这种方法产生的，但是成功率很低；只有2%～3%的受精卵发育成转基因动物，在这些动物中只有一小部分表达了转入的基因。
基因枪法这种方法是利用压缩气体产生的动力将包裹在金属颗粒表面的外源DNA打入生物组织中。
常用的金属颗粒有金粉粒子或钨粉粒子。
一些细胞能像表达自身基因一样表达导入的外源DNA。
学习笔记：自我校对：①DNA重组②体外DNA重组③转基因④遗传特性⑤生物类型⑥生物产品⑦限制酶(限制性核酸内切酶)⑧某种特定核苷酸序列⑨特定部位的磷酸二酯键○10黏性末端⑪平末端⑫DNA连接酶⑬磷酸二酯键⑭质粒⑮小型双链环状DNA⑯限制酶⑰复制⑱遗传标记基因⑲λ噬菌体的衍生物⑳编码蛋白质○21PCR技术○22启动子○23终止子○24农杆菌转化法○25显微注射法○26插入了目的基因○27转录出了mRNA○28抗病○29抗逆○30生长速度○31品质○32药物○33器官移植○34蛋白质○35蛋白质○36氨基酸○37脱氧核苷酸议一议：限制酶在原核生物中主要是切割外源DNA，使之失效，从而达到保护自己的目的。
想一想：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体细菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
建立基因文库，便于随时获取目的基因。
看一看：构建基因表达载体时，可能没有加入启动子。
想一想：基因治疗一般针对很难用一般药物进行治疗的由基因异常引起的遗传病。
,基因工程的基本操作工具高考地位：5年11考 （2011浙江卷，2010浙江卷、江苏卷……） 1．与DNA 分子相关的酶(2)限制酶与DNA 连接酶的关系①限制酶不切割自身DNA 的原因是：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
②DNA 连接酶起作用时不需要模板。
2．载体 (1)作用①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。
②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
(2)具备的条件①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。
②有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。
③具有特殊的标记基因，以便进行筛选。
(3)种类①质粒：一种祼露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA 之外，能够自我复制的很小的双链环状DNA 分子。
②λ噬菌体的衍生物。
③动植物病毒。
提醒①一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。
②限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。
★本部分知识多以选择题的形式出现，并且与必修内容联系密切，也可在基因工程综合题中作为某一具体问题出现。
【典例1】►(2011·浙江卷)将ada(腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。
下列叙述错误的是()。
A．每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒B．每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点C．每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个adaD．每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子解析将重组质粒导入大肠杆菌中并成功表达，说明大肠杆菌内至少含有一个重组质粒；每个重组质粒都含有目的基因ada，则该重组质粒至少含一个能被该限制性核酸内切酶切割的位点；限制性核酸内切酶具有特异性，种类不同，识别的位点不同，切割出的黏性末端也就不同，因此并不是每个位点都能插入ada；根据题干信息，导入重组质粒的大肠杆菌成功表达出腺苷酸脱氨酶，说明插入的ada至少表达出一个腺苷酸脱氨酶分子。
答案 C【训练1】►下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述，错误的是()。
A．一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B．限制性核酸内切酶的活性受温度影响C．限制性核酸内切酶能识别和切割RNAD．限制性核酸内切酶可从原核生物中提取解析考查基因工程中工具酶的有关知识。
限制性核酸内切酶的化学成分是蛋白质，它的活性受到温度和pH的影响；限制性核酸内切酶的特点是能识别双链DNA中特定的核苷酸序列，可在特定的位点进行切割，但不能识别和切割RNA；限制性核酸内切酶主要是从原核生物体内分离出来的。
答案 C【训练2】►如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、Eco RⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。
下列说法错误的是()。
A．图示过程是基因工程的核心步骤B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠC．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构解析 图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤。
构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ。
抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞。
基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。
答案B,基因工程操作程序及与蛋白质工程的比较高考地位：5年24考 （2011江苏、山东、四川、海南，2010天津、四川……） 基因工程技术生产凝乳酶的过程1．基因工程的操作程序分析 (1)目的基因的获取途径①从自然界中已有的物种中分离出来，如从基因组文库或cDNA 文库中获取。
②人工合成目的基因常用的方法有反转录法和化学合成法。
③利用PCR技术扩增目的基因通过PCR 技术可对已获取的目的基因进行扩增，以获取大量的目的基因。
(2)基因表达载体的构建提醒 ①插入的目的基因的表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入基因部位之前需有启动子，之后需有终止子。
②两次使用的限制酶为同一种酶，这样形成的黏性末端碱基之间互补，便于连接。
将目的基因插入Ti 质粒的T DNA 上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA 上→★★★本部分知识是高考的重点内容，特别是江苏卷年年都考，理综试题也多有涉及，各省对本部分内容考查要求不同，复习中应引起关注。
【典例2】►(2011·安徽)家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。
将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。
(1)进行转基因操作前，需用________酶短时处理幼蚕组织，以便获得单个细胞。
(2)为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把来自cDNA文库的干扰素基因片段正确插入表达载体的________和________之间。
(3)采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。
该PCR反应体系的主要成分应包含：扩增缓冲液(含Mg2＋)、水、4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、________和________。
(4)利用生物反应器培养家蚕细胞时，贴壁生长的细胞会产生接触抑制。
通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以________，增加培养的细胞数量，也有利于空气交换。
解析本题综合考查基因工程、细胞工程和PCR技术，意在考查考生对基础知识的理解。
胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理可以将动物组织分解成单个细胞；基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子、标记基因等，其中启动子和终止子有利于目的基因的表达，标记基因有利于目的基因的检测；PCR 技术中需要原料(4种脱氧核苷酸)、缓冲液、模板DNA 、引物和耐热DNA 聚合酶等；在生物反应器中放入多孔的中空薄壁小玻璃珠的目的：一方面有利于细胞的贴壁生长，避免接触抑制；另一方面有利于气体交换。
答案 (1)胰蛋白(或胶原蛋白) (2)启动子 终止子(3)对干扰素基因特异的DNA 引物对 Taq DNA 聚合酶 (4)扩大细胞贴壁生长的附着面积 【训练3】►(2011·南京二模)下图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程，请据图回答下列有关问题。
(1)若限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—↓GA TC —，限制酶Ⅱ识别序列和切点是—G ↓GA TCC —，那么在①过程中，应用限制酶________切割质粒，用限制酶________切割抗虫基因。
(2)将通过②过程得到的大肠杆菌涂布在含有________的培养基上，若能够生长说明已导入了普通质粒或重组质粒，反之则说明没有导入。
(3)要确定抗虫基因导入后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，则在个体水平上的鉴定过程可简述为：________。
经筛选分析，该植株细胞中含有一个携带抗虫基因的DNA 片段，因此可以把它看作是杂合子。
理论上，该转基因植株自交产生的F 1代中，仍具有抗虫特性的植株占总数的________。
(4)⑤过程所用的现代生物技术称为________，从遗传学角度来看，据细胞通过⑤过程，能形成棉植株的根本原因是细胞具有____________________。
解析 本题极易出错的部分有：在第(1)小题中没有看清目的基因插入的位置，从而不能确定用限制酶Ⅰ还是Ⅱ来切割质粒还是切割抗虫基因。
第(3)小题检测抗虫性状在个体水平上是否表达，应该让害虫吞食转基因棉花的叶片，观察害虫的存活情况，这个地方也有出错的，主要没有看清是在哪个水平上进行检测的。
在切割质粒时应遵循一个原则：不能同时将两个标记基因切开，至少保留一个，所以只能用酶Ⅱ切割，而从目的基因两侧碱基序列可知，只能用酶Ⅰ才得到含目的基因的DNA 片段。
如果导入了重组质粒，此时重组质粒中四环素抗性基因能正常表达，而氨苄青霉素抗性基因已被破坏，所以涂布在含有四环素的培养基上，能够生长的话，说明导入了重组质粒(普通质粒)。
如果把携带一个抗虫基因的DNA 片段看作杂合子，可以认为是Aa ，自交产生的F 1中仍具有抗虫特性的植株占总数的比例为34。
